具体实施方式

本发明旨在提供一种病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法，尤其是提供一种SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法，并基于该筛选方法提供一种快速筛选SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明人参考以下原理：IL1β蛋白前体在细胞中会发生聚集沉淀，必须经过蛋白酶CASPASE1的剪切，才能释放出C端可溶的IL1，构建了一个IL1β蛋白前体和Gussia荧光素酶(Gluc)串联表达的融合载体，如图1所示，表达的两个蛋白之间以3C蛋白酶的酶切位点相连接，当细胞中没有3C蛋白酶时，融合蛋白会发生聚集沉淀，而当3C蛋白酶剪切IL1β与Gussia荧光素酶之间的酶切位点后，将释放出活化可溶的Gussia荧光素酶，因此通过荧光(化学发光)信号强度的高低，就可以表征3C蛋白酶的活性，本发明构建的可以表征3C蛋白酶活性的体系也属于本发明的内容。为了筛选SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制剂，获得一种表达具有较高活性的3C蛋白酶的表达载体是关键，本发明人利用SARS-COV-2冠状病毒的两个序列NSP7和NSP8编码的蛋白长度较小，且边界的酶切位点与3C蛋白酶的酶切位点同源性高的特点，构建获得一种可以表达具有较高3C蛋白酶活性的表达载体，用于对3C蛋白酶活性的抑制剂进行筛选。

以下以筛选SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制剂的方法为例，对本发明进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用序列由上海生工有限公司合成。

实施例1：SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性测定体系的构建

该实施例构建了一个含有SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶酶切位点的融合蛋白作为SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶的底物，如图1所示，该底物包含了IL1β蛋白-3C酶切位点(3C酶切位点的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示)-Gussia荧光素酶(Gluc)，即IL1β蛋白和Gussia荧光素酶通过3C酶切位点连接，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，具体的构建方法为：

合成包含表达IL1β蛋白-SARS-CoV-2冠状病毒3C酶切位点-Gussia荧光素酶的基因序列，并将该基因序列克隆至载体pCDNA3.1(Thermo Fisher Scientific)上，获得表达3C蛋白酶的底物的表达载体，命名为表达载体S1，该表达载体S1的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，质粒图谱如图2所示。将该表达载体S1转染HEK 293T细胞，表达获得的融合蛋白可以作为SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶的底物，将用于以下实施例中测定3C蛋白酶的活性。

如果在表达载体S1进行表达时，体系中没有3C蛋白酶剪切表达的融合蛋白，那么融合蛋白将发生聚集沉淀而失活；当存在3C蛋白酶对表达的融合蛋白进行剪切时，荧光素酶得以活化，因此可以通过读取荧光信号的强度变化表征3C蛋白酶的活性，进而根据3C蛋白酶的活性筛选抑制3C蛋白酶活性的抑制剂。因此可以基于该实施例获得的表达载体S1提供一种测定SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的试剂盒，该试剂盒中包括表达载体S1，当使用该试剂盒时，可以将表达载体S1与SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶的表达载体共转染HEK 293T细胞共表达，通过读取共表达体系中荧光信号强度来表征3C蛋白酶的活性。

实施例2：在体外具有活性的SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶的表达

SARS-CoV-2冠状病毒入侵人体之后，以自身RNA为模板翻译合成含有多个蛋白的多聚蛋白体，只有在具有活性的3C蛋白酶酶切后，才能剪切为独立的有活性的蛋白进行后续的复制和组装。然而，现有技术中表达的SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶，通常其蛋白酶活性非常低，甚至没有活性，因此就需要对其表达结构进行针对性设计，使得表达的3C蛋白酶能够发生自剪切和二聚化，以获得其生物功能，提高蛋白酶的活性。

该实施例为了提高表达的SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的活性，在3C蛋白酶表达序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)的5’和3’端分别连接SARS-COV-2冠状病毒的NSP7(其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和NSP8(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)序列，且在连接处插入了3C蛋白酶的酶切位点的表达序列，构建获得一重组表达序列，该重组表达序列可以促进3C蛋白酶在表达后完成自剪切和二聚化，进而成为具有生物功能的活化蛋白。将该重组表达序列克隆至真核表达载体pCDNA3.1后，获得表达具有较高生物活性的SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的表达载体，命名为表达载体C1，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:7所示，如图3所示，示出了该表达载体C1的质粒图谱。同时合成单独的3C蛋白酶表达序列，并克隆到真核表达载体pCDNA3.1作为阴性对照，命名为表达载体C2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。

为了验证该实施例获得的表达载体C1确实能够获得具有较高活性的3C蛋白酶，将HEK293T细胞重悬至1×10⁵个细胞/ml，以100μl每孔铺板于96孔板中，8小时后进行DNA转染；每孔转入150ng DNA，其中包含了50ng的来自表达载体S1的质粒(S1质粒)和梯度稀释的来自表达载体C1和C2的质粒(0ng、25ng、50ng、100ng，C1/C2质粒)，不足的DNA用pCDNA3.1空载体补齐。具体转染操作为：准备10μl的Opti-MEM(Gibco)培养基加入相应的DNA后，混匀，加入DNA质量3倍的lipofiter转染试剂(Hanbio，上海)，室温静置10分钟后，滴加入96孔板中，于5％CO₂培养箱中培养24小时后，每孔加入15μl的Renilla-glo试剂(Promega)，反应5分钟后，读取荧光值。

结果如图4所示，可见，将该实施例构建的表达载体C1转染HEK 293T细胞后表达的3C蛋白酶能够呈质量依赖性的剪切由表达载体S1表达的底物，即加入的表达载体C1越多，剪切的底物越多，荧光信号强度越高(荧光值越大)，显著高于同等转染量的C2质粒剪切底物后的荧光值，证明表达载体C1表达的3C蛋白酶的活性远远高于表达载体C2表达的3C蛋白酶的活性，经计算，由C1表达的3C蛋白酶的酶切活性约为由C2表达的3C蛋白酶的酶切活性的1000倍。

实施例3：SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选

该实施例利用上述实施例1构建的表达载体S1和实施例2构建的表达载体C1对SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制剂进行筛选，具体包括以下操作：

3.1、将HEK 293T细胞铺于10厘米的细胞培养皿内，密度达到75％时进行转染。

3.2、将表达3C蛋白酶的C1载体3μg和表达3C蛋白酶的底物的S1载体6μg混合，加入1ml的Opti-MEM培养基中，混匀，之后加入27μl转染试剂lipofiter，吹吸混匀，室温静置10分钟，滴加入HEK 293T细胞进行蛋白表达。转染8小时后，利用0.25％胰酶对细胞进行消化，并离心重悬，稀释至1×10⁵个细胞/ml。

3.3、分别将梯度稀释(0.0、3.0、10.0、30.0μM)的溶于DMSO的化合物(阿比朵尔(Arbidol)、洛匹那韦(lopinavir)、那非那韦(nelfinavir)和羟氯喹(Hydroxychloroquine)(均购自MedChemExpress)，其中阿比朵尔和洛匹那韦作为阳性药物(Zhen Zhu等，Arbidol monotherapy is superior to lopinavir/ritonavir intreating COVID-19，Journal of Infection，doi:10.1016/j.jinf.2020.03.060；BodeeNutho等，Why Are Lopinavir and Ritonavir Effective against the Newly EmergedCoronavirus 2019？Atomistic Insights into the Inhibitory Mechanisms，Biochemistry，2020.04.15，doi:10.1021/acs.biochem.0c00160)，那非那韦和羟氯喹作为候选化合物)按体积比为1:1000加入细胞重悬液，随后每孔100μl铺至96孔培养板，继续于5％CO₂的37℃培养箱中培养16个小时；将96孔培养板取出，加入15μl Renilla Gloreagent(Promega)，室温孵育5分钟，读取荧光值。同时设置不加细胞的空白培养基的空白对照和不加候选化合物或阳性药物的阴性对照，在扣除空白对照孔的读值后，分别通过各自的荧光值计算每种候选化合物或阳性药物在梯度浓度下的3C蛋白酶的相对活性。结果如图5所示，为上述两种候选化合物和两种阳性药物在不同浓度下的3C蛋白酶的相对活性，可见两种阳性药物均表现出对SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制效果，并且呈现剂量依赖性，即在一定浓度范围内，阳性药物的浓度越高，对3C蛋白酶的活性抑制作用越强。另外两种候选化合物中那非那韦未表现出对SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制，而羟氯喹表现出能够抑制SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶的活性，并且同两种阳性药物一样，呈现出剂量依赖性，因此，可以选择羟氯喹作为制备抗SARS-COV-2冠状病毒感染的药物的候选化合物。

3.4、按照以上操作，使用梯度浓度为0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100μM的羟氯喹对C1载体和S1载体在HEK 293T细胞中的共表达体系进行处理，同时设置不加细胞的空白培养基的空白对照和不加羟氯喹的阴性对照，在扣除空白对照孔的读值后，分别通过各自的荧光值计算每种浓度下对3C蛋白酶的抑制率。结果如图6所示，为梯度稀释浓度的羟氯喹对SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制曲线，经计算，羟氯喹抑制SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的半数抑制浓度IC₅₀约为30nM。

综上实施例的描述，本发明构建一种能够测定3C蛋白酶活性的体系，并构建一种表达具有较高活性的3C蛋白酶的载体，两者可以组合作为筛选SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的试剂盒，即该试剂盒中包括表达3C蛋白酶的底物的S1载体和表达具有活性的3C蛋白酶的C1载体，两者可以用于快速筛选出SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性的抑制剂，对于抗SARS-COV-2冠状病毒感染的药物的开发提供了重要的数据支撑。

以上实施例仅仅描述了SARS-COV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法，由于在单正链RNA病毒中均存在3C蛋白酶，并且各自能够识别特异的酶切位点，因此可以根据上述实施例的描述构建单正链RNA病毒各自的测定3C蛋白酶活性的体系以及表达各自的具有活性的3C蛋白酶的表达载体，均可以用于筛选各自病毒的3C蛋白酶活性的抑制剂，用于抗病毒药物的开发。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院合肥物质科学研究院

合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司

<120> SARS-CoV-2冠状病毒3C蛋白酶活性抑制剂的筛选方法及筛选试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ala Val Leu Gln Ser Gly Phe Arg

1 5

<210> 2

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Val Pro Glu Leu Asn Cys Glu Met Pro Pro Phe Asp Ser

1 5 10 15

Asp Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Gln Lys Met Lys

20 25 30

Gly Cys Phe Gln Thr Phe Asp Leu Gly Cys Pro Asp Glu Ser Ile Gln

35 40 45

Leu Gln Ile Ser Gln Gln His Ile Asn Lys Ser Phe Arg Gln Ala Val

50 55 60

Ser Leu Ile Val Ala Val Glu Lys Leu Trp Gln Leu Pro Val Ser Phe

65 70 75 80

Pro Trp Thr Phe Gln Asp Glu Asp Met Ser Thr Phe Phe Ser Phe Ile

85 90 95

Phe Glu Glu Glu Pro Ile Leu Cys Asp Ser Trp Asp Asp Asp Asp Asn

100 105 110

Leu Leu Val Cys Asp Val Pro Ile Arg Gln Leu His Tyr Arg Leu Arg

115 120 125

Asp Glu Gln Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser Asp Pro Tyr Glu Leu Lys

130 135 140

Ala Leu His Leu Asn Gly Gln Asn Ile Asn Gln Gln Val Ile Phe Ser

145 150 155 160

Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Pro Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala

165 170 175

Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp

180 185 190

Gly Thr Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro

195 200 205

Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Val Lys

210 215 220

Ser Lys Val Glu Phe Glu Ser Ala Glu Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser

225 230 235 240

Thr Ser Gln Ala Glu His Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Ser Gly

245 250 255

Gln Asp Ile Ile Asp Phe Thr Met Glu Ser Val Ser Ser Ser Ala Val

260 265 270

Leu Gln Ser Gly Phe Arg Glu Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp

275 280 285

Phe Asn Ile Val Ala Val Ala Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp

290 295 300

Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu

305 310 315 320

Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys

325 330 335

Leu Ile Cys Leu Ser His Ile Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe

340 345 350

Ile Pro Gly Arg Cys His Thr Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln

355 360 365

Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe

370 375 380

Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys

385 390 395 400

Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys

405 410 415

Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala

420 425 430

Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp

435 440 445

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

450 455

<210> 3

<211> 6761

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccgaattc gccaccatgg caactgttcc 960

tgaactcaac tgtgaaatgc caccttttga cagtgatgag aatgacctgt tctttgaagt 1020

tgacggaccc caaaagatga agggctgctt ccaaaccttt gacctgggct gtcctgatga 1080

gagcatccag cttcaaatct cgcagcagca catcaacaag agcttcaggc aggcagtatc 1140

actcattgtg gctgtggaga agctgtggca gctacctgtg tctttcccgt ggaccttcca 1200

ggatgaggac atgagcacct tcttttcctt catctttgaa gaagagccca tcctctgtga 1260

ctcatgggat gatgatgata acctgttagt ctgcgatgta cccattagac aactgcacta 1320

caggctccga gatgaacaac aaaaaagcct cgtgctgtcg gacccatatg agctgaaagc 1380

tctccacctc aatggacaga atatcaacca acaagtgata ttctccatga gctttgtaca 1440

aggagaacca agcaacgaca aaatacctgt ggccttgggc ctcaaaggaa agaatctata 1500

cctgtcctgt gtaatgaaag acggcacacc caccctgcag ctggagagtg tggatcccaa 1560

gcaataccca aagaagaaga tggaaaaacg gtttgtcttc aacaagatag aagtcaagag 1620

caaagtggag tttgagtctg cagagttccc caactggtac atcagcacct cacaagcaga 1680

gcacaagcct gtcttcctgg gaaacaacag tggtcaggac ataattgact tcaccatgga 1740

atccgtgtct tcctcagctg ttttgcagag tggttttaga gaggccaagc ccaccgagaa 1800

caacgaagac ttcaacatcg tggccgtggc cagcaacttc gcgaccacgg atctcgatgc 1860

tgaccgcggg aagttgcccg gcaagaagct gccgctcgag gtgctcaaag agatggaagc 1920

caatgcccgg aaagctggct gcaccagggg ctgtctgatc tgcctgtccc acatcaagtg 1980

cacgcccaag atgaagaagt tcatcccagg acgctgccac acctacgaag gcgacaaaga 2040

gtccgcacag ggcggcatag gcgaggcgat cgtcgacatt cctgagattc ctgggttcaa 2100

ggacttggag cccatggagc agttcatcgc acaggtcgat ctgtgtgtgg actgcacaac 2160

tggctgcctc aaagggcttg ccaacgtgca gtgttctgac ctgctcaaga agtggctgcc 2220

gcaacgctgt gcgacctttg ccagcaagat ccagggccag gtggacaaga tcaagggggc 2280

cggtggtgac gattacaagg atgacgacga taagtgagtt aactctagag ggcccgttta 2340

aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 2400

ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 2460

ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 2520

ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 2580

tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg 2640

tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 2700

cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 2760

ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 2820

gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 2880

atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 2940

ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 3000

gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta 3060

attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 3120

agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc 3180

ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc 3240

ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 3300

tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct ctgcctctga gctattccag 3360

aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt 3420

atatccattt tcggatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 3480

gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 3540

gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 3600

ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 3660

gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 3720

actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 3780

tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 3840

acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 3900

cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 3960

ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc 4020

gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 4080

ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 4140

acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 4200

ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 4260

tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 4320

atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 4380

ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact 4440

tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 4500

aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 4560

atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 4620

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 4680

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 4740

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 4800

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 4860

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 4920

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 4980

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 5040

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 5100

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 5160

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 5220

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 5280

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 5340

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 5400

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 5460

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 5520

gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 5580

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 5640

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 5700

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 5760

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 5820

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 5880

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 5940

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 6000

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 6060

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 6120

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 6180

aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 6240

cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 6300

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 6360

gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 6420

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 6480

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 6540

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 6600

cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 6660

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 6720

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt c 6761

<210> 4

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtggtttta gaaaaatggc attcccatct ggtaaagttg agggttgtat ggtacaagta 60

acttgtggta caactacact taacggtctt tggcttgatg acgtagttta ctgtccaaga 120

catgtgatct gcacctctga agacatgctt aaccctaatt atgaagattt actcattcgt 180

aagtctaatc ataatttctt ggtacaggct ggtaatgttc aactcagggt tattggacat 240

tctatgcaaa attgtgtact taagcttaag gttgatacag ccaatcctaa gacacctaag 300

tataagtttg ttcgcattca accaggacag actttttcag tgttagcttg ttacaatggt 360

tcaccatctg gtgtttacca atgtgctatg aggcccaatt tcactattaa gggttcattc 420

cttaatggtt catgtggtag tgttggtttt aacatagatt atgactgtgt ctctttttgt 480

tacatgcacc atatggaatt accaactgga gttcatgctg gcacagactt agaaggtaac 540

ttttatggac cttttgttga caggcaaaca gcacaagcag ctggtacgga cacaactatt 600

acagttaatg ttttagcttg gttgtacgct gctgttataa atggagacag gtggtttctc 660

aatcgattta ccacaactct taatgacttt aaccttgtgg ctatgaagta caattatgaa 720

cctctaacac aagaccatgt tgacatacta ggacctcttt ctgctcaaac tggaattgcc 780

gttttagata tgtgtgcttc attaaaagaa ttactgcaaa atggtatgaa tggacgtacc 840

atattgggta gtgctttatt agaagatgaa tttacacctt ttgatgttgt tagacaatgc 900

tcaggtgtta ctttccaa 918

<210> 5

<211> 237

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtctaaaa tgtcagatgt aaagtgcaca tcagtagtct tactctcagt tttgcaacaa 60

ctcagagtag aatcatcatc taaattgtgg gctcaatgtg tccagttaca caatgacatt 120

ctcttagcta aagatactac tgaagccttt gaaaaaatgg tttcactact ttctgttttg 180

ctttccatgc agggtgctgt agacataaac aagctttgtg aagaaatgct ggacaac 237

<210> 6

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagtttagtt cccttccatc atatgcagct tttgctactg ctcaagaagc ttatgagcag 60

gctgttgcta atggtgattc tgaagttgtt cttaaaaagt tgaagaagtc tttgaatgtg 120

gctaaatctg aatttgaccg tgatgcagcc atgcaacgta agttggaaaa gatggctgat 180

caagctatga cccaaatgta taaacaggct agatctgagg acaagagggc aaaagttact 240

agtgctatgc agacaatgct tttcactatg cttagaaagt tggataatga tgcactcaac 300

aacattatca acaatgcaag agatggttgt gttcccttga acataatacc tcttacaaca 360

gcagccaaac taatggttgt cataccagac tataacacat ataaaaatac gtgtgatggt 420

acaacattta cttatgcatc agcattgtgg gaaatccaac aggttgtaga tgcagatagt 480

aaaattgttc aacttagtga aattagtatg gacaattcac ctaatttagc atggcctctt 540

attgtaacag ctttaagggc caattctgct gtcaaattac ag 582

<210> 7

<211> 1770

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtctaaaa tgtcagatgt aaagtgcaca tcagtagtct tactctcagt tttgcaacaa 60

ctcagagtag aatcatcatc taaattgtgg gctcaatgtg tccagttaca caatgacatt 120

ctcttagcta aagatactac tgaagccttt gaaaaaatgg tttcactact ttctgttttg 180

ctttccatgc agggtgctgt agacataaac aagctttgtg aagaaatgct ggacaactca 240

gctgttttgc agagtggttt tagaaaaatg gcattcccat ctggtaaagt tgagggttgt 300

atggtacaag taacttgtgg tacaactaca cttaacggtc tttggcttga tgacgtagtt 360

tactgtccaa gacatgtgat ctgcacctct gaagacatgc ttaaccctaa ttatgaagat 420

ttactcattc gtaagtctaa tcataatttc ttggtacagg ctggtaatgt tcaactcagg 480

gttattggac attctatgca aaattgtgta cttaagctta aggttgatac agccaatcct 540

aagacaccta agtataagtt tgttcgcatt caaccaggac agactttttc agtgttagct 600

tgttacaatg gttcaccatc tggtgtttac caatgtgcta tgaggcccaa tttcactatt 660

aagggttcat tccttaatgg ttcatgtggt agtgttggtt ttaacataga ttatgactgt 720

gtctcttttt gttacatgca ccatatggaa ttaccaactg gagttcatgc tggcacagac 780

ttagaaggta acttttatgg accttttgtt gacaggcaaa cagcacaagc agctggtacg 840

gacacaacta ttacagttaa tgttttagct tggttgtacg ctgctgttat aaatggagac 900

aggtggtttc tcaatcgatt taccacaact cttaatgact ttaaccttgt ggctatgaag 960

tacaattatg aacctctaac acaagaccat gttgacatac taggacctct ttctgctcaa 1020

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aatggacgta ccatattggg tagtgcttta ttagaagatg aatttacacc ttttgatgtt 1140

gttagacaat gctcaggtgt tactttccaa agtgcagtga aaagagagtt tagttccctt 1200

ccatcatatg cagcttttgc tactgctcaa gaagcttatg agcaggctgt tgctaatggt 1260

gattctgaag ttgttcttaa aaagttgaag aagtctttga atgtggctaa atctgaattt 1320

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atgtataaac aggctagatc tgaggacaag agggcaaaag ttactagtgc tatgcagaca 1440

atgcttttca ctatgcttag aaagttggat aatgatgcac tcaacaacat tatcaacaat 1500

gcaagagatg gttgtgttcc cttgaacata atacctctta caacagcagc caaactaatg 1560

gttgtcatac cagactataa cacatataaa aatacgtgtg atggtacaac atttacttat 1620

gcatcagcat tgtgggaaat ccaacaggtt gtagatgcag atagtaaaat tgttcaactt 1680

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<210> 8

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagtggtt ttagaaaaat ggcattccca tctggtaaag ttgagggttg tatggtacaa 60

gtaacttgtg gtacaactac acttaacggt ctttggcttg atgacgtagt ttactgtcca 120

agacatgtga tctgcacctc tgaagacatg cttaacccta attatgaaga tttactcatt 180

cgtaagtcta atcataattt cttggtacag gctggtaatg ttcaactcag ggttattgga 240

cattctatgc aaaattgtgt acttaagctt aaggttgata cagccaatcc taagacacct 300

aagtataagt ttgttcgcat tcaaccagga cagacttttt cagtgttagc ttgttacaat 360

ggttcaccat ctggtgttta ccaatgtgct atgaggccca atttcactat taagggttca 420

ttccttaatg gttcatgtgg tagtgttggt tttaacatag attatgactg tgtctctttt 480

tgttacatgc accatatgga attaccaact ggagttcatg ctggcacaga cttagaaggt 540

aacttttatg gaccttttgt tgacaggcaa acagcacaag cagctggtac ggacacaact 600

attacagtta atgttttagc ttggttgtac gctgctgtta taaatggaga caggtggttt 660

ctcaatcgat ttaccacaac tcttaatgac tttaaccttg tggctatgaa gtacaattat 720

gaacctctaa cacaagacca tgttgacata ctaggacctc tttctgctca aactggaatt 780

gccgttttag atatgtgtgc ttcattaaaa gaattactgc aaaatggtat gaatggacgt 840

accatattgg gtagtgcttt attagaagat gaatttacac cttttgatgt tgttagacaa 900

tgctcaggtg ttactttcca a 921