具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明进行进一步的说明。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细菌、细胞和质粒

实验所用菌：大肠杆菌，存放于-80℃冰箱中。

实验所用细胞：使用HEK293T细胞，培养于细胞房培养箱中。

实验所用质粒：pEGFP-C1、ISRE、pRL-TK购自上海碧云天生物技术有限公司；pEGFP-C1-Ss-SOCS1a、pEGFP-C1-Ss-SOCS1b购自武汉淼灵生物科技有限公司。

1.1.2 实验仪器与设备

恒温箱、培养瓶、传代室超净工作台、光学显微镜、荧光倒置显微镜、多功能酶标仪、超微量核酸蛋白测定仪（NanoDrop）、电泳仪、核酸凝胶观察仪、质粒提取试剂盒中相关仪器、1.5 ml离心管、0.2 ml离心管、培养板、各类型移液枪若干。

1.1.3 实验试剂

双抗、PBS胎牛血清、基本培养基、胰酶消化液、质粒提取试剂盒中相关试剂、xfect转染试剂、质粒转染buffer、poly（I:C）、IFN-γ、细胞裂解液、萤火虫荧光素酶检测试剂、Dual-Glo Stop & Glo Buffer。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

配置完全培养基需要的试剂及用量：400 µl双抗、4 ml胎牛血清、35.6 ml基本培养基。每次配置的量为40 ml，保存在-20℃中。

传代培养：原代培养2~4天后，当观察到培养瓶中细胞密度达到80%~90%，培养基的颜色呈淡黄色时，便可进行传代。传代时要将需要的工具事先放入超净工作台中，用紫外线进形杀菌消毒30 min左右，用70%酒精擦拭桌面，实验使用的培养基和胰酶消化液要提前解冻，可放入恒温箱中加快解冻速度。将废物桶、生物危险废物桶和立器盒放置在附近。将原代细胞从培养箱中取出，首先在显微镜下观察细胞形态。此时的细胞应该紧贴培养瓶底部生长，形状呈不规则状。在超净工作台中进行操作时，身体高度要适宜，应提前佩戴口罩，切忌对着超净工作台说话或者呼气，切勿朝着超净工作台呼吸或谈话。

物品放入超净工作台时提前进行酒精消毒，试剂、移液枪枪头、细胞培养瓶只能在超净工作台中酒精灯灯焰附近打开。打开培养瓶，直接将营养液弃掉。往培养瓶加入3 ml的PBS，轻微旋转震荡瓶身，目的是使所有的细胞都能够被PBS浸润，完全浸润后，用移液枪吸取PBS，弃掉。加入400 µl胰酶消化液，充分浸润细胞，轻轻拍打瓶身，使贴附在瓶壁上的细胞全部脱落，此时在显微镜下观察，可看到细胞的形态呈游离态，晃动瓶身时，细胞会跟随晃动而流动，若依旧有细胞贴附在壁上，可继续轻轻拍打瓶身。整个消化时间大概在3~5min，大于5min，消化液会对细胞造成损伤。等肉眼观察到瓶底细胞大致脱落，在显微镜下观察，发现细胞呈现游离状态，且没有大团细胞，此时加入5 ml培养液终止消化，吸取一部分到新的培养瓶中，具体吸取的体积要随着细胞密度不同而改变，要保证传代的培养瓶中细胞浓度在30%左右。传代结束后，要把剩余的试剂进行瓶口消毒后再盖上瓶盖，用封口膜封口，放回-20℃进行保存，超净工作台喷洒70%酒精并擦拭干净，细胞放回恒温箱，恒温箱内应适量摆放细胞培养瓶，保持均匀的瓶间距，确保恒温箱内的空气自由流通。

更换培养基：更换培养基的大致步骤与传代培养的步骤大致相同。对实验所用器材进行紫外消毒30min，提前对完全培养基和胰酶消化液进行解冻。观察培养瓶中细胞状态后，接着将培养基倒掉，加入400 µl胰酶消化液，完全浸润细胞，待到肉眼能够明显看到细胞脱落且没有大块细胞时，在显微镜下观察细胞是否处于游离状态，如果存在少量细胞依旧贴附在瓶壁上，可轻轻拍打瓶身，使细胞完全脱落。用移液枪将一部分脱落的细胞吸取出来弃掉，保持瓶内细胞密度在30%左右。加入5 ml完全培养基，此时消化停止，保证细胞在培养液中均匀分布，可用移液枪来回吹打。放入培养箱中继续培养。实验结束后完全培养基与消化液放入-20℃冰箱进行保存，超净工作台喷洒70%酒精并擦拭干净。

1.2.2质粒提取

所用菌液中的大肠杆菌内含有构建好的质粒，菌液保存在-80℃的环境中，将其取出，在摇床内摇菌，使菌液复苏。这个过程需要12 h的时间。

要提取的质粒为pEGFP-C1、ISRE、pRL-TK、pEGFP-C1-Ss-SOCS1a、pEGFP-C1-Ss-SOCS1b，每种菌液摇好后的分装到四个2ml离心管中，每个离心管中含有2 ml菌液，分别命名为1、2、3、4、5，使用质粒提取试剂盒提取质粒。

将1、2、3、4、5五个离心管在全速离心下离心20秒，尽量将上清液全部去除，目的 是收集菌体；

每管加入250 µl的溶液P1，利用移液枪来回吹打菌体沉淀使菌体重悬，溶液中 菌体是否重悬与实验提取质粒的浓度和纯度密切相关；

在每管加入250 µl的P2溶液，加入后温和的将整个离心管来回倒转，大概8次， 动作要轻，防止基因组DNA断裂，上下翻转的目的依旧是使菌体裂解完全，接着在室温下放 置2~3分钟，不能超过5分钟，否则会破坏质粒结构，等到菌液变得清亮粘稠时，进行下一个 项目；

准备250 µl预冷的溶液P3，加入到每管后，温和地上下翻转3~4次，中和完全后 的溶液中会出现黄色的絮状沉淀，溶液呈现黄色；

上述中和裂解物在冰上孵育5 min，在16000 g下离心5 min；

转移所有离心管中的上清液到干净的离心管中，注意不可触碰到下方黄色沉 淀；

在上述每个离心管中加入275 µl的质粒结合液，盖上盖子后，上下温和转8次左 右使液体混匀；

把2号柱P套在2 ml的收集管上，将步骤的的混合液倒入柱内，在5000g下离 心1min，弃废液；

加入800 µl的质粒洗涤液1，在5000 g下离心1 min，弃废液；

加入800 µl的质粒洗涤液2，其中质粒洗涤液2在加入时要提前加入无水乙醇， 在5000 g下离心2 min，弃废液；

再加入200 µl的质粒洗涤液2，在5000 g下离心1min，弃废液；

在12000 g条件下空转2 min，去除残留乙醇；

在65℃水浴锅中准备好质粒DNA洗脱液，将2号柱P并提前套在干净的1.5 ml离 心管上，添加25 µl质粒DNA洗脱液到柱基质上，23℃下静置2 min，在12000 g下离心1 min；

将内毒素去除柱套在干净的1.5 ml离心管内，将步骤中洗脱下来的质粒DNA 全部加到去除柱内，室温下放置2 min后，在5000 g下离心1min，洗脱无内毒素的质粒DNA。 得到的质粒为去除内毒素的质粒，会提高后续的转染效率。

使用超微量核酸蛋白测定仪（NanoDrop），测定抽提的质粒的浓度，测得质粒浓度参见表1 ，对提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳后得到的结果见图1：

表提取的各质粒浓度

1.2.3 细胞铺板

待培养细胞密度达到50%左右时进行铺板步骤。

使用消化液将贴附在瓶壁上生长的细胞消化下来，此时细胞呈游离状态，均匀的分部在培养瓶内，加入8 ml培养基停止消化，用移液枪吸取含有游离细胞的培养基，加到24孔的培养板中，根据后期实验设计，选取培养板中A1~C6的孔，加入培养基，显微镜下观察发现细胞浓度在40%~50%，放入培养箱培养一夜。

1.2.4 转染

转染前更换细胞培养板中的培养液。将实验分为对照组跟实验组，其中有对照组一组，实验组两组，每组再设置三个平行实验。根据提取的质粒浓度与细胞铺板时每个孔中培养基的量，计算每个孔中应加入的质粒的含量如下：

对照组每孔准备buffer 25 µl，pEGFP-C1质粒3µl，ISRE质粒2 µl，pRL-TK质粒0.2µl，在0.2ml离心管中混匀，加入0.3 µl xfet，静置10~15 min；

实验组1每个孔准备buffer 25 µl，SOCS1a质粒3 µl，ISRE质粒2 µl，pRL-TK质粒0.2 µl，在0.2ml离心管中混匀，加入0.3 µl xfet，静置10~15 min；

实验组2每孔准备buffer 25 µl，SOCS1b质粒3 µl，ISRE质粒2 µl，pRL-TK质粒0.2µl，在0.2 ml离心管中混匀，加入0.3 µl xfet，静置10~15min。

将离心管用锡纸包裹，防止试剂遇光失效，带入细胞房前喷洒酒精进行消毒。

1.2.5 双荧光素酶报告基因系统检测

转染12h后，每个孔加入poly（I:C）10 µl，继续培养12 h。

加入poly（I:C）刺激的细胞培养12h后，使用荧光倒置显微镜，观察转染效率。提前准备细胞裂解液与萤火虫荧光素检测试剂混合液，观察结束后，每个孔加入160 µl，使细胞破碎，同时启动萤火虫荧光，待到孔中无絮状物，在摇床上摇晃15min，多功能酶标仪只能检测96孔的培养板，因此要先将溶液转移到96孔中，再放入多功能酶标仪中测量萤火虫发光，得出数据。

从多功能酶标仪中取出培养板，取80µl的Dual-Glo Stop & Glo Buffer加入到各个孔中，在摇床上摇晃15min，再次在多功能酶标仪下测量海肾发光，测得数据。

用IFN-γ替代poly（I:C），根据配置的IFN-γ溶液浓度10 µg/ml，认为每孔加入8µl比较合适，加入后培养12h，重复上述步骤。

1.3 结果与分析

1.3.1 荧光倒置显微镜下观察转染效率

在荧光倒置显微镜上观察细胞转染效率，拍摄对比图片，以poly（I:C）为刺激物进行实验，在荧光倒置显微镜下拍摄得到的荧光照片如图2-4所示，以IFN-γ为刺激物进行实验，在荧光倒置显微镜下拍摄得到的荧光照片如图5-7所示。

通过照片叠合部位，可以大致判断转染实验的转染效率。本实验中细胞转染效率大概在60%~70%，转染后发现，在pEGFP-C1-Ss-SOCS1a与pEGFP-C1-Ss-SOCS1b实验组中，不论是以poly（I:C）作为刺激物还是IFNG作为刺激物，转染成功的细胞的细胞核位置出现空洞，这也说明Ss-SOCS1的蛋白表达部位在细胞质中。

1.3.2 多功能酶标仪测定荧光强度

poly(I:C)刺激转染细胞，转染目的基因质粒的细胞与空白对照组细胞的相对荧光强度参见表2和图8：

表 2 poly（I:C）刺激下转染各质粒细胞的相对荧光强度

IFN-γ刺激细胞转染目的基因质粒细胞与空白对照组细胞的相对荧光强度参加表3和图9：

表3 IFN-γ刺激下转染各质粒细胞的相对荧光强度

通过对比可以看出，对照组的相对荧光强度远远高于实验组，说明SOCS1对于ISRE的活性具有抑制作用。当刺激物不同，SOCS1对于ISRE的抑制程度也不同，使用IFN-γ作为刺激物抑制效果更为明显。同属于SOCS1家族，SOCS1a与SOCS1b也存在差异，在poly(I:C）作为刺激物时，SOCS1a的抑制效果要强于SOCS1b，而使用IFN-γ时，SOCS1b的抑制效果强于SOCS1a。

综上，许氏鲆鮋SOCS1能够明显抑制poly（I:C）或IFN-γ诱导的ISRE活性，表明许氏鲆鮋SOCS1对干扰素信号通路有负调控作用。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。