阅读说明：本技术 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒 (mycobacterium tuberculosis complex detection kit based on CRISPR-Cas12a system ) 是由 刘景丰 刘小龙 许海坡 蔡志雄 董秀清 于 2019-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于核酸检测技术领域,涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群的检测试剂盒及方法。该试剂盒通过采用重组酶聚合酶扩增技术提高检测灵敏度,利用CRISPR-Cas12a特异靶向结核分枝杆菌复合群靶序列后激活Cas12a的旁路切割活性,可从痰中灵敏、特异地检出结核杆菌分枝复合群。本发明具有无侵入性、可频繁多次检测、检测速度快等优势。相比于目前的PCR检测方法,本发明不需要有升降温功能的热循环仪,通过荧光读数即可检测痰液中的结核分枝杆菌复合群,具有成本低、操作简便、灵敏度高、特异性好等优点,适用于临床的大规模应用。(the invention belongs to the technical field of nucleic acid detection, and relates to a detection kit and a method for mycobacterium tuberculosis complex based on a CRISPR-Cas12a system. The kit improves the detection sensitivity by adopting a recombinase polymerase amplification technology, activates the bypass cutting activity of Cas12a after utilizing a CRISPR-Cas12a specific target mycobacterium tuberculosis complex target sequence, and can sensitively and specifically detect the mycobacterium tuberculosis complex from sputum. The invention has the advantages of no invasion, frequent and multiple detection, high detection speed and the like. Compared with the current PCR detection method, the method does not need a thermal cycler with a temperature rise and drop function, can detect the Mycobacterium tuberculosis complex in the sputum through fluorescence reading, has the advantages of low cost, simple and convenient operation, high sensitivity, good specificity and the like, and is suitable for large-scale clinical application.)

基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒

(一)技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是长期威胁人类健康的传染性疾病，其病原体是结核分枝杆菌，全球约三分之一人口感染结核分枝杆菌。据世界卫生组织统计，2017年全球共有结核病新发病例近1000万，约160万人死于结核病。中国属于全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数居全球第二位。我国每年约有新发病例100万，约13万人死于结核病。因此，结核病至今仍是威胁人类健康的全球性卫生问题。

研究显示，引起人类结核病的主要病原菌是核分枝杆菌复合群 (MycobacteriumTuberculosis Complex，MTBC)，主要包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌等。而非结核分枝杆菌 (Non-tuberculosis Mycobacteria，NTM)是指结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，广泛分布于环境中(如湿土、沼泽、河流)，属于机会致病菌。在临床诊断中，在感染NTM引起的NTM肺病中，由于其症状、体征与MTBC感染引起的肺结核病类似，因而常难以区别。但医疗实践中，由于对两种疾病采取的治疗药物不同，因此在临床诊断中需要快速、准确地鉴别MTBC与NTM，从而选择正确的药物进行治疗。

目前结核病的诊断主要依赖于对病原体的检查，常用方法为涂片染色镜检、分离培养、免疫学诊断和分子生物学诊断等。其中，分离培养法是目前诊断结核的金标准，但培养需要4～8周的时间，延误临床诊断与治疗。涂片染色镜检法操作简单，快速，但该法灵敏度低、特异性差。免疫学诊断则由于现有的抗原或抗体与其它微生物存在交叉，导致其特异性较差、假阳性率高。分子生物学诊断具有快速、灵敏的优势，且利用特异性的DNA片段还可以区分结核分枝杆菌复合体内菌种。WHO推荐使用的 Gene Xpert全自动检测系统采用PCR技术对结核分枝杆菌复合群进行检测，灵敏度特异性均较好，且不需长时间等待结果，但是仪器设备价格昂贵，难以在中低收入地区普及。近年也出现诸如LAMP，RPA等多种恒等温扩增技术，可用于现场检测，但均存在缺乏较为有效的扩增产物检测手段等问题。因此，亟需建立一种可应用于现场、简易、快速、且高灵敏度的检测技术。

重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification， RPA)是近年兴起的一种恒温扩增技术，通过三种酶的混合物，即能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，整个过程一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应，无需精密仪器。

CRISPR-Cas是细菌抵抗病毒和质粒侵染的获得性免疫防御系统，几乎存在于所有的古菌和约50％的现代细菌。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR系统要由多个Cas蛋白组成的效应复合物才能发挥功能；第二大类Cas是依靠单个Cas效应蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、 C2c2等)就能发挥功能。

2015年，张锋等人发现了CRISPR相关蛋白内切酶Cas12a(之前称为Cpf1)，它与常用的Cas9蛋白一样，是RNA引导的特异性DNA核酸内切酶，但与Cas9，Cas12a相比又有它自身特点，比如仅需要crRNA即可引导特异性切割双链DNA，并产生粘性末端等。Cas12a一旦识别并切割由crRNA序列指定的靶标DNA，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它能将任意非靶标的单链DNA切成碎片。这种作用称之为旁路切割活性。2018年，Doudna团队基于RNA引导和DNA靶向的核酸内切酶Cas12a 的旁路切割效应结合DNA等温扩增，建立了基于CRISPR的核酸检测方法DETECTR。原理是，首先通过RPA的方法大量扩增得到包含靶序列的片段，然后将扩增产物加入Cas12a检测体系中(包括gRNA，亦crRNA， Cas12a蛋白，ssDNA探针)，一旦Cas12a和gRNA复合体识别切割靶序列之后，可以触发对于非特异性单链的切割活性，检测体系中的单链报告分子被切割，发出荧光，从而确认靶序列的存在，可用于DNA病毒和SNP的检测。该检测方法不需要昂贵的试剂和特殊仪器，成本低，操作简便，检测灵敏度高，可以达到单分子检测水平，特异性强，检测靶序列DNA 非常方便。

(三)

发明内容

本发明目的是提供一种基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒，主要包括用于特异扩增结核分枝杆菌复合群IS1081基因(靶基因)的引物，gRNA和荧光报告分子ssDNA-FQ，

所述引物序列如下：

上游引物：

5’-CCAAGCTGCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGAC-3’；

下游引物：

5’-TTGGCCATGATCGACACTTGCGACTTGGA-3’；

所述gRNA序列为：

5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGACCAGGCGCUCCAUCCGGC

-3’；

所述荧光报告分子ssDNA-FQ序列为：

5’-FAM-TTTTT-BHQ1-3’。

本发明通过采用重组酶聚合酶扩增技术提高检测灵敏度，利用 CRISPR-Cas12a系统在gRNA的引导下特异靶向结核分枝杆菌复合群靶序列后激活Cas12a的旁路切割活性，可从痰等标本中高灵敏、特异性地检出结核杆菌分枝复合群，无需昂贵的热循环仪。

在CRISPR-Cas系统中，Cas蛋白在gRNA(guide RNA)的引导下，识别目标序列后启动“旁路切割”活性。在体系中加入荧光报告分子，借用 Cas12a酶旁路切割活性，实现待检序列信息向荧光信号的转化。通过RPA 与Cas12a蛋白的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的两级放大，从而超越qPCR这种单级扩增的灵敏度。此外，因为RPA扩增方式无需复杂的温度改变，从而摆脱了对qPCR仪等精密仪器的依赖，使得CRISPR-Cas技术在结核病的现场诊断方面具有广阔的应用前景。

具体的，所述IS1081基因序列如下(SEQ ID No.1)：

GAATTCGATCGCCGAGCCGACAAGACATGCCAGCGCAACCCGC TTCATCGTCGTGGCAGGTGTTGGGCTGATTTTGGTCAACCCAGCACC TGCCAGGACGGGCTACGGATGTACACGGCGACGACGGTATGGGAG GATGTCCGGTCTTGCTCCGGTCATGTCCGGTGAATGTGCTGCCAACA TCCTGGGGACCGTCCAGCGAGTTTCACCACACCTTGGGGCACCTTC TGTCACTGCTCGGTGCTGTGGATTGGTGTCAAGTTACGTCCAGGGG TGTGGTGTACGGGCAGGTAAGGCCGGTGGGCGTGTCGTAGCCCAGT AGTGGGCGGTCATCGCGTGATCCTTCGAAACGACCAGCAAAAGTCAATCGAAGGAAATGACGCAATGACCTCTTCTCATCTTATCGACACCGA GCAGCTTCTGGCTGACCAACTCGCACAGGCGAGCCCGGATCTGCTG CGCGGGCTGCTCTCGACGTTCATCGCCGCCTTGATGGGGGCTGAAG CCGACGCCCTGTGCGGGGCGGGCTACCGCGAACGCAGCGATGAGC GGTCCAATCAGCGCAACGGCTACCGCCACCGTGATTTCGACACCCG TGCCGCAACCATCGACGTCGCGATCCCCAAGCTGCGCCAGGGCAGC TATTTCCCGGACTGGCTGCTGCAGCGCCGCAAGCGAGCTGAACGCG CACTGACCAGCGTGGTGGCGACCTGCTACCTGCTGGGAGTATCCAC TCGCCGGATGGAGCGCCTGGTCGAAACACTTGGTGTGACAAAGCTT TCCAAGTCGCAAGTGTCGATCATGGCCAAAGAGCTCGACGAAGCCG TAGAGGCGTTTCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGTATACCTTC CTCGCCGCCGACGCCCTGGTGCTCAAGGTGCGCGAGGCAGGCCGC GTCGTCGGAGTGCACACCTTGATCGCCACCGGCGTCAACGCCGAGG GCTACCGAGAGATCCTGGGCATCCAGGTCACCTCCGCCGAGGACGG GGCCGGCTGGCTGGCGTTCTTCCGCGACCTGGTCGCCCGCGGCCTG TCCGGGGTCGCGCTGGTCACCAGCGACGCCCACGCCGGCCTGGTG GCCGCGATCGGCGCCACCCTGCCCGCAGCGGCCTGGCAGCGCTGC AGAACCCACTACGCAGCCAATCTGATGGCAGCCACCCCGAAGCCCT CCTGGCCGTGGGTGCGCACCCTGCTGCACTCCATCTACGACCAGCC CGACGCCGAATCAGTTGTTGCCCAATATGATCGGGTACTCGACGCTC TGACCGACAAACTCCCCGCGGTGGCCGAGCACCTCGACACCGCCC GCACCGACCTGCTGGCGTTCACCGCCTTCCCCAAGCAGATCTGGCG CCAAATCTGGTCCAACAACCCCCAGGAACGCCTCAACCGAGAGGT ACGACGCCGAACCGACGTCGTGGGCATCTTCCCCGACCGCGCCTCG ATCATCCGCCTCGTCGGAGCCGTCCTCGCCGAACAACACGACGAAT GGATCGAAGGACGGCGCTACCTGGGCCTCGAGGTCCTCACCCGAGC CCGAGCAGCACTGACCAGCACCGAAGAACCCGCCAAGCAGCAAAC CACCAACACCCCAGCACTGACCACCTAGACTGCCACCCGAAGGATC ACGCGAGGAACCTTCACTCGTACACCACGTCCCTGGCCTTGGCCTGGTGTCAGGCCCAGCTG

该序列中既可特异性的用于结核分枝杆菌复合群的检测，又可用于 CRISPR-Cas技术高效检出的向导序列(CRISPR-DT软件评分较高)，也是检测的靶向序列，如SEQ IDNO.2所示： GACCAGGCGCUCCAUCCGGC。

所述gRNA序列的构成为：5’-锚定序列-向导序列-3’，以上述向导序列配合LbCas12a的锚定序列5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3’，即gRNA序列(SEQ ID NO.3)为UAAUUUCUACUAAGUGUAGA UGACCAGGCGCUCCAUCCGGC，具有较好的检测效果。

所述试剂盒还可包括Cas12a蛋白和信号报告探针，所述信号报告探针序列为：5’-FAM-TTTTT-BHQ1-3’。

所述Cas12a蛋白可来源于LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a等，但需根据不同来源蛋白调整其锚定序列和其它试剂成分。以上述引物组、 gRNA配合LbCas12a和特定探针序列，具有较好的检测效果。

本发明还涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测方法，所述方法包括：

(1)样本核酸提取：取待测样本，提取样本DNA；

(2)RPA扩增：以靶基因扩增引物，通过RPA方法扩增步骤(1)提取得到的待测样本DNA，得到扩增产物；

所述引物序列如下：

上游引物：

5’-CCAAGCTGCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGAC-3’；

下游引物：

5’-TTGGCCATGATCGACACTTGCGACTTGGA-3’；

RPA反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物 0.125～0.625μL(浓度10μM)，RPA下游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，1×Reaction Buffer，1×BasicE-mix，1.2～2.4mM dNTP， 0.625μL 20×Core Reaction Mix，14～28mM MgOAc，待测样本基因组 DNA 1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。扩增程序：恒温37℃反应 30～60min。

(3)CRISPR反应检测：往步骤(2)反应管中加入荧光报告分子、 Cas12a蛋白和gRNA以及检测试剂，进行CRISPR反应检测，读取检测信号；

所述gRNA序列为：

5’- UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGACCAGGCGCUCCAUCCGGC -3’；

所述荧光报告分子ssDNA-FQ序列为：5’-FAM-TTTTT-BHQ1-3’；

CRISPR-Cas12a体系反应：每20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mMTris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA，pH [email protected]℃)， 36nM gRNA，50nM ssDNA-FQ，50nMCas12a。

(4)结果判定：使用荧光检测仪得到的累积荧光值作为信号强度，按照以下标准进行分析判定：

阴性判断标准：荧光量小于或等于阴性对照荧光量的1倍；

阳性判断标准：荧光量大于阴性对照荧光量的1倍。

所述CRISPR反应体系组成如下：50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，100μg/ml BSA，36nM gRNA，50nM ssDNA-FQ，50nM Cas12a。

上述检测步骤均在恒温条件完成，无需复杂的温度改变，从而摆脱了对qPCR仪等精密仪器的依赖，具有较为广阔的应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的是一种用于结核分枝杆菌复合群靶序列扩增后在gRNA引导下利用Cas12a的旁路切割活性进行荧光检测。针对结核分枝杆菌复合群IS1081基因进行设计，且利用CRISPR技术进行检测，在 CRISPR-Cas12a系统中，Cas12a蛋白在向导RNA的引导下，识别目标序列后启动“旁路切割”活性。在体系中加入荧光报告分子，借用Cas12a酶附带的切割活性，实现待检序列信息向荧光信号的转化。通过RPA与Cas12a蛋白的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联” (Cas12a酶完成)的两级放大，从而超越qPCR这种单级扩增的灵敏度。此外，因为RPA扩增方式无需复杂的温度改变，从而摆脱了对qPCR仪等精密仪器的依赖，使得CRISPR-Cas技术在结核病的现场诊断方面具有广阔的应用前景。

并且，本申请还通过对靶标序列选定、扩增引物对和gRNA的设计和筛选，最终得到了具有扩增效率高、灵敏度好且特异性强的可临床实用的引物组，缩短了结核分枝杆菌复合群的检测时间，可在120～150min内完成检测，并且最低可以检测0.004483amol的结核分枝杆菌复合群，与非结核分枝杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等其他人体常见致病菌均无交叉反应，极大的提高了CRISPR-Cas技术在结核病现场诊断的实操性。

(四)附图说明

图1为基于CRISPR-Cas12a的结核分枝杆菌复合群检测的原理图。

图2为纯化的Cas12a蛋白活性验证结果示意图。

图3为CRISPR-Cas12a检测结核分枝杆菌复合群灵敏度考察结果示意图。

图4为CRISPR-Cas12a检测结核分枝杆菌复合群特异性考察结果示意图。

(五)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

所述cas12a蛋白可来源于LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a等，但需根据不同来源蛋白调整其锚定序列和其它试剂成分。

实施例1：CRISPR-Cas12a蛋白表达、纯化、活性验证

1)从addgene上购买表达LbCas12a蛋白质粒，转化BL21菌株，LB 平板37℃培养过夜；

2)LB平板上挑取一单菌接入5mL LB培养基(100ug/mL Amp)， 37℃培养3～5h；

3)将5mL菌液接入1L LB液体培养基中(100ug/mL Amp)，37℃培养至OD60≈0.6，加入0.3mmol/L 的IPTG，16℃诱导16h；

4)将培养好的菌液放入离心机中，5000r/min离心10～15min，弃去上清，收集菌体，离心后的菌体沉淀悬浮于25mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，500mM NaCl，5％(v/v)glycerol，1mM TCEP， 0.5mM PMSF and 0.25mg/ml lysozyme)；

5)冰浴放置，超声破碎，每个循环26次，超声6s，间隔5s，根据破碎效果共2～4个循环，破碎后的菌体4℃18000r/min离心30min，收集上清液，放置在4℃；

6)Ni柱先用裂解缓冲液平衡，然后上样，结合30min后，每5～10min 搅拌一次，静置流干；

7)用2～3倍柱体积裂解缓冲液清洗非特异性结合蛋白，再加入15mL 洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，200mM NaCl，5％(v/v)glycerol and 1mM TCEP)洗脱，可分两次加入以增加洗脱效率。

8)表达的蛋白经TEV酶切后，进行离子交换和凝胶过滤层析，最终仍以洗脱缓冲液存储；

9)测定浓度，加入等体积甘油混匀，置于-20℃；

10)琼脂糖凝胶电泳验证CRISPR-Cas12a的“附带切割”活性：除了 CRISPR-Cas系统其他成分，在有无Cas12a存在条件下，靶序列及非特异序列是否能够被切割，如图2所示；

11)CRISPR-Cas12a实时荧光检测进一步验证：除了CRISPR-Cas系统其他成分，在有无Cas12a存在条件下，是否有荧光信号。有荧光信号，表明有靶序列及信号报告分子被切割。

实施例2：CRISPR-Cas12a检测结核分枝杆菌复合群靶序列选取及gRNA、扩增引物筛选

1)靶标选择：相比***序列IS6110，***序列IS1081在结核分枝杆菌复合群中拷贝数虽然比较低(5～7个重复序列)，但在所有的结核分枝杆菌复合群中均存在。为最大限度避免漏检，选择了***序列IS1081作为靶标，用于重组酶聚合酶扩增反应引物设计及CRISPR-Cas12a靶向检测的靶标。

2)gRNA筛选：从NCBI上获得***序列IS1081序列信息，利用 CRISPR-DT软件设计gRNA并进行评分，选择分值不低于0.5的gRNA，用IS1081质粒筛选合适gRNA。具体地，20uL体系中包含1×buffer(50 mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，100μg/ml BSA，pH [email protected] 25℃)，36nM gRNA，50nM ssDNA-FQ，50nM Cas12a，20ng/ul IS1081 质粒。所述ssDNA-FQ序列为5’-FAM-TTTTT-BHQ1-3’。37℃20min～2h，每间隔1～1.25min荧光采集器(如ABI 7500)采集FAM荧光。用于结核分枝杆菌复合群检测的gRNA序列如SEQ ID NO.3所示， 5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGACCAGGCGCUCCAUCCGGC-3’。IS1081质粒为***序列IS1081***到PUC57载体，***序列IS1081 序列SEQ ID NO.1所示。

3)RPA扩增：

RPA引物设计：参照TwistAmp assay设计手册，利用Primer Premier 5.0设计引物。利用TwistAmp assay(液态，基础款)进行优化。

RPA反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物0.24 μM，RPA下游扩增引物0.24μM，1×Reaction Buffer，1×BasicE-mix，1.8 mM dNTP，0.625μL 20×CoreReaction Mix，28mM MgOAc，待测样本基因组DNA 1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。扩增程序：恒温37℃反应 30～60min。

所选RPA扩增引物为：

上游扩增引物：5’-CCAAGCTGCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGAC-3’下游扩增引物：5’-TTGGCCATGATCGACACTTGCGACTTGGA-3’。

4)CRISPR-Cas12a结合RPA扩增进行检测：RPA扩增总体积12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物0.24μM，RPA下游扩增引物0.24μM， 1×Reaction Buffer，1×Basic E-mix，1.8mM dNTP，0.625μL 20×Core Reaction Mix，28mM MgOAc，待测样本基因组DNA 1μL，其余用DEPC 水补足12.5μL。扩增程序：恒温37℃反应60min。待反应结束后，加入 CRISPR-Cas12a体系反应成分，使得20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mMMgCl₂，100μg/ml BSA，pH [email protected]℃)， 36nM gRNA，50nM ssDNA-FQ，50nM Cas12a。恒温37℃反应120min，利用实时荧光PCR仪器荧光采集系统，每1.25～1.5min采集FAM荧光一次。原理如图1所示。

5)结果分析

上述检测过程中，由于在反应体系中加入两端分别连接荧光基团和淬灭基团的信号报告探针，当Cas12a蛋白在gRNA的帮助下，识别具有靶向序列的靶向DNA后，被激活的Cas12a酶可以降解带有该信号的信号报告探针，从而释放荧光信号，实现检测。

使用荧光检测仪得到的累积荧光值作为信号强度，按照以下标准进行分析判定：

阴性判断标准：荧光量小于或等于阴性对照荧光量的1倍。

阳性判断标准：荧光量大于阴性对照荧光量的1倍。

其中，阴性对照组为每个实验组对应设置的以加入非结核分枝杆菌核酸DNA作为模板的阴性信号组。

实施例3：反应体系灵敏度、特异性考察

1)反应体系灵敏度考察：以IS1081质粒为模板，并进行一系列梯度稀释(448.3amol，44.83amol，4.483amol，0.4483amol，0.08966amol， 0.04483amol)，以非结核分枝杆菌核酸DNA作为阴性模板，以H₂O作为空白对照，每个重复3次，对体系灵敏度进行考察。结果如图3所示。其最低检测限为0.04483amol，其线性回归方程为Y＝136613+84616x，R²＝0.973。

2)反应体系特异性考察：选取铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、黄分枝杆菌、龟分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等菌株基因组DNA做体系特异性考察，同时以结核分枝杆菌H37Rv基因组做阳性对照，以H₂O做阴性对照。结果如图4 所示。结核分枝杆菌H37Rv与其它非结核分枝杆菌复合群能区分开。

实施例4：临床痰标本基因组DNA提取及检测

选取临床痰标本193份，其中，痰培养为结核分枝杆菌复合群阳性 140份，阴性53份。所用标本经过QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)基因组提取，先行经过RPA扩增，再用CRISPR-Cas12a荧光检测系统进行检测，最后进行结果分析。最终检测结果如下：检测为结核分枝杆菌复合群阳性139份，阴性54份，与痰培养结果比较，其阳性符合率为99.3％。结果如表1所示。

表1：CRISPR-Cas12a检测痰培养样本的结果汇总表

序列表

<110> 福建医科大学孟超肝胆医院（福州市传染病医院）

<120> 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

ccaagctgcg ccagggcagc tatttcccgg ac 32

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ttggccatga tcgacacttg cgacttgga 29

<210> 3

<211> 41

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

uaauuucuac uaaguguaga ugaccaggcg cuccauccgg c 41

<210> 4

<211> 1430

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

gaacgacgcc gagccgacaa gacagccagc gcaacccgcc acgcgggcag gggggcgagg 60

caacccagca ccgccaggac gggcacggag acacggcgac gacggaggga ggagccggcg 120

cccggcagcc gggaaggcgc caacaccggg gaccgccagc gagcaccaca ccggggcacc 180

cgcacgccgg gcgggagggc aagacgccag gggggggacg ggcaggaagg ccgggggcgg 240

cgagcccaga ggggcggcac gcggacccga aacgaccagc aaaagcaacg aaggaaagac 300

gcaagacccc cacacgacac cgagcagccg gcgaccaacc gcacaggcga gcccggacgc 360

gcgcgggcgc ccgacgcacg ccgccgaggg ggcgaagccg acgcccggcg gggcgggcac 420

cgcgaacgca gcgagagcgg ccaacagcgc aacggcaccg ccaccggacg acacccggcc 480

gcaaccacga cgcgcgaccc caagcgcgcc agggcagcac ccggacggcg cgcagcgccg 540

caagcgagcg aacgcgcacg accagcgggg gcgaccgcac cgcgggagac caccgccgga 600

ggagcgccgg cgaaacacgg ggacaaagcc caagcgcaag gcgacaggcc aaagagccga 660

cgaagccgag aggcgcggac ccgcccgccg agccggcccg aacccccgcc gccgacgccc 720

gggccaaggg cgcgaggcag gccgcgcgcg gaggcacacc gacgccaccg gcgcaacgcc 780

gagggcaccg agagaccggg caccaggcac cccgccgagg acggggccgg cggcggcgcc 840

cgcgaccggc gcccgcggcc gccggggcgc gcggcaccag cgacgcccac gccggccggg 900

gccgcgacgg cgccacccgc ccgcagcggc cggcagcgcg cagaacccac acgcagccaa 960

cgaggcagcc accccgaagc ccccggccgg gggcgcaccc gcgcacccac acgaccagcc 1020

cgacgccgaa cagggcccaa agacgggacc gacgccgacc gacaaacccc cgcggggccg 1080

agcacccgac accgcccgca ccgaccgcgg cgcaccgccc cccaagcaga cggcgccaaa 1140

cggccaacaa cccccaggaa cgcccaaccg agaggacgac gccgaaccga cgcggggcac 1200

ccccgaccgc gcccgacacc gcccgcggag ccgcccgccg aacaacacga cgaaggacga 1260

aggacggcgc accgggcccg aggcccaccc gagcccgagc agcacgacca gcaccgaaga 1320

acccgccaag cagcaaacca ccaacacccc agcacgacca ccagacgcca cccgaaggac 1380

acgcgaggaa cccaccgaca ccacgcccgg ccggccgggc aggcccagcg 1430