核酸扩增中的可逆热力学陷阱(热陷阱)
阅读说明：本技术 核酸扩增中的可逆热力学陷阱(热陷阱) (Reversible thermodynamic traps (thermal traps) in nucleic acid amplification ) 是由 卡米尔·安杰伊·利平斯基 弗朗索瓦·乔尔·派莱尔 布莱恩·詹姆斯·麦基翁 于 2018-09-24 设计创作，主要内容包括：本申请描述了一种有效扩增并检测群体中的特定核酸序列的方式。本发明旨在通过将引发寡核苷酸(引物)之间的不希望的相互作用降至最低,从而提供提高的检测特异性。(The present application describes a means for efficiently amplifying and detecting specific nucleic acid sequences in a population. The present invention aims to provide improved detection specificity by minimizing unwanted interactions between priming oligonucleotides (primers).)
技术领域
本发明涉及基于核酸扩增的分子生物学检测的设计，例如(但不限于)聚合酶链反应(PCR)和各种恒温扩增方法。本发明旨在通过将引发寡聚核苷酸(引物)之间的不希望的相互作用降至最低，从而提供更高的检测特异性。
背景技术
许多核酸序列在单次反应中迅速扩增的高度复合分子生物学检测中，实现高特异性、敏感性和产物产量是非常重要的。在一项检测中，可将数十个、数百个或数千个寡核苷酸引物混合，以进行一个或若干个临床相关靶的扩增。随着复合水平的增加，引物相互作用的组合复杂性也会增加，并且会出现一些热力学瓶颈，从而导致敏感性降低或者甚至出现假阳性的结果。
一个典型实例为由于引物的非特异性交叉反应性而导致的引物二聚体的不希望的扩增。人们研发了多种生物化学、生物物理学和生物信息学方法，以通过将不希望的引物相互作用的可能性降至最低，从而有助于检测设计。许多方法侧重于在存在全部试剂、并且使反应达到其期望的温度之前防止扩增发生(例如，“热启动”扩增)。在计算方法方面，对候选引物池的候选引物的3’端的互补性进行筛选，并计算引物双链的生物模拟(in silico)热力学稳定性。即使能够将引物设计为使得引物之间几乎不存在可通过碱基配对而有利于二聚体形成的互补性，但是仍可通过非序列依赖的方式形成引物二聚体。目前能够揭示这种引物二聚体的形成机理的证据非常有限。一种可能的解释是在DNA聚合酶的催化位点内，一条引物通过串联相互作用在另一条引物上延伸(图1)。
一旦形成，引物二聚体会迅速扩增，并且甚至会在检测到目标扩增之前迅速耗尽可供使用的试剂池-尤其是如果靶以极低的拷贝数存在时更是如此。
因此，在利用引发寡核苷酸的所有核酸扩增方法中，例如在最常用的方法聚合酶链反应(PCR)中，引物二聚体形成是限制特异性、敏感性和产量的关键因素之一。除了PCR外，在大多数(即便不是全部)恒温扩增方法中，反复出现的引物二聚体形成是尤其严重的问题。实例包括(但不限于)解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导恒温扩增(LAMP)和链置换扩增(SDA)。恒温扩增反应相对更易于被引物二聚体的蔓延控制的部分原因是：引物相互作用不会连续重置(reset)，如同在PCR中通过变性循环发生引物相互作用的重置那样。另一种可能的解释是：在恒温方法中，扩增速度与DNA长度直接相关，这非常有利于更小的产物。
专利文献US 2009/0258353 A1中披露的方法使用了5’杂交盒(hybridisationcassette)以促进非扩增性引物二聚，然而在该方法中，5’区域为3’靶特异性区域的起始的反向互补。这使得产生了其中引物自身回折的发夹结构，或者在5’末端杂交的二聚体。专利文献US 2009/0258353 A1的方法在设计时必须为自然界中存在的序列，因为该序列为引物的靶特异性区域中的一部分的反向互补，其中引物与天然序列互补。
专利文献WO 2015/164494 A1中的方法再次使用了能够通过其5’区域进行二聚的引物。然而，在该方法中，5’区域包括切口酶的限制性位点。因此该位点必须为自然界中存在的序列。
在专利文献WO 2017/117287 A1中，披露了具有5’延伸的引物的用途，该引物被用于将新的高特异性引物结合位点装入扩增子中。其可用于标记扩增子引物延伸(TAPE)或提高检测分析中的可信度。虽然提及了引物可形成非延伸性二聚体，但这不是该发明的关注点。
专利文献WO2016161054 A1描述了一种通过使用具有互补的5’延伸的引物从而将多个核酸序列融合在一起的方法。使用多组引物以使靶基因扩增，并且每一对中的引物的5’延伸与另一对中的引物的延伸互补。这样形成了可融合在一起成为一条链的扩增子。该发明中没有非复制性接头(linker)，因为使用这种非复制性接头会妨碍其用于核酸融合，因为将不会引入5’延伸。
专利文献WO 2017/165289 A1中引物的特征为自身互补的5’延伸，使得引物能够形成发夹结构或非延伸性二聚体。然而，由于随机或半随机的3’区域，这些二聚体用于全细胞扩增。这些二聚体并非靶向特定基因。此外，这些二聚体不包含非复制性接头区域。
专利文献WO 94/21820披露了通过使用具有5’延伸和非复制性接头区域的引物来产生具有游离的5’端的扩增子的方法。然而，该5’延伸并不是为了进行杂交而特别设计的，而是用来在扩增子产生后迅速检测扩增子的存在。
发明内容
一种解决引物二聚体形成问题的方式是迫使引物以防止其延伸的方式进行二聚，例如通过5’端的杂交进行二聚。由于所有常用的核酸聚合酶仅具有5’到3’活性，并且引物二聚体的3’端没有模板，因此这种引物二聚体不能延伸。例如，可通过如下方式改善这种技术的用途：使用自然界中不存在的核酸序列(nullomer)，以提供5’杂交框以及将引物的3’靶特异性结合区域与5’杂交盒分离的接头区域，其防止了将5’杂交盒引入扩增子中。
这里，我们提出了一种在核酸扩增过程中限制引物二聚体的形成的新的方法，该方法将引发寡核苷酸可逆地捕获在被称为热力学陷阱(Thermodynamic Trap)(热陷阱(ThermoTrap))的分子物质中。热力学陷阱的实施非常简单且有成本效益。与其他方法不同的是，热陷阱无需改变反应化学—其仅通过使用在相互杂交的引物的5’端加入的短人工序列发挥作用。引物的5’互补区域能够与其他引物杂交，但是不能与扩增子靶序列杂交。
所描述的方法包括扩增核酸序列的方法，包括：
a.准备反应混合物，包含：
i.核酸样品；
ii.第一核酸扩增引物，其具有与样品的第一靶区域互补的3’区域以及不与样品的区域互补的5’区域；其中，5’区域或者为自身互补，从而使得第一核酸扩增引物的第一链的5’端能够杂交至第一核酸扩增引物的第二链的5’端，或者第一核酸扩增引物的5’区域与第二核酸扩增引物的5’区域互补；
iii.核酸聚合酶；
iv.核苷三磷酸单体；以及可任选的
v.第二核酸扩增引物，其具有与第一引物的延伸产物互补的3’区域以及与第一引物的5’区域互补且不与样品的区域互补的5’区域；
b.使第一引物杂交至样品；
c.使用核酸聚合酶和核苷三磷酸单体使第一引物延伸；以及
d.重复步骤b和c，由此扩增靶序列，其中第一核酸扩增引物杂交至样品。
可使用单一种类的第一扩增引物进行该方法。在这种情况中，扩增为基于重复杂交和延伸的线性扩增。可使用链置换聚合酶或类似的酶置换将延伸链置换。
或者，扩增可包括第二扩增引物，使得扩增为指数式扩增。第二引物复制来自第一引物的延伸产物。重复第一引物的杂交和延伸的方法也重复进行第二引物的杂交和延伸，从而复制拷贝。
扩增可为恒温扩增，或者可通过热循环进行扩增。当扩增为恒温时，可使用酶(例如，解旋酶或重组酶)置换样品中的延伸引物。在通过热循环进行扩增的情况中，利用热置换样品中的延伸引物。
为了提供可用于任何样品的通用序列，第一核酸扩增引物的5’区域具有自然界中不存在的序列。第一核酸扩增引物的5’区域为自身互补或者与第二核酸扩增引物的5’区域互补。当第一核酸扩增引物的5’区域具有自然界中不存在的序列时，那么自然界中也不会发生互补复制，因此第二核酸扩增引物的5’区域也具有自然界中不存在的序列。
为了有效地起作用，第一核酸扩增引物的5’非互补区域的熔解温度可低于第一核酸扩增引物的3’靶互补区域的熔解温度。
为了能够普遍应用于任何引物群，第一核酸扩增引物的5’非互补区域可具有回文结构。当存在多于一种引物时，各扩增引物的5’非互补区域可相同并具有回文结构。因此，引物群中的任何引物均可杂交至引物群中的其他引物上。
引物的5’区域和3’区域可通过不能被聚合酶复制的间隔单元(spacer unit)。适合的耐聚合酶间隔单元包括烷基(CH2)链或乙二醇(CH2O)链。间隔单元还可为改性的核苷酸或核糖核苷酸。
可使用两种或以上具有不同靶序列的第一核酸扩增引物，从而通过多重方式使用该方法。
还描述了用于核酸序列的扩增的试剂盒，包含：
a.第一核酸扩增引物，其具有与样品的第一靶区域互补的3’区域以及不与样品的区域互补的5’区域；其中，5’区域或者为自身互补，从而使得第一核酸扩增引物的第一链的5’端能够杂交至第一核酸扩增引物的第二链的5’端，或者第一核酸扩增引物的5’区域与第二核酸扩增引物的5’区域互补；
b.核酸聚合酶；
c.核苷三磷酸单体；以及可任选的
d.第二核酸扩增引物，其具有与第一引物的延伸产物互补的3’区域以及与第一引物的5’区域互补且不与样品的区域互补的5’区域。
试剂盒可包含第二扩增引物。
试剂盒可包含解旋酶或重组酶。
试剂盒可包含第一核酸扩增引物，其中第一核酸扩增引物的5’区域具有自然界中不存在的序列。
试剂盒可包含第一核酸扩增引物，其中第一核酸扩增引物的5’非互补区域具有回文结构。
试剂盒可包含第一核酸扩增引物，其中第一核酸扩增引物的5’非互补区域通过不能被聚合酶复制的间隔单元连接至引物。适合的耐聚合酶间隔单元包括烷基(CH2)链或乙二醇(CH2O)链。间隔单元还可为改性的核苷酸或核糖核苷酸。
试剂盒可包含多于一种第一核酸扩增引物。
附图说明
图1.引物相互作用导致引物二聚体的形成和扩增。(A)有限碱基配对的相互作用。(B)无碱基配对的相互作用的实例。这两种相互作用均产生了凸出的5’DNA端，其用作在DNA聚合酶的作用下由3’端开始链延伸的模板，这些DNA聚合酶均具有3’至5’方向性。
图2.热力学陷阱的总原则。(A)位于引物5’端(以斜线示出)的互补或部分互补的热陷阱元件之间的相互作用形成了具有凸出的3’端的引物双链，其不能在DNA聚合酶的作用下延伸。(B)在扩增反应混合物中，引物对更趋向于以热陷阱介导双链的形式、而非具有有限的序列互补性或不具有序列互补性的3’至3’串联的形式负载于DNA聚合酶催化位点(灰色圆)中。(C)在靶序列的存在下，这些引物对通过3’端引物区域结合，该3’端引物区域的亲和力高于捕获的不耐热引物双链。
图3.所选择的热陷阱设计的实施方案。(A)通过无关序列隔开热陷阱元件与3端靶结合区域。(B)热陷阱元件位于内部，并且其5’端的侧翼为无关序列。(C)热陷阱元件为回文结构，使得引物在单重或多重反应中以任意组合形成同源双链和异源双链。(D)可使多于一个热陷阱元件连接至引物，以产生高阶引物复合物，并进一步降低溶液中有效的游离分子的浓度。
图4.热陷阱元件和靶结合区域的化学分离。(A)当热陷阱元件和靶特异性引物区域为同一连续核苷酸序列的一部分时，热陷阱元件通过由模板分子的3’端开始的模板分子延伸从而复制到互补链中。(B)在两个序列(条带)之间引入间隔子，以防止热陷阱序列在下一轮扩增中延伸。
图5.修饰5’引物端，以增强使用不具有链置换活性的DNA聚合酶的扩增反应的性能。(A)使用链置换DNA聚合酶的扩增会导致由模板分子的3’端开始的模板分子延伸而置换捕获的引物分子。(B)当使用不具有链置换活性的DNA聚合酶如Taq时，捕获的引物会在延伸聚合酶的作用下降解，同时延伸靶3’端。(C)通过对包含热陷阱的引物上的5’端(菱形符号)进行化学修饰，防止了捕获的引物被缺乏链置换活性的DNA聚合酶降解。为了清楚起见，示出热陷阱引物设计，其中通过无关序列隔开热陷阱元件与3’端靶结合序列。
图6.具有热陷阱引物设计的溶液引物沉淀。(A)形成引物对的其中一个引物通过共价方式或其他方式在其5’端处与固体表面相连。为了清楚起见，示出热陷阱引物设计，其中热陷阱元件位于内部，其位于5’端的侧翼为用作接头的无关序列。(B)加入溶液引物并通过热陷阱元件杂交至固定的引物。(C)在恒温扩增反应中，在加入扩增试剂之后，杂交的溶液引物被DNA聚合酶置换，从而使结合的靶分子的3’端延伸。
图7.在文库生成中用作衔接头(adapter)的热陷阱序列。(A)互补的热陷阱元件产生具有对称衔接头的文库。(B)回文结构的热陷阱元件产生具有对称衔接头的文库。
图8.在解旋酶依赖性扩增(HDA)检测中，热陷阱引物设计降低了假阳性引物二聚体扩增的发生率。(A)在不存在模板分子的条件下的反应扩增曲线。凝胶电泳证实了对于引物二聚体产物的鉴定(未示出)。(B)在存在模板分子条件下的反应扩增曲线。
图9.热陷阱引物设计能够防止污染DNA的非特异性扩增。在存在靶DNA或者限定量的人基因组DNA污染物的条件下，大肠杆菌uidA(E.coli uidA)基因区域的扩增。示出了产物扩增曲线(左)和产物熔解曲线(右)。实线绘制了在不存在污染性人基因组DNA(B01-F02和B07-F08)的条件下，在不同输入值(input)的uidA靶拷贝数(10拷贝至10.000拷贝)存在时扩增的PCR产物。虚线绘制了在存在50ng和500ng之间的人基因组DNA(G01、G02、G07、G08和H01、H02、H07、H08)以及无模板对照(A01、A02和A07、A08)的扩增的PCR产物。(A)具有标准引物设计的扩增，其中引物仅包含靶结合序列。(B)具有Alpha8热陷阱序列的扩增，其中Alpha8热陷阱序列仅在其5’端与靶结合序列接合。
具体实施方式
所有已知的DNA聚合酶均具有严格的酶方向性，其仅作用于一条DNA链的3’端的羟基，并且引入与具有凸出的5’端的第二条DNA链中所存在的核苷酸互补的核苷酸。不希望的引物二聚体扩增通过引物相互作用而发生，从而形成具有这种凸出的5’端的双链。
热陷阱引物设计通过使引物以另一种不会导致扩增性二聚体形成的方式彼此之间可逆地相互作用，从而防止了不希望的引物相互作用。这是通过向引物的5’端加入相对较短且熔解温度低的一个或多个DNA序列而实现的，其中所述DNA序列具有完全互补性或部分互补性(图2A)。通过这些序列(也称为热陷阱元件)的相互作用形成了具有凸出的3’端的引物二聚体，其不能通过DNA聚合酶扩增。
引物中设计为与靶DNA序列相互作用的3’端部保持不变并且完全暴露。因此，在形成热陷阱介导双链的同时，理论上仍能够发生有害的3’到3’引物二聚体相互作用(图2B)。然而，由于DNA聚合酶与DNA寡核苷酸相比较大，因此这两种引物构象会竞争与酶的催化位点结合。由于热陷阱元件至少是部分互补的，因此其负荷(loading)是热力学优选的，由此在空间上防止了不希望的引物二聚体的负荷和延伸，其中所述不希望的引物双链不具有互补性或互补性非常有限。
除了位阻影响外，将两个引物结合在一起可有效地将溶液中引物分子的摩尔浓度降低一半，从而在热力学上降低不希望的相互作用的可能性。
由于与热陷阱元件相比，引物的靶特异性部分更长且具有更高的熔解温度，因此在热力学上，结合靶DNA序列比热陷阱介导双链更为有利，由此获得了扩增靶序列的能力(图2C)。通过在扩增反应中从双链中自发解离而获得捕获的引物。
序列组成
用作热陷阱元件的核苷酸序列可选自任何自然界中存在的序列，但是也可以在这样的程度上为部分或完全人工序列，使得在一些实施方案中，可能无需对其进行酶复制。有利的是自然界中不存在的人工序列(未显示出与任何已知序列的明显序列相似性的序列；也称为nullomer)，并且该人工序列经预测或优化以与任何天然靶序列的扩增间的交叉反应性最小化。
产生nullomer的方法如下：
a.产生满足预定标准的随机引物群。标准可选自任何核苷酸序列特性，如长度、鸟嘌呤和胞嘧啶的百分数(GC％)、序列熔解温度、吉布斯自由能、形成二级结构的倾向或预定的二核苷酸组成。
b.通过对自然界中存在的所有DNA序列的非冗余库(例如NCBI NR数据库)采用启发式算法，从而从池中过滤出与天然存在的序列具有明显序列相似性的序列，其中启发式算法例如为(但不限于)BLAST、BLAT或SSAHA2。
c.通过采用EXACT算法，如Smith&Waterman局部比对方法，从而过滤出具有所示的明显序列相似性的序列。
d.通过采用引物和所有序列的所有位置之间的退火的热力学模拟(例如，基于最近邻热力学表)，从而过滤出具有所示的明显的结合亲和力的序列。
可通过各种生物信息学方法和实验方法，以识别经优化以用于给定的靶特异性结合区域的热陷阱元件的序列。在采用实验方法的情况中，可通过高通量筛选来选择热陷阱序列，其中在具有挑战性的条件下(例如，在大量的污染DNA的存在下)，使用连接至常用靶特异性结合区域的热陷阱序列的随机池。随后可使用下一代测序(“NGS”)对中靶(on-target)(特异性)产物和脱靶(off-target)(非特异性)产物进行识别和定量，从而能够选择具有最佳的中靶-脱靶比(on-target-to-off-target ratio)的热陷阱序列。
热陷阱区域和靶结合区域之间的距离
所概述的作用机制描述了由于位阻影响，热陷阱介导双链和非特异性引物双链之间与DNA聚合酶结合的竞争。因此，热陷阱区域和3’引物端之间的距离应足够小，以介导这种竞争，即，防止两个DNA聚合酶单元独立地结合两个引物端(图2描述了直接相邻的两个元件)。
然而，即使该距离过大以至于不能进行竞争，但是通过降低溶液中游离引物分子的摩尔浓度，这种分离的热陷阱区域的存在仍是有利的。因此，本公开中包括了这样的引物设计，无论热陷阱区域和3’端靶特异性区域之间的距离如何，只要热陷阱区域和3’端靶特异性区域位于相同的寡核苷酸分子上即可(图3A)。
热陷阱区域的位置
图2A绘制了直接位于5’引物端的热陷阱元件。然而，热陷阱元件也可位于内部，并且任何DNA序列接续热陷阱元件位于5’端(图3B)。例如，在诸如解旋酶依赖性扩增之类的应用中，热陷阱元件位于5’端的侧翼可为低熔解温度序列，以促进解旋酶作用下的DNA解旋。
热陷阱区域的互补性
图2A示出了热陷阱序列完全互补的设计。然而，热陷阱元件也可设计为包括错配或经修饰的碱基。
此外，图2A绘制了热陷阱序列连接至两个不同引物的设计，从而形成了引物异源双链。然而，热陷阱序列也可设计为回文结构(两条互补链上的序列在按照5’到3’方向读取时是相同的)。在与反应中所存在的任何其他包含热陷阱的引物的所有组合中，具有回文结构的热陷阱元件可形成同源双链和异源双链(图3C)。因此，回文结构设计可在多重反应的复合引物池中采用单一热陷阱元件设计。
可调整热陷阱的尾部长度，以优化扩增效率和引物二聚体抑制之间的平衡。据预测，长的热陷阱尾部的抗引物二聚体形成性高，但是代价是扩增效率较低，同时预计短的热陷阱尾部可获得较高的扩增效率，但是代价是抗引物二聚体形成性较低。
高阶组合
图2A绘制了各引物包含一个热陷阱元件的设计。然而，实际上可将多于一个不同或相同的热陷阱元件连接至单个引物，以有助于形成高阶引物复合物(即，具有多于两个引物)。这种设计能够进一步降低反应中游离引物分子的浓度(图3D)。
化学分离
当热陷阱元件和靶特异性引物区域为同一连续核苷酸序列的一部分时，热陷阱序列通过由模板分子的3’端开始的模板分子延伸从而被引入产物互补链中(图4A)。随后，在下一轮扩增中，热陷阱序列的存在会对结合至其靶的引物的热动力学特性产生影响，例如提高引物退火温度或提高错误引发的可能性。
为了克服这一问题，在寡核苷酸合成期间，可通过一个或若干个接头或封闭分子将热陷阱元件与靶特异性引物区域化学分离，所述接头或封闭分子例如为(但不限于)己二醇、乙二醇、芘或亚磷酰胺(图4B)。也可使用RNA或经修饰的核苷酸，如锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。在该实施方案中，化学分离防止了热陷阱序列在扩增的靶DNA中延伸，同时维持了这两种引物元件的物理连接。
除了维持引物熔解温度并减少错误引发之外，将热陷阱元件和靶特异性引物区域化学分离还减少了扩增试剂例如脱氧核苷三磷酸(dNTP)的消耗，并且使得在设计更长且复合程度更高的热陷阱区域时更具灵活性，而不会干扰靶扩增。
用于增强使用不具有链置换活性的DNA聚合酶的扩增反应的性能的经修饰的5’端
大部分恒温扩增方法使用具有链置换活性的DNA聚合酶，其能够使捕获的引物在延伸步骤中解离(图5A)。如果将热陷阱设计用于使用具有5’外切酶活性的聚合酶(如用于PCR中的Taq聚合酶)的扩增方法中，则捕获的引物会在延伸聚合酶的作用下降解(图5B)。
为了避免这种情况，可以用能够保护含热陷阱的引物的5’端对抗5’定向外切酶活性的部分对其进行修饰，所述部分例如为(但不限于)硫代磷酸酯键、非核苷酸或经修饰的核苷酸。修饰将阻止模板分子延伸超过热陷阱元件，由此还提供了将热陷阱和引发区域化学分离的益处。
固相扩增中的引物沉淀
当用于基于固相扩增(其中引物对中的一个引物通过其5’端固定于固体表面上)的检测时，可使用热陷阱引物设计在加入模板并引发反应之前使溶液引物分子原位沉淀(图6)。这可通过如下方式实现：在加入反应混合物之前，使溶液引物预杂交至修饰有固定引物的表面，例如位于微孔底部。接下来，模板DNA的结合和延伸将释放捕获的溶液引物，并使其在模板分子的位于另一端的远端位点处结合。在恒温扩增中，这使得(1)将溶液引物浓缩至接近所需浓度，(2)使可用于反应的引物的总量达到更高的量，(3)需要时，在反应过程中逐渐释放引物。
用作文库生成中的衔接头的热陷阱元件
许多涉及核酸扩增的高度复合分子生物学检测需要生成扩增模板分子的文库，这些高度复合分子生物学检测例如为(但不限于)靶向下一代测序(NGS)或者扩增产物的检测(被称为扩增子测序)。可通过包含数百个引物对的大规模多重PCR反应生成这种文库。用于NGS应用的文库制备中的一个重要步骤是加入通用衔接头，其使得在随后的PCR反应中用一对PCR引物使文库均匀扩增。衔接头还可包含用于测序引物的引发位点以及有助于使文库分子结合至测序芯片的表面上的序列。此外，衔接头还可包含所谓的索引(indices)，其用作条形码，从而能够使使用者在一个测序反应中混合不同样品并随后对这些样品的来源(origin)进行反卷积。
当用于这种高度多重检测中，可采用热陷阱序列以起到热陷阱元件和通用衔接头的双重功能(如图3C所绘制)。通过使用两条互补热陷阱序列，一条热陷阱序列用于所有引物对中两个引物中的每个引物，将生成两端具有两个互补衔接头的通用衔接头文库(图7A)。通过使用与多重反应中所使用的所有引物接合的单个相同回文结构热陷阱序列，将生成具有通用且对称的衔接头的文库(图7B)。
实验
实验1：
解旋酶依赖性扩增(HDA)中热陷阱引物设计
方法：
在使用IsoAmp III Universal化学品(chemistry)(Biohelix Corp)的单重解旋酶依赖性扩增(HDA)检测中，测试恒温扩增中热陷阱引物设计在减少引物二聚体出现方面的效用。以这样的方式设计所有引物，使得这些引物的3’端包含常用靶特异性结合区域AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGC和AAAAACTCCTCTGGCACCGTGCTGC，将正向引物和反向引物分别标记为HDA72_F和HDA72_R。在所有这些引物的5’端，引物不包含额外的序列(对照引物)或者包含这四个非回文结构热陷阱元件变体中的一个：
(1)Alpha8变体ACTGACGT(或者在HDA72_R反向引物中为其互补序列ACGTCAGT)，
(2)A_Alpha8变体AAAAACTGACGT，其在5’端包含四个额外的腺嘌呤(或者在HDA72_R反向引物中为其互补序列AAAAACGTCAGT，其具有四个额外的腺嘌呤)，
(3)T_Alpha8变体TTTTACTGACGT，其在5’端包含四个额外的胸腺嘧啶(或者在HDA72_R反向引物中为其互补序列TTTTACGTCAGT，其具有四个额外的胸腺嘧啶)，
(4)Alpha16变体ACTGACGTGATCTGCA，其为16个核苷酸长的非回文结构热陷阱元件，该热陷阱元件用于替代8个核苷酸长的Alpha8元件(或者在HDA72_R反向引物中为其互补序列TGCAGATCACGTCAGT)。
细节见下表1。
表1.实验1中所用引物的列表，图示了通过热陷阱元件之间的相互作用形成的引物双链
准备25μl的反应，其包含1X Annealing Buffer II、0.3X SYBR Green、1μl的Enzyme Mix、1.75μl的dNTP Mix、4mM的MgSO4、40NaCl和用于五个引物对中的各引物对的75nM的正向引物和反向引物。向各反应中加入末端包含HDA72_F和HDA72_R序列的拷贝数为10^8(10^8copies)的模板分子(含模板反应)或水(NTC，无模板对照)。对于5种引物对中的每种引物对，准备16个重复反应(replicate reactions)，其中8个重复反应含有模板，8个重复反应含有NTC。在QuantStudio 7Flex Real-Time PCR System(Thermo FisherScientific)中将反应物在65℃培育2小时。以1分钟的间隔监测产物荧光水平的增加。根据时间对荧光数据进行作图。
结论：
在不存在模板DNA的条件下，热陷阱引物设计防止了引物二聚体扩增。热陷阱设计A_Alpha8(其5’端具有8个核苷酸长的陷阱序列和4个游离腺嘌呤)将二聚体发生率降低了87.5％，但是同时将扩增时间延长了45％。Alpha8设计(其5’端不含任何侧翼序列)将二聚体发生率降至0％，但是将扩增时间延长了127％。其他设计显著损害了靶扩增产量(图8)。
实验2：
聚合酶链反应(PCR)中的热陷阱引物设计
在单重检测中，测试聚合酶链反应(PCR)中热陷阱引物设计在减少非特异性扩增方面的效用，其中将该单重检测设计为在靶DNA的存在下或者在不同含量的人基因组DNA污染物的存在下，扩增大肠杆菌uidA(E.coli uidA)基因的区域。
比较两种引物对，这两种引物对的3’端包含靶特异性结合序列(Ecol_uidA_1_379_20_Par:AGTTGCAACCACCTGYTGAT，Ecol_uidA_1_80_22_PAf:GTATGTTATTGCCGGGAAAAGT)，但是区别在于它们的5’端存在或者不存在8个核苷酸长的Alpha8热陷阱序列(正向引物和反向引物中分别为ACTGACGT和ACGTCAGT)。
准备20μl的PCR反应，其包含0.125X Titanium PCR Buffer(ClonTech)、2.67mM的MgCl2、48mM的KCl、0.32X SYBR Green、各自0.2mM的dNTP、1X Titanium Taq聚合酶(Clontech)和0.2μM的来自引物对的各引物。
在每个反应中，所准备的反应要么不包含模板、包含50ng或500ng的人基因组DNA提取液，要么包含10拷贝至10.000拷贝的uidA靶拷贝。重复进行反应，测试两种引物对中的任一引物对。在热循环中进行PCR，使用如下程序对40个扩增循环进行实时荧光读取：
检测产物荧光水平的增加，并绘制荧光数据随时间的变化。在扩增后，对产物进行熔解曲线分析以区分中靶扩增产物(熔解温度为约89℃)和脱靶扩增产物(熔解温度小于89℃)。
结论：
在人基因组污染物的存在下，缺少热陷阱序列的引物显示出明显的脱靶扩增，而包含Alpha8热陷阱设计的引物显示出延迟脱靶扩增或不存在脱靶扩增。同时，存在Alpha8热陷阱序列未影响靶扩增的敏感性和速度(图9)。