一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏pcr引物组及其应用

文档序号：1884859 发布日期：2021-11-26 浏览：16次 >En<

阅读说明：本技术 一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏pcr引物组及其应用 (Nested PCR (polymerase chain reaction) primer group for simultaneously detecting mycoplasma hyopneumoniae and chlamydia suis and application thereof ) 是由刘国平谭旭杨杰万佳佳闫春梅曾攀胡利群于 2021-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组及其应用,属于分子诊断技术领域。本发明提供的同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组包括两对外侧引物Mhp-O-F、Mhp-O-R和C.suis-O-F、C.suis-O-R和两对内侧引物Mhp-I-F、Mhp-I-R和C.suis-I-F、C.suis-I-R。本发明以Mhp M12916S rDNA基因序列和C.suis ompA基因保守序列作为检测猪肺炎支原体和猪衣原体的诊断靶标,设计了巢氏PCR的两对外侧引物和两对内侧引物,能够同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体,两轮PCR提高了PCR的灵敏性、抗干扰性和特异性,克服了普通PCR检测灵敏度低,特异性差等问题,与现有的间接免疫荧光,血清学等检测方法相比成本较低,检测周期短。(The invention provides a nested PCR primer group for simultaneously detecting mycoplasma hyopneumoniae and chlamydia suis and application thereof, belonging to the technical field of molecular diagnosis. The nested PCR primer group for simultaneously detecting the mycoplasma hyopneumoniae and the chlamydia suis provided by the invention comprises two pairs of outer primers Mhp-O-F, Mhp-O-R, C.suis-O-F and C.suis-O-R, and two pairs of inner primers Mhp-I-F, Mhp-I-R, C.suis-I-F and C.suis-I-R. The invention takes Mhp M12916S rDNA gene sequence and C.suis ompA gene conserved sequence as diagnosis targets for detecting mycoplasma hyopneumoniae and chlamydia suis, designs two pairs of outer primers and two pairs of inner primers of nested PCR, can simultaneously detect mycoplasma hyopneumoniae and chlamydia suis, improves the sensitivity, anti-interference and specificity of PCR by two rounds of PCR, overcomes the problems of low detection sensitivity, poor specificity and the like of common PCR, and has lower cost and short detection period compared with the existing detection methods of indirect immunofluorescence, serology and the like.)

一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组及其应用

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，尤其涉及一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组及其应用。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopniumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal Pneumonia ofSwine，MPS)的病原微生物。猪支原体肺炎广泛流行于全世界各个养猪区域，该疾病流行所引起的医药成本的增加、猪生产性能的下降，每年对养猪业都造成巨大损失。猪肺炎支原体除直接引起猪支原体肺炎造成损失外，还是猪呼吸道综合症(porcine respiratory disease complex，PRDC)的主要病原之一。

猪衣原体病(Swine Chlamydiosis,C.suis)是由鹦鹉热亲衣原体(旧称鹦鹉热衣原体)的某些菌株引起的一种慢性接触性传染病，又称流行性流产、猪衣原体性流产。临诊上可表现为妊娠母猪流产、死产和产弱仔，新生仔猪肺炎、肠炎、胸膜炎、心包炎、关节炎，种公猪睾丸炎等。常因菌株毒力，猪性别、年龄、生理状况和环境的变化而出现不同的征候群。世界各国于20世纪60年代首先确认猪衣原体病，随后许多国家相继报道了该病。中国在20世纪80年代初，从羊流产和猪繁殖障碍病料中分离出鹦鹉热亲衣原体，从而证实中国动物衣原体病的存在。

上述两种病原也是猪用疫苗常见的外源污染毒，接种被猪肺炎支原体或猪衣原体污染的疫苗后，对猪群的健康有急性的或者持续的危害，类似临床报道时有发生。这也反映出我国用于上述两种外源病毒的检测方法存在灵敏度不够高的局限性，所以提高上述两种病原的检测灵敏度，迫在眉睫。

近年来，国内外学者建立了病原的分离培养、吉姆萨染色、免疫荧光试验、血清学试验、普通PCR诊断、普通PCR检测等技术进行Mhp和C.suis的检测。病原的分离培养是包括支原体在内所有病原微生物诊断的金标准，但是在大多数情况下并不会作为确诊猪肺炎支原体和猪衣原体感染的实验室手段；主要因为支原体分离固有的困难与缓慢。在实验室中，多采用免疫荧光的方法检测病原，但此种方法存在敏感性不足的缺点。血清学诊断方法可以应用于检测群体是否感染有猪肺炎支原体和猪衣原体，然而对于个体此种方法并不适用，因为感染猪肺炎支原体和猪衣原体的个体在不同毒力毒株、个体健康状态、母源抗体水平等多因素影响下其抗体转阳的时间从几周到几个月不等。聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction，PCR)作为现在常用的检测猪肺炎支原体和猪衣原体的实验室诊断方法之一具有快速的特点，但需要注意的是普通PCR检测肺炎支原体和猪衣原体容易有假阳性的出现同时会出现交叉感染。因此，本领域亟需提供一种特异性和灵敏度均较高的能够同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组及其应用，特异性和灵敏度均较高，本发明巢式PCR引物组和检测方法能够检测到的病原最低拷贝数为10⁰个。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组，所述引物组包括两对外侧引物Mhp-O-F、Mhp-O-R和C.suis-O-F、C.suis-O-R和两对内侧引物Mhp-I-F、Mhp-I-R和C.suis-I-F、C.suis-I-R；

所述Mhp-O-F、Mhp-O-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；所述C.suis-O-F、C.suis-O-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；所述Mhp-I-F、Mhp-I-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；所述C.suis-I-F、C.suis-I-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种上述引物组在制备检测猪肺炎支原体和猪衣原体产品中的应用。

优选的，所述产品包括试剂盒、试剂和/或试纸条。

优选的，采用上述引物组检测猪肺炎支原体和猪衣原体的方法，包括如下步骤：提取待测样本的DNA进行巢氏PCR，第一轮PCR扩增采用外侧引物Mhp-O-F、Mhp-O-R和C.suis-O-F、C.suis-O-R，第二轮PCR扩增采用内侧引物Mhp-I-F、Mhp-I-R和C.suis-I-F、C.suis-I-R，每次PCR产物进行电泳检测猪肺炎支原体和猪衣原体。

优选的，所述待测样本为猪血样或组织样本，或支气管灌洗液、猪肛拭子、鼻拭子样品。

优选的，所述第一轮PCR的反应体系按照体积份数计为Taq酶12.5份，外侧引物Mhp-O-F、Mhp-O-R和C.suis-O-F、C.suis-O-R各1份，DNA模板1份，ddH₂O 2.5份。

优选的，所述第一轮PCR的反应条件包括：94℃5min，94℃30s，52-56℃30s，72℃45s，32个循环，72℃5min。

优选的，所述第二轮PCR的反应体系按照体积份数计为Taq酶12.5份，内侧引物Mhp-I-F、Mhp-I-R和C.suis-I-F、C.suis-I-R各1份，DNA模板1份，ddH₂O 2.5份。

优选的，所述第二轮PCR的反应条件包括：94℃5min，94℃30s，54-58℃30s，72℃45s，32个循环，72℃5min。

优选的，两轮PCR若在418bp或275bp处出现条带，则说明猪肺炎支原体为阳性；若在562bp或395bp处出现条带，则说明猪衣原体为阳性。

本发明的有益效果：

本发明针对猪肺炎支原体基因组和猪衣原体基因组特征，应用分子生物学技术，以猪肺炎支原体M129序列16S rDNA基因保守序列和猪衣原体ompA基因研制和开发出一种特异性高、灵敏度强、准确性高的双重巢式PCR引物组和检测方法。方法简便易实施，样本来源广泛，可为血样、组织、精液、淋巴结、胎衣、猪肺样、猪肺支气管样、胎儿、肠系膜、支气管灌洗液、血清样猪肛拭子、鼻拭子、气溶胶、环境样品等，检出率高，可成功检测到单个拷贝数的病原，对带毒量较低的规模化猪场猪肺炎支原体或猪衣原体的监测提供了便利。同时本发明的引物组可适用于预警检测、临床诊断、免疫评价等。

附图说明

图1为猪衣原体、支原体双重巢式PCR检测凝胶电泳图，其中A为外侧引物检测凝胶电泳图，M为Marker，1、2为两次平行试验，B为内侧引物检测凝胶电泳图，M为Marker，1、2为两次平行试验；

图2为猪衣原体、支原体双重巢式PCR引物特异性检测凝胶电泳图，其中A为外侧引物结果图，B为内侧引物结果图，A图和B图中的M均为DL2000 DNAMarker，1为阳性对照，2为猪瘟病毒阳性，3为猪细小病毒阳性，4为猪伪狂犬病毒阳性，5为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性，6为大肠杆菌阳性，7为金黄色葡萄球菌阳性，8为无菌蒸馏水阴性对照；

图3为猪衣原体、支原体双重巢式PCR引物敏感性检测的凝胶电泳图，其中A为外侧引物结果图，B为内侧引物结果图，A图和B图中的M均为DL2000 DNAMarker，1-10中模板拷贝数依次为5×10⁹、5×10⁸、5×10⁷、5×10⁶、5×10⁵、5×10⁴、5×10³、5×10²、5×10¹、5×10⁰；

图4为猪衣原体、支原体双重巢式PCR引物抗干扰性试验的凝胶电泳图，其中A为外侧引物结果图，B为内侧引物结果图，A图和B图中的M均为DL2000 DNAMarker，1为猪支原体、衣原体重组质粒与猪瘟病毒阳性混合物，2为猪支原体、衣原体重组质粒与猪细小病毒阳性混合物，3为猪支原体、衣原体重组质粒与猪伪狂犬病毒阳性混合物，4为猪支原体、衣原体重组质粒与大肠杆菌混合物，5为无菌无酶水。

具体实施方式

本发明以猪肺炎支原体M129序列16S rDNA基因和猪衣原体ompA基因为检测的靶标，设计了在同一个PCR反应程序和反应体系中能够同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组，肺炎支原体检测引物和猪衣原体检测引物之间不会相互影响，具有特异性强、灵敏度高、准确性高的特性，可检测低至单个拷贝数的病原。

本发明还提供了一种上述引物组在制备检测猪肺炎支原体和猪衣原体产品中的应用。

在本发明中，所述产品优选的包括试剂盒、试剂和/或试纸条。利用上述引物组进行猪肺炎支原体和猪衣原体的检测时，检测方法优选的包括如下步骤：提取待测样本的DNA进行巢氏PCR，第一轮PCR扩增采用外侧引物Mhp-O-F、Mhp-O-R和C.suis-O-F、C.suis-O-R，第二轮PCR扩增采用内侧引物Mhp-I-F、Mhp-I-R和C.suis-I-F、C.suis-I-R，每次PCR产物进行电泳检测猪肺炎支原体和猪衣原体。

本发明对于待测样本DNA的提取方式没有特殊限定，采用本领域常规提取DNA的方法均可。在本发明中，所述待测样本优选的为猪血样或组织样本，或支气管灌洗液、猪肛拭子、鼻拭子样品。本发明对于待测样本的来源没有特殊限定，比如猪血样可来源于胎儿，组织样本可来源于猪肺样、猪肺支气管样、胎衣、淋巴结、肠系膜，另外，本发明待测样本也可为精液、精液上清样、气溶胶、环境样品。本发明对于各待测样本的处理方式没有特殊限定，采用本领域常规处理待测样本的方法均可，在本发明具体实施例中，对血清样本进行处理时，是前腔静脉采血，1500r/min离心30min，收集样本血清，取200μL用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用；对组织样品进行处理时，是取待检测猪只样本的组织器官，破碎后用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用；对灌洗液进行处理时，是用生理盐水对猪肺进行灌洗，收集灌洗液，12000r/min离心5min，收取上清200ul用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用；对肛拭子和鼻拭子及环境样进行处理时，使用涡旋振荡器振荡2min，瞬时离心30s，取上清200ul使用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用。

在本发明巢氏PCR中，外侧引物序列分别为：

Mhp-O-F：上游引物5’-ACTGACGCTTAGGCTTGAA-3’，

Mhp-O-R：下游引物5’-TCCCTTCCTTCCTCCAA-3’，

C.suis-O-F：上游引物5’-GCCTTATGATTGACGGGATT-3’，

C.suis-O-R：下游引物5’-GGTTTAGACTGAGCGTATTGG-3’；

内侧引物序列为：

Mhp-I-F：上游引物5’-TTCGCAAGAATGAAACTCA-3’，

Mhp-I-R：下游引物5’-TCCCTTCCTTCCTCCAA-3’，

C.suis-I-F：上游引物5’-CGTCTCGGCTATTATGGA-3’，

C.suis-I-R：下游引物5’-CAAGCGAAGGCAGTATCT-3’。

在本发明中，所述第一轮PCR的反应体系优选为按照体积份数计为Taq酶12.5份，外侧引物Mhp-O-F、Mhp-O-R和C.suis-O-F、C.suis-O-R各1份，DNA模板1份，ddH₂O 2.5份。本发明对于上述各物质的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。

在本发明中，所述第一轮PCR的反应条件优选的包括：94℃5min，94℃30s，52-56℃30s，72℃45s，32个循环，72℃5min。

在本发明中，所述第二轮PCR的反应体系优选的按照体积份数计为Taq酶12.5份，内侧引物Mhp-I-F、Mhp-I-R和C.suis-I-F、C.suis-I-R各1份，DNA模板1份，ddH₂O 2.5份。本发明对于上述各物质的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。

在本发明中，所述第二轮PCR的反应条件优选的包括：94℃5min，94℃30s，54-58℃30s，72℃45s，32个循环，72℃5min。

在本发明中，依据电泳检测结果判断有无猪肺炎支原体和猪衣原体，所述判断的标准为：两轮PCR若在418bp或275bp处出现条带，则说明猪肺炎支原体为阳性；若在562bp或395bp处出现条带，则说明猪衣原体为阳性；两轮巢式PCR后检测均无目的条带的则报告为阴性。在第一轮PCR扩增后电泳检测到目标条带则报告为阳性，且检测样本带毒量较高，在第一轮PCR扩增后无目标条带，但第二轮PCR扩增后电泳检测到目标条带的也判断为阳性，表明样品带毒量相对较低。本发明对于电泳检测所使用的具体方法没有特殊限定，在本发明具体实施例中，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

以猪肺炎支原体16S rDNA基因和猪衣原体ompA基因为模板，共进行2次平行试验。2次平行试验的步骤均为：用外侧引物Mhp-O-F、Mhp-O-R和C.suis-O-F、C.suis-O-R进行第一轮PCR扩增，第一轮PCR的反应体系为Taq酶12.5μL，外侧引物

Mhp-O-F：5’-ACTGACGCTTAGGCTTGAA-3’，

Mhp-O-R：5’-TCCCTTCCTTCCTCCAA-3’，

C.suis-O-F：5’-GCCTTATGATTGACGGGATT-3’，

C.suis-O-R：5’-GGTTTAGACTGAGCGTATTGG-3’各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O 2.5μL，第一轮PCR的反应条件为：94℃5min，94℃30s，52-56℃30s，72℃45s，32个循环，72℃5min。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增。

以上述第一轮扩增产物为模板，用内侧引物

Mhp-I-F：5’-TTCGCAAGAATGAAACTCA-3’，

Mhp-I-R：5’-TCCCTTCCTTCCTCCAA-3’，

C.suis-I-F：5’-CGTCTCGGCTATTATGGA-3’，

C.suis-I-R：5’-CAAGCGAAGGCAGTATCT-3’进行第二轮扩增，第二轮PCR的反应体系为Taq酶12.5μL，内侧引物Mhp-I-F、Mhp-I-R和C.suis-I-F、C.suis-I-R各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O 2.5μL，第二轮PCR的反应条件为：94℃5min，94℃30s，54-58℃30s，72℃45s，32个循环，72℃5min。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。检测结果如图1所示。

由图1可以看出，外侧引物检测的目标条带为562bp和418bp，内侧引物检测的目标条带为275bp和395bp。

实施例2

分别以提取猪肺炎支原体和猪衣原体阳性猪(阳性对照)、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的基因为模板，进行巢氏PCR，设置无菌蒸馏水为阴性对照，巢氏PCR的具体步骤同实施例1，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果如图2所示。

由图2可以看出，本发明设计的巢式PCR所用到的四对引物序列有较高的特异性。

实施例3

提取Mhp、C.suis质粒，测定浓度后计算出拷贝数为5.0×10⁹，进行10倍倍比稀释至个位数拷贝数，选取各稀释度质粒当做模板，进行巢氏PCR，巢氏PCR的具体步骤同实施例1，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果如图3所示，经过巢式PCR两轮扩增后能检测到最低5.0×10⁰个拷贝数。

实施例4

将猪支原体、衣原体重组质粒分别与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌等量混合，以无菌无酶水为阴性对照，进行巢氏PCR，巢氏PCR的具体步骤同实施例1，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检验引物的抗干扰性，观察能否从混合基因组模板中扩增出目的条带。结果如图4所示，内侧引物和外侧引物均能从混合模板中扩增出特异性条带，显示引物抗干扰性较好。

实施例5

2021年5月从湖北某家规模化猪场采集小猪血样20份，1500r/min离心30min，收集样本血清，按照康为世纪公司的柱式血液样本DNA提取试剂盒提取DNA为模板，进行巢氏PCR，巢氏PCR的具体步骤同实施例1，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果显示，20份血清样本共检测到15份阳性，其中支原体检出10份，衣原体检出5份，测序结果显示15份阳性产物为猪肺炎支原体基因和猪衣原体基因。表明本发明方法检测的结果具有可靠性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA