新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法
阅读说明：本技术 新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法 (Non-diagnostic evaluation method for invasion capability of new coronavirus envelope protein mutant ) 是由 李星霖 陈丹瑛 赵学森 刘永梅 邱雅若 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本申请提供了一种新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法,其中使用了基于HIV/Luc报告载体的假病毒以及跨膜丝氨酸蛋白酶瞬时转染的稳定表达人ACE2受体的细胞。本发明还提供了相应假病毒产品及其应用。(The present application provides a non-diagnostic evaluation method of the invasive ability of a novel mutant of the envelope protein of a coronavirus, wherein pseudoviruses based on an HIV/Luc reporter vector and cells stably expressing the human ACE2 receptor transiently transfected by transmembrane serine protease are used. The invention also provides a corresponding pseudovirus product and application thereof.)
技术领域
本申请属于微生物领域，具体地，属于病毒感染研究领域。本申请提供了一种新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法。
背景技术
SARS-CoV-2的包膜蛋白S蛋白介导病毒吸附和侵入细胞的过程，是影响新冠病毒侵入能力的主要因素。在新冠病毒流行期间，已经出现多种包膜蛋白突变毒株，其中D614G株在2020年3月出现，目前已成为主要流行株，有研究证明该突变株传播能力较之前更强；此外在2020年9月于英国出现的英国超级株也显示出更强的传播能力；在不同新冠肺炎患者的标本中可以发现多种不同的新型冠状病毒包膜突变体。虽然评估病毒侵入能力最直接的方法是使用活病毒的感染试验或空斑形成试验，但首先不同新冠病毒包膜突变体的来源较为分散，难以获得研究所需的突变体活病毒；其次活病毒的操作必须在BSL-3实验室中进行；另外,活病毒在扩增和传代过程中易发生基因突变且培养条件和结果判读标准的不同，不同实验室的活病毒检测结果常常存在较大差异。
因此，提供一种操作简单、安全、准确的新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力评价方法对新冠病毒的研究、疾控和个体诊断都有重要的意义。
发明内容
SARS-CoV-2活病毒应用于相关分析试验中存在种种局限，本发明建立了一种基于HIV/Luc报告载体的假病毒检测系统，用于研究SARS-CoV-2包膜蛋白不同突变体侵入靶细胞能力，操作相对安全，检测结果更加稳定。将经过密码子优化的C末端缺失19个氨基酸的S蛋白插入假病毒颗粒中，产生的假病毒将以与活病毒相同的方式进入细胞。
本研究中构建的假病毒可用于评价所有新冠病毒包膜蛋白突变体侵入细胞的能力，并且可以进一步用于评价中和抗体以及针对S蛋白设计的小分子药物在阻止病毒进入细胞方面的效果等的以病毒侵入靶细胞过程为对象的研究。本研究通过将HIV/Luc骨架质粒与不同S蛋白突变体表达质粒共转染293T细胞以制备假病毒，同时用跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)瞬时转染的稳定表达人ACE2受体的T-REx293细胞作为靶细胞评价假病毒进入的水平。TMPRSS2是一种定位于细胞表面的蛋白酶，在病毒入侵过程中对冠状病毒的S蛋白进行切割而预激活，促进其进入靶细胞。本研究中构建的假病毒带有荧光素酶报告基因，可以通过荧光测定仪精确地检测报告基因的表达,实现病毒的定量检测。通过替换不同的S蛋白突变体表达质粒，即可研究不同S蛋白突变体侵入能力，该假病毒检测系统还可以用于研究病毒的组织嗜性和受体识别方式、中和抗体对不同突变体作用变化以及针对S蛋白作用的小分子抗病毒药物的效果。
本申请新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力评价技术的实现包括：1.基于HIV/Luc骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒单轮感染系统建立；2.人ACE2(hACE2)受体诱导表达靶细胞T-REx 293-hACE2的构建；3.通过在靶细胞T-REx 293-hACE2中同时表达TMPRSS2，对SARS-CoV-2假病毒预激活从而提高其感染量；
一方面，本申请提供了一种新冠病毒包膜蛋白突变体侵入能力非诊断评价方法，其中使用了基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒。
进一步地，所述基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒是通过将HIV/Luc骨架质粒与不同S蛋白突变体表达质粒共转染来制备的。
进一步地，共转染的对象为293T细胞。
进一步地，所述HIV/Luc骨架质粒为pNL4-3.Luc.R-E-。
进一步地，所述方法中还使用了稳定表达人ACE2受体的T-REx 293细胞作为靶细胞。
进一步地，所述靶细胞以跨膜丝氨酸蛋白酶瞬时转染。
另一方面，本申请提供了一种基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒。
进一步地，所述基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒是通过将HIV/Luc骨架质粒与不同S蛋白突变体表达质粒共转染293T细胞来制备的。
进一步地，所述HIV/Luc骨架质粒为pNL4-3.Luc.R-E-。
另一方面，本申请提供了上述假病毒在制备包膜蛋白突变体侵入能力研究试剂组中的应用。
本申请的方法和假病毒可用于诊断或非诊断用途，优选地，用于新冠病毒相关科学研究，疾控数据统计和研判等非诊断用途。
本申请中的S蛋白、S蛋白突变体可以为自样本中分离的蛋白或者人工表达制备的蛋白；pNL4-3.Luc.R-E-有市售产品，也可以根据相关文献构建。
附图说明
图1为HIV/Luc报告基因结构及基于HIV/Luc报告载体的假病毒包装示意图；
图2为假病毒滴度测定示意图，周围一圈用250μl DMEM或无菌水液封，以便减少“边缘效应”的影响。B11-G11为细胞对照孔，B2-G10为倍比稀释孔；
图3为表达hACE2和TMPRSS2的T-REx 293靶细胞感染平台和病毒侵入系统构建示意图；
图4为SARS-CoV-2病毒进入宿主细胞的检测。其中上图为假病毒侵入实验荧光显微镜观察结果(该假病毒系统带有EGFP报告基因，可用荧光显微镜检测)：Tet+表示加入四环素，Tet-表示未加四环素；表达hACE2受体和TMPRSS2的T-REx 293细胞可以有效支持SARS-CoV和SARS-CoV-2假病毒的侵入，却不能支持MERS-CoV假病毒侵入；下图为三种假病毒侵入效率的直方图。
图5为本申请的评价方法用于评价多种S蛋白突变体时的结果图。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
实施例1基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒单轮感染系统的构建
(1)S蛋白表达质粒的构建：
S蛋白作为SARS-CoV-2的包膜蛋白，在293T细胞中的表达水平较低，因此在不改变SARS-CoV-2(MN908947)S蛋白氨基酸序列的前提下，我们进行了密码子优化，删去N末端17个氨基酸和C末端19个氨基酸，随后在此基础上设计各种S蛋白突变(包括P26H、H146Q、R246E+S247N、V407L、N422K、L452Q、E471K、V483F、G485V、Q493H、Q498H、Y505C、L518V、D614G、R682G、R682H、R685G、R685H、A694D、A771V、I1130L)，将序列克隆至pSecTag2/HygroA载体，进行扩增、纯化。
(2)将包含S蛋白的真核表达质粒与Env缺失的、带有荧光素酶报告基因的骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞，获得重组假病毒，具体方法如下：
a)293T细胞接种6孔细胞培养皿，过夜培养后汇合度达到80％，转染前将培养皿中各孔中的含10％FBS的DMEM培养基补至4ml。
b)将S蛋白突变体的表达质粒1μg和骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-3μg按照1：3(w/w)的比例加入含有400μl无抗生素无血清DMEM培养基的1.5ml离心管中混匀。
c)加入6μl Turbofect转染试剂(DNA与转染试剂1:3，w/v)，混匀后室温静置20min。将质粒-转染试剂混合液全部逐滴加入6孔细胞培养皿中，轻摇混匀。置于37℃，CO2培养箱培养。
d)24h后用含10％FBS的DMEM培养基替换培养皿中原有的4ml培养基，之后分别收集48h和72h的病毒液，每次收取病毒液之后向培养基中补充相同体积的培养基，共可获得8ml病毒原液，3000rpm离心5分钟，上清经0.45μm无菌滤器过滤，用1.5ml离心管分装后冻存于-80℃冰箱保存备用。
HIV/Luc报告基因结构及基于HIV/Luc报告载体的假病毒包装如图1所示。
(3)假病毒滴度测定(测试方法如图2所示)
将转染了pCAGGS-TMPRSS2的稳定表达hACE2的T-REx 293-hACE2细胞接种至96孔板，经终浓度为1μg/ml的四环素诱导24h后，对待测SARS-CoV-2S蛋白突变体假病毒进行滴定。首先对病毒原液进行10倍稀释，然后进行3倍比连续稀释，共9个梯度(稀释度范围：1:10-1:65610)，每个梯度设置6个复孔；同时设置无假病毒的细胞对照；外围一圈孔用250μl培养基封液，防止边缘培养基蒸发等因素影响试验结果。于37℃，5％CO2培养箱孵育48-72h，弃去全部培养基，每孔加入30μl细胞裂解液裂解细胞，室温孵育10分钟后每孔加入50μl荧光素酶底物进行化学发光检测。根据Reed-Muench法计算假病毒的50％组织培养感染剂量(TCID50)。
实施例2hACE2受体诱导表达系统的建立和鉴定(基本过程如图3所示)
(1)SARS-CoV-2假病毒感染靶细胞T-REx 293-hACE2+TMPRSS2
在hACE2受体的N末端引入myc标签，然后将其克隆至诱导表达载体pCDNA5，便于后续的表达鉴定。建立表达ACE2的人胚肾293细胞系(T-REx 293-ACE2)，利用四环素诱导ACE2的表达。通过控制四环素浓度，可间接调控ACE2的表达水平。在ACE2受体诱导表达的同时瞬时表达TMPRSS2蛋白酶，从而对SARS-CoV-2病毒预激活，以提高其感染能力。
(2)hACE2受体诱导表达系统的鉴定
T-REx 293-ACE2细胞用四环素(终浓度1μg/ml)处理24h后，裂解细胞提取总蛋白，通过Western Blot法利用N末端加入的myc标签鉴定hACE2受体分子的表达。
实施例3SARS-CoV-2S蛋白假病毒体外感染模型的建立以及假病毒侵入实验(图4)
(1)T-REx 293-hACE2诱导表达细胞在转染TMPRSS2前一天接种至6孔板，使得细胞在转染时丰度约80％。
(2)转染pCAGGS-TMPRSS2质粒4μg至6孔板中的T-REx 293-hACE2细胞，转染24h后，接种至96孔细胞培养板；次日，利用四环素诱导表达hACE2受体；四环素(终浓度1μg/ml)诱导24h后，将假病毒配制成每100μl含1000TCID50的感染剂量，感染时每孔加入100μl感染剂量的病毒液，每种突变体假病毒可设置3-6个副孔，感染后48-72h检测细胞的荧光素酶活性。
实施例4利用该技术评价SARS-CoV-2S蛋白突变体D614G等21种突变体侵入能力变化
以S蛋白P26H、H146Q、R246E+S247N、V407L、N422K、L452Q、E471K、V483F、G485V、Q493H、Q498H、Y505C、L518V、D614G、R682G、R682H、R685G、R685H、A694D、A771V、I1130L突变体为例，利用该技术评价其侵入宿主细胞的能力相对于SARS-CoV-2参考株假病毒侵入细胞能力的变化。
方法：(1)包含SARS-CoV-2假病毒及其突变株制备如前面所述。将1μgpCAGGS-SARS-CoV-2S和3μg pNL4-3.Luc.R-E-质粒共转染293T细胞，收获转染后48h和72h病毒上清，离心去除细胞碎片，通过0.45μm无菌膜过滤、分装，并测定TCID50。(2)SARS-CoV-2S蛋白突变体假病毒侵入宿主细胞能力试验：T-REx 293-hACE2细胞铺于6孔板中，转染pCAGGS-TMPRSS2质粒，转染后24h按照2×104个/孔接种至96孔板，待其贴壁后每孔加入终浓度1μg/ml的四环素，诱导24h使其表达hACE2。含1000TCID50假病毒的100μl病毒液转移至预铺靶细胞的96孔细胞板中。于37℃ CO2培养箱再培养48-72h。弃去上清，每孔加入30μl细胞裂解液，室温孵育10min后，每孔加入荧光素酶底物50μl，使用GloMax96微孔板发光仪(Promega)测定荧光素酶活性。以参考株的侵入活性为基准，评估了不同S蛋白突变体侵入细胞的能力(如图5所示)。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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