一种具有防污染能力的crispr核酸检测方法
阅读说明：本技术 一种具有防污染能力的crispr核酸检测方法 (CRISPR nucleic acid detection method with anti-pollution capacity ) 是由 吴坚 钱程 于 2019-03-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种具有防污染能力的CRISPR核酸检测方法,利用Cas蛋白对由UUUN(N为任意碱基)碱基簇组成的PAM位点进行特异性识别,进而对含有尿嘧啶(U碱基)的DNA双链进行检测。本发明的技术方案,可以安全快速、低成本、简单高效、防污染地进行检测,在检测过程中彻底避免气溶胶污染的问题。(The invention provides a CRISPR nucleic acid detection method with anti-pollution capacity, which is characterized in that a PAM site consisting of UUN (N is any base) base clusters is specifically identified by using a Cas protein, and then a DNA double strand containing uracil (U base) is detected. The technical scheme of the invention can carry out detection safely, quickly, simply, efficiently and in an anti-pollution manner with low cost, and thoroughly avoid the problem of aerosol pollution in the detection process.)
技术领域
本发明属于核酸检测领域，其具体涉及利用CRISPR技术对靶标核酸进行特异性检测，且可防止核酸气溶胶污染的方法。
背景技术
在核酸检测领域，为了提高灵敏度以及准确性，常常需要对待检测的目标核酸片段进行大量扩增，以便于后续的实验分析。目前，较为成熟的核酸扩增方法主要以聚合酶链式反应(PCR)技术为主。PCR技术作为核酸检测的黄金标准，已被广泛应用于医学诊断、农产品质量检测、食品安全检查等众多领域。传统的PCR扩增技术是建立在三个反应温度以及一定循环数上的重复反应。一般而言，PCR扩增的每个循环需要涉及到三个不同反应温度以及相应适宜的时间。三个反应温度分别对应PCR反应的三个阶段，分别为变性阶段(95℃)、退火(55℃～65℃)、延伸(72℃)。目前，由于受到一些因素的制约，基于PCR的核酸扩增检测相对来说需要耗费较长的时间，通常需要2小时以上。另外，由于模板的特殊性和扩增酶的不同特性，还可选择性的调整三个阶段的持续时间，以及可以在起反应始和结尾加入预变性和延伸阶段。对于PCR反应而言，最关键的是要满足每个阶段的温度要求，因此这就需要对温控十分精细的热循环装置，并且还要求它兼有快速升降温的功能，以减少反应的整体时间。从这一点来说，受到仪器和反应时长等因素的限制，PCR技术在现场快速检测领域的应用有非常大的局限性。
为了克服PCR技术的局限性，近些年来，一些等温扩增技术也被陆续开发出来。等温扩增技术最大的特点就是可以在一个恒定的且相对较低的温度下进行反应，这就大大摆脱了PCR技术对于温度控制仪器的要求。诸如像环介导的等温扩增技术(LAMP)、重组酶扩增技术(RPA)等恒温扩增技术都可以实现在较快的时间(通常在30分钟左右)完成对目标核酸片段的大量扩增，实现了从仪器到时间的节省，非常具有现场快速检测的应用前景。
另外，对于核酸扩增产物的检测，最为传统且经典的方法即是基于凝胶电泳的方法，这种检测方法虽然可靠性很高但是也存在着很多弊端。凝胶电泳用到的化学品有较大的毒性对人体易造成较大危害。最关键的是，进行凝胶电泳需要对扩增反应液进行开盖取样，由于之前的扩增反应会使得扩增子在反应管内大量积累，一旦开盖，大量的扩增子就会溢出反应管，弥散在空气中，形成气溶胶污染，且核酸在室内正常环境下是十分稳定的不易降解，这就会对之后很长一段时间内的检测结果造成干扰。在核酸检测领域，气溶胶污染是要极力避免的。目前，除了凝胶电泳之外，使用较多的则是实时荧光的检测方法，该方法一般是利用到DNA双链荧光嵌入剂，如SYTO 9、SYBR Green I、Eva Green等，利用实时荧光PCR仪对反应的整个过程中荧光数值的大小来进行记录进而间接表征核酸扩增情况。为了提高检测的特异性，也有一些分子探针被开发出来，如水解探针(Taqman探针)、杂交探针(分子信标)、复合探针等。它们在核酸扩增的过程中利用碱基互补配对的原则与模板进行互补配对，从而实现对核酸扩增进行特异性实时检测。但这些利用探针的检测方法，通常需要较复杂的实时荧光PCR仪来读取数据，因此成本较高，耗时较长，无法实地展开，在推广上受到了限制。
近几年来，基于CRISPR体系的基因编辑方法被逐渐开发起来。这个方法目前多数的研究主要是利用它的靶向切割功能而用于定点的碱基编辑编辑上。最近，随着type V酶的开发，开始有研究人员将该体系应用到核酸检测上。其主要原理是由于type V酶可在体系中guide RNA的辅助下，特异性的识别靶标DNA，同时，在识别靶标物的过程中会激活自身的基因编辑功能，可以对体系中的任意单链DNA进行切割。目前已有的利用CRISPR体系来进行核酸检测的方法普遍需要复杂、大型的仪器进行荧光读取和结果判定，对于实验的环境和操作均有一定的要求。此外，CRISPR体系中针对DNA编辑的Cas12a蛋白需要特异性的识别目标片段中的TTTN(N为任意碱基)序列才能进行工作，这就对于扩增目标的选择有了要求。虽然，利用CRISPR技术可以在一定程度上改进核酸扩增的检测过程，但由于其对目标片段的要求，以及仍然无法避免气溶胶的污染，仍然有很大的改进空间。
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有防污染能力的CRISPR核酸检测方法。为此，本发明采用以下技术方案：
一种具有防污染能力的CRISPR核酸检测方法，其特征在于：利用Cas蛋白对由UUUN(N为任意碱基)碱基簇组成的PAM位点进行特异性识别，进而对含有尿嘧啶(U碱基)的DNA双链进行检测。
本发明所涉及到的是具有防污染能力的CRISPR核酸检测方法，其具体涉及到含有UDG酶的防污染核酸扩增体系、CRISPR检测体系；先用含有UDG酶的防污染体系消解反应环境中可能存在的残留污染扩增子，再进行核酸扩增反应，然后用CRISPR体系进行检测。
本发明所提出的检测对象可以是动植物病毒、致病菌、基因突变等靶标核酸的诊断。
在核酸扩增体系中，本发明用dUTP组分代替传统的dTTP组分作为核酸扩增的原料，使得在不断积累的扩增子产物中不再存在T碱基，而是以U碱基替代；并且在核酸扩增体系中添加UDG酶，利用UDG酶(购买自New England Biolabs inc.,货号M0372)可以对这些含有U碱基的扩增子进行消解，从而防止扩增子便不会再造成气溶胶的污染，避免对之后的检测造成假阳性的干扰。之后，由于后续的PCR反应的温度会达到98℃，而该UDG酶在50℃即可被灭活，因此不会对后续进行的扩增反应造成影响。
在核酸扩增体系中，含有dUTP的组分的选择范围包括dATP、dGTP、dCTP、dUTP。含有dUTP的组分在核酸扩增体系中的浓度为0.1～20mM。
在核酸扩增体系中，含有dUTP的组分及其在核酸扩增体系中的浓度可以为0.1～20mM dATP、0.1～20mM dGTP、0.1～20mM dCTP、0.1～20mM dUTP；优选地，组分及其在核酸扩增体系中的浓度可以为1～10mM dATP、1～10mM dGTP、1～10mM dCTP、1～10mM dUTP；更优选地，组分及其在核酸扩增体系中的浓度可以为2～5mM dATP、2～5mM dGTP、2～5mMdCTP、2～5mM dUTP；更优选地，其组分以2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dUTP提供。且这四种组分的浓度不要求相同。
本发明中用于消解残留的污染扩增子的UDG酶，可以以0.0001U～1U提供，优选地，可以以0.0005U～0.5U提供，更优选地，可以以0.001U～0.5U提供，更优选地，可以以0.01U～0.5U提供。
本发明中，在核酸扩增体系中，用dUTP组分代替传统的dTTP组分作为扩增的原料，使得在不断积累的扩增子序列中不再存在胸腺嘧啶(T碱基)，而是以尿嘧啶(U碱基)替代。这种含有U碱基的扩增子，可以被UDG酶消解，在消解后就不会对后续的实验造成影响引起假阳性的干扰也不会引起气溶胶污染。上述核酸扩增体系可以是PCR扩增体系，也可以是核酸等温扩增体系，如：LAMP反应。
在CRISPR检测体系中，所用到的Cas蛋白被发现可以识别目标双链中序列为TTTN(N为任意碱基)的PAM结构，但发明人发现，将T碱基换成U碱基后，所使用的Cas蛋白仍能成功的对由TTTN替换成的UUUN碱基簇进行特异性识别，并与crRNA形成复合体后对单链探针进行切割，释放出荧光信号可以直接肉眼观察或者通过仪器判读。并且含有U碱基的双链可以被UDG酶消解，防止污染。
本发明中所涉及到的Cas蛋白为Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白。Cas12a蛋白包括但不限于LBCas12a蛋白或者其余的Cas12a系列蛋白。
CRISPR检测体系由crRNA、Cas蛋白、单链荧光探针和相应缓冲液组成。
采用本发明的技术方案，可以安全快速、低成本、简单高效、防污染地进行检测，在检测过程中彻底避免气溶胶污染的问题。
附图说明：
图1为本发明在实施例1下的实际检测结果图。通过荧光读取装置，可以检测到阳性样本(图中标号1)有非常高的荧光值，而阴性样本(图中标号2)则是没有荧光的。可以说明，当靶标核酸链中的TTTN序列簇被UUUN序列替代后，CRISPR体系仍能很好的工作，Cas蛋白仍然可以对靶标核酸链进行识别，在与crRNA形成复合体后，即可激活对单链的切割功能，对单链荧光探针进行切割。荧光探针被切割后会释放出荧光信号，这种信号可以通过机器判读或者直接进行肉眼观察检测。当进行肉眼观察检测时，从附图1中的1号曲线可以看出，在5min左右的时间下，所积累的荧光值已经足够高，可以被肉眼直接观察到。
图2为本发明在实施例1下的LAMP反应扩增曲线图。通过荧光读取装置，可以检测到阳性样本(图中标号3)有非常高的荧光值，而阴性样本(图中标号4)则是没有荧光的。可以说明在用dUTP代替dTTP后，LAMP反应仍可以很好的进行，有较好的Ct值和荧光积累。
图3为本发明在实施例1下，对LAMP反应的扩增产物进行溶解曲线的验证。通过荧光读取装置，可以发现，阳性样本(图中标号5)在理想温度下有很明显的峰，这可以说明，在将dTTP替换成dUTP后，LAMP反应仍对目标片段进行了非常高效的特异性扩增。而隐形样本(图中标号6)则没有任何特征峰被观察到。
具体实施方案：
为更清晰的对本发明的内容进行解释和阐述，下面将给出几个具体的实施例方案。后文中所描述的实施例为本发明的部分实施例，而非全部。基于本发明开展的实施例，以及在该领域的其他工作人员在没有获得创造性成果的前提下而取得的其他实施例都属于本发明的保护范围。
本发明是经过反复的研究和实验，通过对Cas蛋白切割体系的深入理解，开发出的一种新型的CRISPR工作体系。对于基于此开发体系所开展的研究或者实施例都属于本发明的保护范围。
在CRISPR体系中，一般包含组分为Cas蛋白(如Cas12a蛋白等)，crRNA，荧光探针(probe)，RNA酶抑制剂等。Cas蛋白的工作浓度范围为0.2μM至2.0μM；crRNA序列(gRNA)的工作浓度高于Cas12a蛋白酶的浓度；单链DNA荧光探针的工作浓度介于0.5μM至8.0μM。Cas蛋白可采用Cas12a蛋白或者有与Cas12a蛋白的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；其中，工作浓度是指上述各组分在CRISPR体系与含有扩增子的核酸扩增反应液混合后的体系中的最终浓度。在不开盖检测的情况下，核酸扩增子的体积可视为核酸扩增反应液的体积，核酸扩增反应液的体积与CRISPR体系的体积应介于1：20至2：1。
在CRISPR体系结合PCR/LAMP扩增反应的检测体系中，可以在核酸扩增体系中加入UDG酶，在进行核酸扩增反应前对不必要的扩增子或是残留的气溶胶污染进行消解，以达到防污染的目的。
在CRISPR体系结合PCR/LAMP扩增反应的检测体系中，将混合后的反应液进行短时间的孵育并用紫外灯等简易光源直接照射，即可肉眼判断检测结果，或者也可以用荧光仪器观察记录。一般的，孵育时间为3至20分钟，优选地，孵育时间为5至15分钟，更优选地，孵育时间在8至12分钟。能够大幅缩短检测时间，实现快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查。
在快速PCR体系中，DNA聚合酶的浓度范围为4U至30U，且在一定范围内，聚合酶浓度越高，扩增效率越高。优选地，DNA聚合酶的浓度范围以12U至24U提供，更优选地，DNA聚合酶的浓度范围以15U至20U提供。
在快速PCR体系中，引物的浓度以不低于标准PCR扩增体系中的引物浓度提供。相同条件下，引物浓度越高，扩增效率越高。优选地，引物的浓度范围以0.2μM至8.0μM的浓度提供。更优选地，引物以0.6μM至4.0μM提供。更优选地，引物浓度以0.8μM至2.0μM范围提供。
在三温度的快速PCR体系中，每个循环中包含变性、退火、延伸三个温度步骤。在双温度快速PCR扩增体系中，将退火和延伸两个步骤合并，使之在相同温度下进行。对于变性温度，优选地，提供88℃至98℃的温度范围。优选地，提供94℃至98℃的温度范围。对于退火温度，以不高于引物的Tm值温度为上限给出。优选地，退火温度的范围以48℃至65℃提供。更优选地，退火温度介于55℃至62℃。若采用三温度体系，可将延伸温度以65℃至72℃的范围给出。
在快速PCR扩增体系中，优选地，每个循环时间在35s的时间内完成。更优选地，每个循环的时间在20s内完成。更优选地，每个循环的时间在9s内完成。
在快速PCR体系中，对于扩增子的选择，一般应小于300bp，优选地扩增子应小于200bp，更优选地，扩增子的长度应小于100bp。
在LAMP体系中，Bst 2.0DNA聚合酶的浓度范围为5U至32U，且在一定范围内，聚合酶浓度越高，扩增效率越高。优选地，DNA聚合酶的浓度范围以12U至24U提供，更优选地，DNA聚合酶的浓度范围以16U至18U提供。
在LAMP体系中，相同条件下，引物浓度越高，扩增效率越高。优选地，FIP/BIP引物的浓度范围以0.8μM至3.0μM的浓度提供。更优选地，引物以1.2μM至2.4μM提供。更优选地，引物浓度以1.5μM至2.0μM范围提供。
在LAMP体系中，相同条件下，引物浓度越高，扩增效率越高。优选地，F3/B3引物的浓度范围以0.1μM至1.0μM的浓度提供。更优选地，引物以0.1μM至0.8μM提供。更优选地，引物浓度以0.1μM至0.4μM范围提供。
在LAMP体系中，相同条件下，引物浓度越高，扩增效率越高。优选地，环引物LF/LB引物的浓度范围以0.1μM至1.0μM的浓度提供。更优选地，引物以0.2μM至0.8μM提供。更优选地，引物浓度以0.3μM至0.6μM范围提供。
在LAMP体系中，反应温度以恒定温度进行，优选地，反应温度以61℃至69℃范围提供，优选地，反应温度以63℃至67℃范围提供，更优选地，反应温度以64℃至66℃范围提供。
此外，除了上述提到的PCR、LAMP扩增技术外，本方法还适用于其他的等温扩增后产物的检测。在其他的等温扩增中，本方法可以一样保持反应体系中扩增子和外界环节的分离，有效防止以为开盖而造成的气溶胶污染问题。
在本发明体系中，对所用的反应管、热块不作具体限定，需能保证完成正常的核酸反应即可。
实施例1，利用CRISPR体系结合LAMP扩增检测柑橘黄龙病
LAMP扩增体系：LAMP反应在25μL体积中进行，该体系中含有Bst 2.0DNA聚合酶16U，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，(NH4)2SO4 10mM，MgSO42.0mM，0.1％[email protected]，含有dUTP的混合组分1.4mM，Betaine 5.0M，UDG酶0.5U或是石蜡油40μL(约合厚度为10mm)，引物浓度分别为1.6μM，0.2μM和0.4μM。体系中的UDG酶或是石蜡油主要起到防污染作用。
其中，UDG酶可以直接添加到扩增反应液中，在进行LAMP扩增反应前先在37℃进行10min左右的污染消解，再进行LAMP扩增反应。
LAMP反应程序：63℃反应30min。
附图2表现的是用dUTP代替dTTP后，LAMP反应的实时荧光扩增曲线，可以看到，在替换后，LAMP反应对于阳性样本仍有Ct＝36的扩增，而阴性样本则没有扩增现象出现。附图3是通过溶解曲线对这一扩增结果进行判定，85℃左右的溶解峰标致着图2中阳性样本的扩增曲线确实是目标产物积累的结果。
基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系：总体积为20μL，该体系中各试剂的工作浓度为：Tris-HCl 10mM，NaCl 50mM，MgCl2 10mM，100μg/mL BSA，Cas12a 0.75μM,crRNA 1.5μM,单链DNA荧光探针2.5μM,RNA inhibitor 10U和DNA扩增子。(Cas12a购买自New EnglandBiolabs inc.,货号M0653)。
CRISPR核酸检测程序：将混合后的反应液置于37℃反应25min，之后95℃10min使酶灭活。再用紫外灯或其他简易光源照射(主要波长在365nm)照射下，用肉眼或带有简易观察装置的手机进行拍照。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。如图1，为本发明在实施例1下的实际检测结果图。通过荧光读取装置，可以检测到阳性样本(图中标号1)有非常高的荧光值，而阴性样本(图中标号2)则是没有荧光的。并且从图中曲线可以看出，在5min左右的时间下，所积累出的荧光值的已经很高，可以用于肉眼直接观察。
上述反应使用的引物序列：
F3 5’GTCCCATGCATACGCACAT 3’
B3 5’CCCCGAAATCGGACACTTC 3’
FIP 5’ACCTCCGCTGAGGCAAAGTTTTAAGGATTACGGCGAAGAGC3’
BIP 5’TCGACATTGAAACCCGCAGTCCCTCCGCATAAGCCCAAACC3’
LF 5’GACTCCGATACCTCGGTC 3’
LB 5’CTACCTTAGGCAAGGGTTG 3’
Probe 5’6-FAM-TTATT-BHQ1 3’
crRNA序列
5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-ACAUUGAUCAGUUCCACGGCA3’
扩增的模板序列：
5’CCCCGAAATCGGACACTTCGGAGTTTAAGGATTACGGCGAAGAGCAAGACTCCGATACCTCGGTCTCAAAACTTTGCCTCAGCGGAGGTGGACTCCGACGCTCTGCCGTGGAACTGATCAATGTCAAAGCTGTTTATCGACATTGAAACCCGCAGTCCTCAACCCTTGCCTAAGGTAGGGGTTTGGGCTTATGCGGAGCAGGCGGTTATCACTTTATGTGCGTATGCATGGGAC 3’
实施例2，利用CRISPR体系结合PCR扩增检测柑橘黄龙病
PCR扩增体系：PCR反应在10μL体积中进行，该体积中含有Taq HS聚合酶12.5U，Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5mM，含有dUTP的混合组分1mM，UDG酶0.5U或是石蜡油40μL(约合厚度为10mm)，引物浓度各为0.4μM(购买自大连宝生物工程有限公司，货号R007A)。体系中的UDG酶或是石蜡油主要起到防污染作用。
其中，UDG酶可以直接添加到扩增反应液中，在进行PCR扩增反应前先在37℃进行10min左右的污染消解，再进行PCR扩增反应。
PCR扩增程序：95℃热启动30s，35个循环，每个循环包括95℃的变性反应2s，55℃的退火延伸反应3s，扩增总耗时3min。
使用的引物序列：
FP 5’GTCCCATGCATACGCACAT 3’
BP 5’CCCCGAAATCGGACACTTC 3’
基于Cas12a蛋白的CRISPR反应体系：总体积为20μL，该体系中各试剂的工作浓度为：Tris-HCl 10mM，NaCl 50mM，MgCl2 10mM，100μg/mL BSA，Cas12a 0.75μM,crRNA 1.5μM,单链DNA荧光探针2.5μM,RNA inhibitor 10U和DNA扩增子。(Cas12a购买自New EnglandBiolabs inc.,货号M0653)。
CRISPR核酸检测程序：将混合后的反应液置于37℃反应25min，之后95℃10min使酶灭活。再用紫外灯或其他简易光源照射(主要波长在365nm)照射下，用肉眼或带有简易观察装置的手机进行拍照。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例3，利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病。
此实施例中，dUTP混合组分以1mM提供,其他工作条件同实施例1。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例4，利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病。
此实施例中，dUTP混合组分以2mM提供,其他工作条件同实施例1。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例5，利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病。
此实施例中，dUTP混合组分以4mM提供,其他工作条件同实施例1。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例6，利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病。
此实施例中，dUTP混合组分以10mM提供,其他工作条件同实施例1。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例7，利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病。
此实施例中，UDG酶以0.1U提供,其他工作条件同实施例1。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例8，利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病。
此实施例中，UDG酶以0.01U提供,其他工作条件同实施例1。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例9，利用CRISPR体系结合LAMP检测柑橘黄龙病。
此实施例中，UDG酶以0.001U提供,其他工作条件同实施例1。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例10，利用CRISPR体系结合PCR检测柑橘黄龙病。
此实施例中，dUTP混合组分以1mM提供,其他工作条件同实施例2。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例11，利用CRISPR体系结合PCR检测柑橘黄龙病。
此实施例中，dUTP混合组分以2mM提供,其他工作条件同实施例2。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例12，利用CRISPR体系结合PCR检测柑橘黄龙病。
此实施例中，dUTP混合组分以4mM提供,其他工作条件同实施例2。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例13，利用CRISPR体系结合PCR检测柑橘黄龙病。
此实施例中，dUTP混合组分以10mM提供,其他工作条件同实施例2。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例14，利用CRISPR体系结合PCR检测柑橘黄龙病。
此实施例中，UDG酶以0.1U提供,其他工作条件同实施例2。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例15，利用CRISPR体系结合PCR检测柑橘黄龙病。
此实施例中，UDG酶以0.01U提供,其他工作条件同实施例2。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
实施例16，利用CRISPR体系结合PCR检测柑橘黄龙病。
此实施例中，UDG酶以0.001U提供,其他工作条件同实施例2。结果显示，黄龙病菌阳性的样本呈阳性结果，阴性样本呈阴性结果。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种具有防污染能力的CRISPR核酸检测方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Candidatus liberobacter asiaticum)
<400> 1
gtcccatgca tacgcacat 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Candidatus liberobacter asiaticum)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Candidatus liberobacter asiaticum)
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acctccgctg aggcaaagtt ttaaggatta cggcgaagag c 41
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<211> 41
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Candidatus liberobacter asiaticum)
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uaauuucuac uaaguguaga uacauugauc aguuccacgg ca 42
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<212> DNA
<213> Candidatus liberobacter asiaticum
<400> 9
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<213> 人工序列(Candidatus liberobacter asiaticum)
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