一种巢式pcr试剂盒

文档序号：1731667 发布日期：2019-12-20 浏览：20次 >En<

阅读说明：本技术 一种巢式pcr试剂盒 (Nested PCR kit ) 是由彭志勇祝令香郭永芮孝王栋杨文军高娜于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种巢式PCR试剂盒,所述试剂盒包括进行第一轮PCR扩增的一对外部引物和进行第二轮扩增的一对巢式引物,第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板,然后再使用所述巢式引物进行第二轮扩增；其中第一轮的一对外部引物的上游和/或下游引物对于所述第二轮扩增的特异性有影响,所述一对外部引物的上游和/或下游引物中dT全部用dU代替,并且第二轮PCR扩增体系中包括UNG酶,其在第二轮扩增前用于消化所述一对外部引物的上游和/或下游引物。本发明的试剂盒操作简单快捷、扩增效率高和污染风险低。(The invention provides a nested PCR kit, which comprises a pair of external primers for carrying out first round PCR amplification and a pair of nested primers for carrying out second round amplification, wherein a product of the first round amplification is used as a template for the second round amplification, and then the nested primers are used for carrying out the second round amplification; wherein the upstream and/or downstream primers of a pair of outer primers of the first round have an effect on the specificity of the second round of amplification, the dT in all of the upstream and/or downstream primers of the pair of outer primers are replaced with dU, and a UNG enzyme is included in the second round of PCR amplification system and is used to digest the upstream and/or downstream primers of the pair of outer primers prior to the second round of amplification. The kit disclosed by the invention is simple and rapid to operate, high in amplification efficiency and low in pollution risk.)

一种巢式PCR试剂盒

技术领域

本发明PCR技术领域，具体涉及一种巢式PCR试剂盒。

背景技术

巢式PCR是一种使用两对引物进行两轮扩增的PCR技术，巢式PCR一般使用一对外部引物进行第一轮扩增，然后以第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板，然后再使用一对内部引物(也称为巢式引物)进行第二轮扩增。巢式PCR克服了普通PCR单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性。由于模板和引物的改变，降低了非特异反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性。得益于巢式PCR的高灵敏度和高特异性，巢式PCR广泛应用于病原体检测、肿瘤等疾病的伴随诊断中。

巢式PCR在实际应用中仍存在一些问题。外部引物加入量过低，则影响第一轮扩增的扩增效率，外部引物加入量过高，则外部引物残留可能对第二轮扩增造成影响。目前常用的解决方案是增加第一轮PCR的循环数，尽量消耗外部引物，然后对第一轮PCR产物进行高倍稀释，以降低进入第二轮PCR的残留外部引物量。但是，在临床应用上，增加第一轮PCR循环数会增加整个临床检测的时间，而且对高拷贝数的第一轮PCR产物进行稀释或其他操作很容易造成PCR产物污染，不利于临床检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明旨在提供一种巢式PCR试剂盒，该PCR试剂盒在保持高扩增效率的同时，解决了巢式PCR外部引物残留而对第二轮PCR造成的影响，并且严格控制了第一轮PCR扩增循环数和产物量，适用于临床检测。

在第二轮PCR扩增前，在PCR混合液中添加UNG酶，并设置合适的孵育温度和时间即可消除第一轮PCR扩增引物。由于UNG酶在PCR循环中95℃变性步骤中可被灭活，因此不会影响后续实验。高品质的UNG酶可以消除高达10⁸的含dU PCR产物。

在一种实施方式中，本发明提供一种巢式PCR试剂盒，所述试剂盒包括进行第一轮PCR扩增的一对外部引物和进行第二轮扩增的一对巢式引物，第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板，然后再使用所述巢式引物进行第二轮扩增；其中第一轮的一对外部引物的上游和/或下游引物对于所述第二轮扩增的特异性有影响，所述一对外部引物的上游和/或下游引物中dT全部用dU代替，并且第二轮PCR扩增体系中包括UNG酶，其在第二轮扩增前用于消化所述一对外部引物的上游和/或下游引物。

在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒是巢式数字PCR试剂盒。

在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒是非小细胞肺癌EGFR基因20ins突变检测的巢式数字PCR试剂盒。

在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒中第一轮上游引物是SID No.6:CCACACUGACGUGCCUCUCC；和第一轮下游引物是SID No.7:AGGCAGCCGAAGGGCA。

在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒中第二轮上游引物是上游ARMS引物SIDNo.8:GTGGACAACCCCCACCAC；和第二轮下游引物是SID No.9:CGGTGGAGGTGAGGCAGAT。

本发明试剂盒具有以下优点，本发明实现了如下技术效果：

1)操作简单快捷：不需要增加第一轮PCR的循环数，不需要对第一轮PCR产物进行稀释。

2)扩增效率高：检出拷贝数/投入拷贝数达到了10倍，能满足放大低丰度模板的需求。

3)污染风险低：将第一轮PCR扩增循环数控制在少量循环，使第一轮PCR产物量控制在能满足需求的最低量，将操作PCR产物时的污染风险降到最低。

附图说明

为更好体现本发明PCR鉴定体系的特异性与准确性，将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是当不进行第一轮扩增，即直接用数字PCR检测时，20ins野生型模板的数字PCR扩增结果图；

图2是当不进行第一轮扩增，即直接用数字PCR检测时，20ins突变型模板的数字PCR扩增结果图；

图3是进行第一轮预扩增，然后进行第二轮数字PCR检测时，投入20ins野生型模板的常规数字PCR扩增结果图；

图4是当投入20ins野生型模板，使用本发明试剂盒数字PCR扩增结果图；和

图5是当投入200拷贝20ins突变型模板，使用本发明试剂盒数字PCR扩增结果图。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合实施例对本发明作进一步描述。

以非小细胞肺癌EGFR基因20ins突变检测中巢式PCR的应用为例(数字PCR平台)，介绍一种巢式PCR外部引物的设计方法。

用于检测引物探针性能的微液滴数字PCR反应条件示例如下：首先通过核酸提取试剂盒对临床样本核酸进行提取，然后配制PCR扩增体系，PCR扩增反应混合物包括：2×MasterMix预混液(Bio-Rad)、引物各200-1000nM、模板DNA 10-200ng，补水到20μL，将试剂混匀。用微液滴生成仪(Bio-Rad)根据说明书进行微液滴制备。然后将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增条件设定如下：

PCR扩增后，用QX200阅读仪(Bio-Rad)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。通过荧光信号检测20ins突变型，并对其直接进行绝对定量。

当不进行第一轮扩增，即直接用数字PCR检测时，20ins野生型模板的检测结果如图1，图1中纵坐标代表FAM荧光值，横坐标代表VIC荧光值，黑色点代表无扩增的阴性信号点。图1说明直接用数字PCR检测时，20ins野生型模板的检测图中只出现无扩增的阴性信号点，未出现突变型信号点，即FAM阳性点，表明20ins突变检测体系特异性良好。

当不进行第一轮扩增，即直接用数字PCR检测时，20ins突变型模板的检测结果如图2，图2中纵坐标代表FAM荧光值，横坐标代表VIC荧光值，蓝色点代表突变型信号点，黑色点代表无扩增的阴性信号点。图2中可以看出20ins突变检测体系检测突变型模板时的状态，即出现一堆FAM阳性信号点。

为提高非小细胞肺癌EGFR基因20ins突变检测的灵敏度，配制20μL第一轮普通PCR扩增体系，用外部常规引物进行第一轮8个循环的普通PCR扩增，放大初始模板量。扩增条件设定如下：

然后取2μL第一轮PCR的产物，作为第二轮数字PCR的模板，生成微液滴后，将含有微液滴的PCR管放置在PCR仪上进行扩增，扩增条件设定如下：

第一轮普通PCR引物为常规引物，第二轮数字PCR的上游引物为ARMS引物。引物设计如下表：

先进行第一轮预扩增，然后进行第二轮数字PCR检测时，投入20ins野生型模板出现大量假阳性信号点，检测结果如图3；图3纵坐标代表FAM荧光值，横坐标代表VIC荧光值，蓝色点代表突变型信号点，黑色点代表无扩增的阴性信号点。图3说明当巢式PCR与数字PCR结合检测EGFR 20ins时，常规的第一轮PCR引物会造成检测20ins野生型模板时出现大量假阳性信号点，说明简单的将巢式PCR与数字PCR结合检测EGFR 20ins是不可行的。

第一轮PCR并未把引物耗尽，由于第一轮引物并不区分野生型与突变型，残留的引物随着第一轮PCR产物一起作加入第二轮ddPCR体系，对第二轮PCR的ARMS检测体系造成了干扰，导致出现了大量非特异信号点。

如果把第一轮PCR上游引物中的dT全部用dU代替，在第二轮数字PCR体系中加入UNG酶，这样即使第一轮PCR后上游引物有残留，在进入第二轮PCR体系后被UNG酶消化清除，避免了第一轮引物残留对第二轮PCR反应造成干扰。

因此，新的引物探针组合如下表：

使用上述引物探针组合，配制20μL不含UNG酶的第一轮普通PCR扩增体系，进行第一轮8个循环的普通PCR扩增。扩增条件设定如下：

然后取2μL第一轮PCR的产物，作为第二轮数字PCR的模板，使用含UNG酶的扩增试剂配置PCR反应液，生成微液滴后，将含有微液滴的PCR管放置在PCR仪上进行扩增，扩增条件设定如下：

当投入20ins野生型模板，按上述新方案进行两轮PCR，检测特异性良好，检测结果如图4，图4纵坐标代表FAM荧光值，横坐标代表VIC荧光值，黑色点代表无扩增的阴性信号点。图4说明第一轮PCR引物改成含U引物之后，图3中出现的假阳性点消失。

当投入200拷贝20ins突变型模板，按上述新方案进行两轮PCR扩增，检测到约2000拷贝突变型模板，且阴、阳性信号点区分良好，检测结果如图5，图5纵坐标代表FAM荧光值，横坐标代表VIC荧光值，蓝色点代表突变型信号点，黑色点代表无扩增的阴性信号点。图5说明第一轮PCR引物为含U引物，巢式PCR与数字PCR结合检测EGFR 20ins突变型模板时，整个检测体系可正常工作，且能到达预期的提高检测灵敏度的效果。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

1)操作简单快捷：不需要增加第一轮PCR的循环数，不需要对第一轮PCR产物进行稀释；

2)扩增效率高：检出拷贝数/投入拷贝数达到了10倍，能满足放大低丰度模板的需求；

3)污染风险低：将第一轮PCR扩增循环数控制在8循环，使第一轮PCR产物量控制在能满足需求的最低量，将操作PCR产物时的污染风险降到最低。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 北京新羿生物科技有限公司

<120> 一种巢式PCR试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA