阅读说明：本技术 一种利用原代肝细胞筛选甲状腺素受体激动剂的方法 (Method for screening thyroxine receptor agonist by using primary hepatocytes ) 是由 徐剑锋 于 2020-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用原代肝细胞筛选甲状腺素受体激动剂的方法。该方法为：步骤1,构建带有报告基因和甲状腺激素反应元件的载体质粒TRE-RG；步骤2,将所述载体质粒TRE-RG用腺病毒包装成TRE-luc重组腺病毒,在将此重组腺病毒感染原代肝细胞,加入待测化合物,根据报告基因的表达产物确定待测化合物是否为甲状腺素受体激动剂。本发明创造性地利用原代肝细胞本身高表达甲状腺素受体,仅需克隆一小段高度保守的甲状腺素反应元件用于构建报告基因载体,避免了克隆整个甲状腺素受体或者甲状腺素受体的配体结合区域(LBD)的基因序列的难题,同时可以应用于不同种属的原代肝细胞,增加了应用灵活性。本发明方法简单,感染效率高,克服了现有方法转染效率低,重复性差,实验稳定性差的问题。(The invention discloses a method for screening a thyroxine receptor stimulant by utilizing primary hepatocytes. The method comprises the following steps: step 1, constructing a vector plasmid TRE-RG with a reporter gene and a thyroid hormone response element; and 2, packaging the vector plasmid TRE-RG into TRE-luc recombinant adenovirus by using adenovirus, infecting primary hepatocytes with the recombinant adenovirus, adding a compound to be tested, and determining whether the compound to be tested is a thyroxine receptor agonist according to an expression product of a reporter gene. The invention creatively utilizes the height of primary hepatocytes to express the thyroxine receptor, only needs to clone a small section of highly conserved thyroxine reaction element for constructing a reporter gene vector, avoids the difficult problem of cloning the whole thyroxine receptor or the gene sequence of the Ligand Binding Domain (LBD) of the thyroxine receptor, can be applied to primary hepatocytes of different species, and increases the application flexibility. The method is simple and high in infection efficiency, and solves the problems of low transfection efficiency, poor repeatability and poor experimental stability of the existing method.)

一种利用原代肝细胞筛选甲状腺素受体激动剂的方法

技术领域

本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种利用原代肝细胞筛选甲状腺素受体激动剂的方法。

背景技术

甲状腺激素受体(TR,thyroid hormone receptor)激动剂在一系列代谢类疾病中具有很大的治疗潜力，其应用领域包括但不限于肥胖、高脂血症、甲状腺疾病、酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝脏脂肪变性、肝纤维化、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(HeFH/HoFH)、x相关性肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)、糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、抑郁症、骨质疏松、心律失常、充血性心力衰竭等疾病。但是早期的甲状腺激素受体激动剂由于在心血管系统和骨骼系统的副作用而阻碍了其临床开发。近年来，肝脏靶向性的甲状腺激素受体激动剂如MGL3196、VK2809等，已经在治疗NASH和高胆固醇血症的临床实验中证明了甲状腺激素受体激动剂的有益治疗作用，如降低低密度脂蛋白和升高高密度脂蛋白，促进胆固醇向胆汁酸的代谢，降低甘油三酯，同时避免了甲状腺激素对心脏功能(心动过速、脑卒中体积增加、心脏指数增加、心肌肥厚、外周血管阻力下降、脉压升高)和骨骼系统(骨质疏松症)的副作用，证明这种药物研发方案是可行的和具有巨大潜力的。因此，筛选具有肝脏选择性的甲状腺激素受体激动剂对于这一类药物的开发至关重要。

现有技术中对甲状腺激素受体激动剂的筛选体系主要有HEK293瞬时转染甲状腺素受体的细胞筛药体系和HEK293稳转甲状腺素受体的细胞筛药体系。外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；常规的病毒法前期准备较复杂、而且可能对细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法将外源基因如甲状腺素受体基因的质粒转入HEK293细胞中，利用细胞内机制表达甲状腺素受体。普通的瞬转甲状腺素受体，通常是转染效率低，重复性差，实验稳定性差，很多细胞系很难成功转染，而且常用的脂质体转染试剂毒性较大，而且转染条件如脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基血清的含量等，都需要通过多次实验摸索来优化和提高转染效率。HEK293稳转甲状腺素受体的细胞体系是在HEK293瞬时转染甲状腺素受体的细胞体系的基础上，挑选转染后能稳定遗传甲状腺素受体基因，并且不会随着细胞培养代数增加快速丢失的单细胞，让其快速增殖以满足药物筛选需求的方法。稳转甲状腺素受体系统建立周期长，而且HEK293细胞是一种非肝脏细胞系，如果筛选肝脏选择性药物，不能模拟肝脏细胞特异的转运体和代谢功能。

本发明中缩略语和关键术语定义：

TR,throid hormone receptor甲状腺素受体

TRE,Throid Hormone Responseelements甲状腺素反应元件

NAFLD，non-alcoholic fatty liver disease，非酒精性脂肪肝病

NASH，Non alcoholic steatohepatitis，非酒精性脂肪肝炎

HeFH/HoFH，Heterozygous/Homozygous Familial Hypercholesterolemia杂合/纯合家族性高胆固醇血症

X-ALD，X-linked adrenoleukodystrophy X-连锁肾上腺脑白质营养不良LBD，ligand binding domain配体结合区域

PCR,Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应

Luc，luciferase荧光素酶

Beetle luciferin甲虫荧光素

AMP,adenosine monophosphate腺苷一磷酸

发明内容

本发明的目的是，提供一种利用原代肝细胞筛选甲状腺素受体激动剂的方法。主要解决现有技术中筛选体系转染效率低，成本高，不能模拟肝脏细胞特异的转运体和代谢功能的问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种利用原代肝细胞筛选甲状腺素受体激动剂的方法，该方法为：

步骤1，构建带有报告基因和甲状腺激素反应元件的载体质粒TRE-RG；

步骤2，所述载体质粒TRE-RG用腺病毒包装成TRE-luc重组腺病毒，再将得到的重组腺病毒感染原代肝细胞，加入待测化合物，根据报告基因的表达产物与底物的化学反应产生的化学发光信号来确定待测化合物是否为甲状腺素受体激动剂以及其激动活性强弱。

作为优选实施方案，所述报告基因为荧光素酶报告基因，或者绿色荧光蛋白基因。

作为优选实施方案，所述甲状腺激素反应元件的序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选实施方案，所述甲状腺激素反应元件的序列可采用如下任一序列或者以下任一序列1～10次的重复和组合：

(1)同向重复序列:5-AGGTCANNNNAGGTCA-3；

(2)回文序列:5-AGGTCATGACCT-3；

(3)反向回文序列:5-TGACCTNNNNNNAGGTCA-3；

所述序列中的N表示A、T、G、C其中任意一种。

本发明采用4个同向重复的TRE序列进行串联获得SEQ ID NO.1所示的序列构建载体质粒TRE-RG，所述甲状腺激素反应元件可采用上述任一序列进行替代或者上述序列1-10次的重复和组合，这里的重复和组合可以是其中一种序列进行重复组合，也可以是一种序列和其他序列进行的组合。

作为优选实施方案，TRE-luc重组腺病毒的组装方法为：将载体质粒TRE-RG与病毒骨架质粒共转入293系列细胞进行组装获得TRE-luc重组转染病毒。

作为优选实施方案，所述293系列细胞为293细胞、HEK293A细胞、HEK293T细胞，以及其他用于包装腺病毒，慢病毒，或腺相关病毒的细胞系。

作为优选实施方案，所述重组转染病毒为重组腺病毒、重组慢病毒，或重组腺相关病毒。

作为优选实施方案，所述原代肝细胞为大鼠原代肝细胞、小鼠原代肝细胞、人原代肝细胞、豚鼠原代肝细胞、狗原代肝细胞、猪原代肝细胞、兔原代肝细胞或猴子原代肝细胞。

作为具体实施方案，本发明提供了一种在大鼠原代肝细胞上基于荧光素酶报告基因系统的筛选甲状腺素受体激动剂的方法。该方法首先构建一个带有荧光素酶报告基因和甲状腺素反应元件(TRE)的载体质粒，然后将此载体质粒与病毒骨架质粒共转入293细胞进行组装获得重组腺病毒，将此组装好的带有荧光素酶报告基因和甲状腺素反应元件的病毒，感染大鼠原代肝细胞，通过荧光素酶luciferase和底物荧光素beetle luciferin反应，用酶标仪检测化学发光的信号，即可反映待筛选化合物激活甲状腺素受体的情况。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1，本发明创造性地利用原代肝细胞本身高表达甲状腺素受体，仅需克隆一小段高度保守的甲状腺素反应元件用于构建报告基因载体，避免了克隆整个甲状腺素受体或者甲状腺素受体的配体结合区域(LBD)的基因序列的难题，同时可以应用于不同种属的原代肝细胞，增加了应用灵活性。

2，本发明方法采用腺病毒感染，方法简单，感染效率高，克服了现有方法转染效率低，重复性差，实验稳定性差的问题。

3，本发明方法在大鼠原代肝细胞水平上，可以高通量、快速高效的评价化合物的甲状腺素受体的激活情况，步骤简单，稳定性好。

附图说明

图1是本发明中不同浓度的T3和MGL3196对腺病毒载体感染的大鼠原代肝细胞的剂量效应活性示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

甲状腺素受体与视色素受体(RXR)形成异二聚体，通过与甲状腺素反应元件(TRE)和各种核共激活物(coactivators)和核共抑制物(corepressors)的相互作用来调节基因表达。甲状腺素受体与RXR形成异二聚体，结合在目标基因启动子区的甲状腺素反应元件(TREs)位置，当甲状腺素受体没有和T3(T3是甲状腺素受体的活化型内源性配体)结合的时候，就会招募共抑制转录蛋白HDAC3,TBL1,NcoR/SMART形成的复合物结合，抑制下游基因的转录，处在静息状态。当甲状腺素受体与T3配体结合后，就会招募核共激活物(coactivators)SRC-1/p160，CBP/p300，TRAPs，与RXR一起形成复合体，激活下游基因的转录。本发明在TRE之后连接luciferase的报告基因，当T3或者T3的类似物如候选化合物和肝原代细胞共孵育时，候选化合物与甲状腺素受体结合，而后转录被激活，luciferase就会被转录和表达出来，当加入luciferase的底物luciferin后，luciferase在镁离子存在的情况下，利用细胞内的ATP和O₂，催化luciferin反应生成Oxyluciferin，AMP，PPi，CO₂，产生生物化学发光现象，从而可以用酶标仪检测luminescence的光强度来衡量甲状腺素受体的激活情况。

实施例1甲状腺激素反应元件和荧光素酶报告基因的载体质粒TRE-luc的构建

pHBAD-EF1-MCS-3flag-CMV-LUC-△loxp载体(购于上海汉恒生物，目录号HBAD-1016)用XbaI/NheI双酶切，载体酶切完成后用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)回收。合成包含甲状腺激素反应元件的以及荧光素酶报告基因启动子的序列(如SEQ ID NO.2所示)，即SEQ ID NO.2所示的序列包含SEQ ID NO.1序列以及报告基因启动子序列两部分。将合成的片段PCR扩增，然后将该序列直接克隆至pHBAD-EF1-MCS-3flag-CMV-LUC-△loxp空载体上。使用感受态细胞DH5a，CaCl₂法转化，平板氨苄霉素(ampicillin)抗性挑菌，37℃，250转/分钟摇菌，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序，与目的序列比对，结果序列一致即构建完成，获得TRE-luc载体质粒。

实施例2重组腺病毒载体的组装

待293细胞生长至底面积的70～80％时，将制备的TRE-luc载体质粒与骨架质粒pHBAd-BHG，用LipofiterTM转染试剂进行转染。转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒，在液氮及37℃水浴反复冻融三次，3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为TRE-luc第一代毒种(P1)，将作为随后大量病毒扩增的毒种。以后每代的病毒扩增及收毒都如此重复进行，扩增获得大量的TRE-luc重组病毒，通过两步CsCl超速离心法纯化后，应用透析法进一步纯化，即每次用200×体积的透析缓冲液，透析三次，间隔一小时换一次液，透析结束后，采用改进的TCID50法感染性滴度检测，滴度满足需求即可分装，在﹣80℃保存备用。

实施例3病毒侵染大鼠原代肝细胞及甲状腺素受体激动剂的筛选实验

用D-Hanks液及胶原酶消化液分两步原位活体灌注5～10周龄SD大鼠的肝脏，分离细胞经低速离心(50×g,5min)和Percoll梯度离心后获得纯化的肝细胞，90％以上活率的肝细胞用于接下来的实验。

将大鼠原代肝细胞计数，稀释至细胞数量400,000/mL的细胞液，取50ul接种在胶原蛋白预先包被的96孔板中，37℃,5％CO₂培养至少1h。稀释50或者100MOI实施例2制备的TRE-luc重组腺病毒和16μg/mL聚凝胺(Sigma#107689)的混合液，用此混合液分别稀释8个浓度梯度的待测化合物T3和MGL3196(T3是天然的甲状腺受体激动剂，MGL3196是在3期临床实验中使用的肝脏靶向性甲状腺受体激动剂)。将含有重组腺病毒和待测化合物的混合液，以50ul/孔加入，1000g离心15min，37℃,5％CO₂培养过夜，24h时，加入25μL/孔的Steady-Glo荧光素酶检测试剂(Promega公司，货号为E2520)，摇床摇10min，通过多功能酶标仪检测化学发光(luminescence)的强度。

待测化合物的活性计算：设定T3最大浓度2000nM的甲状腺受体激动效果为100％，即待测化合物相对T3的活性＝100％×(待测化合物读值-空白DMSO的读值)/(T3的最大浓度2000nM读值-空白DMSO读值)，并根据四参数逻辑曲线拟合，得到其最大效应(Emax)和半数最大效应浓度(EC50)。参见图1：其中图1为不同浓度的T3和MGL3196对腺病毒载体感染的大鼠原代肝细胞的剂量效应活性示意图。通过图1的数据结果可以看出：随着T3和MGL3196处理浓度的增加，荧光素酶与底物反应的相对化学发光信号的百分比也相应提高。这种作用有剂量依赖关系，其Emax和EC50参见表1。

表1

化合物	EC50(nM)	Emax(％)
			T3	7.5	100
MGL3196	727.7	77

从以上数据可知：T3和MGL3196的处理能够导致报告基因luciferase的表达，两者均能在腺病毒载体感染的大鼠原代肝细胞中对报告基因的产生剂量依赖性的上调。因此可通过报告基因luciferase的表达量来确定待测化合物是否为甲状腺素受体激动剂，不仅可以实现对甲状腺素受体激动剂的筛选，还可以对待测化合物激动甲状腺素受体的活性排序，筛选出最强活性的肝细胞选择性的甲状腺素受体激动剂。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 上海诚益生物科技有限公司

<120> 一种利用原代肝细胞筛选甲状腺素受体激动剂的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggtcacttc aggtcatcta cgtaactgat gtaggtcact tcaggtcatc tacgtaactg 60

atgtaggtca cttcaggtca tctacgtaac tgatgtaggt cacttcaggt catctacgta 120

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<210> 2

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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