阅读说明：本技术 Xct790在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用 (Application of XCT790 in preparing medicine for treating calcified aortic valve diseases ) 是由 胡王兴 王建安 刘先宝 于 2020-03-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及本发明涉及XCT790在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用,以及抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞分化的培养方法。在成骨诱导的体外成钙模型下,显示出了XCT790可以抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞转变,并证明其通过上调抗氧化蛋白Hmox1来起到保护作用。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了XCT790在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用,并提供了一种通过XCT790处理后可显著改善瓣膜间质细胞的体外成骨分化的方法,进而为钙化性主动脉瓣疾病提供了新的药物选择。(The invention relates to an application of XCT790 in preparing a medicament for treating calcified aortic valve diseases and a culture method for inhibiting differentiation from valve interstitial cells to osteoblasts. Under an osteogenesis-induced in vitro calcium formation model, XCT790 is shown to inhibit the conversion of valve interstitial cells to osteoblasts and proves that XCT plays a protective role by up-regulating antioxidant protein Hmox 1. The invention has the following beneficial effects: the invention provides application of XCT790 in preparing a medicament for treating calcified aortic valve diseases, and provides a method for remarkably improving in-vitro osteogenic differentiation of valve interstitial cells after XCT790 treatment, thereby providing a new medicament choice for calcified aortic valve diseases.)

XCT790在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用

(一)技术领域

本发明涉及XCT790在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用，以及抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞分化的培养方法。

(二)背景技术

钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease，CAVD)是主动脉瓣的一种进行性病变，主要表现为瓣叶的纤维增生与钙化导致瓣膜变硬，严重者可发生主动脉瓣狭窄，引起左室流出道梗阻。在发达国家，CAVD在65岁以上人群的发病率约为2％，85岁以上人群的发病率约为4％。以往的观点都认为CAVD是一种被动的退行性改变，是随者年龄增长的沉积使瓣膜退化、硬化的过程；然而近年来的基础研究表明，CAVD病变涉及内皮损伤、炎症浸润、脂质沉积，以及细胞外基质重塑、瓣膜间质细胞向成骨样表型转变等等。但是目前尚没有治疗CAVD的有效要药物，瓣膜置换成了唯一的治疗方式，但是瓣膜置换又存在自己的局限性，所以探究CAVD的具体的发病机制，寻找合适的靶点进行早期干预越来越迫切。大量的实验研究证实，瓣膜间质细胞向成骨样细胞分化在瓣膜钙化中扮演着重要角色，干预瓣膜间质细胞的成骨样分化可能是寻找治疗瓣膜钙化的有效方法。

雌激素相关受体α(ERRα)是第一个被报道的孤雌核受体，它在生物体内广泛表达，在各种生理活动中都发挥着重要作用。虽然未被发现内源性配体，但它能通过募集一些调节因子，形成一个转录复合物共同调节基因转录，在细胞能量代谢和生理功能中发挥重要作用，从而参与一些常见疾病的病理过程，例如癌症、肥胖症、糖尿病等。ERRα还在成骨细胞分化的调节中发挥重要作用，目前是治疗骨质疏松症的潜在靶点。前期研究发现，在瓣膜间质细胞中敲除ERRα可以减少瓣膜间质细胞向成骨细胞的分化。这些结果提示通过药物调节ERRα表达或活性而改善钙化性主动脉瓣疾病的可能性。

(三)

发明内容

本发明目的是提供XCT790在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用，以及抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞分化的培养方法，旨在为钙化性主动脉疾病提供一种潜在的药物选择。

本发明采用的技术方案是：

XCT790在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用。

具体的，所述XCT790用于制备干预瓣膜间质细胞的成骨样分化的药物。

进一步，所述XCT790用于制备调节ERRα表达或活性的药物。

XCT790是ERRα的一个强效特异性反向激动，它对ERRα的特异性极强，在浓度低于10uM时，XCT790对ERRγ和ERα等结构类似的相关核受体均未表现出显著拮抗作用。但在成骨诱导的体外成钙模型下，显示出了XCT790可以抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞转变，并证明其通过上调抗氧化蛋白Hmox1来起到保护作用。

本发明还涉及一种抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞分化的培养方法，所述方法包括：将传代稳定的人瓣膜间质细胞在含有XCT790的钙化培养基中诱导培养5～7天；所述含有XCT790的钙化培养基组成如下：10umol/L XCT790，10mmol/Lβ-磷酸甘油，100nmol/L地塞米松，50ug/mL维生素C，溶剂为10％FBS的高糖DMEM培养基。实验发现，经XCT790处理的人瓣膜间充质细胞在体外β-磷酸甘油，地塞米松和维生素C组成的钙化诱导培养基的条件下向成骨细胞转变明显减少。

具体的，所述诱导培养在CO₂体积浓度5％、O₂体积浓度95％的混合气体中进行。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了XCT790在制备治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用，并提供了一种通过XCT790处理后可显著改善瓣膜间质细胞的体外成骨分化的方法，进而为钙化性主动脉瓣疾病提供了新的潜在药物选择。

(四)附图说明

图1为XCT790处理改善人瓣膜间质细胞在体外钙化诱导条件下的钙化指标蛋白水平变化：NC代表常规培养条件对照组，OM+DMSO代表钙化诱导组，OM+XCT790代表XCT790处理组。

图2为XCT790处理改善人瓣膜间质细胞在体外钙化诱导条件下的碱性磷酸酶活性的变化：Ctrl代表常规培养条件对照组，OM+DMSO代表钙化诱导组，OM+XCT790代表XCT790处理组。

图3为XCT790处理改善人瓣膜间质细胞在体外钙化诱导条件下钙结节的形成变化：Ctrl代表常规培养条件对照组，OM+DMSO代表钙化诱导组，OM+XCT790代表XCT790处理组。

图4为XCT790处理改善人瓣膜间质细胞在体外钙化诱导条件下的钙含量变化：Ctrl代表常规培养条件对照组，OM+DMSO代表钙化诱导组，OM+XCT790代表XCT790处理组。

(五)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.取心脏移植受体术后主动脉瓣膜组织，存于无菌PBS中，用冰盒快速运回实验室后，在原代细胞实验台，用提前预冷的无菌PBS冲洗瓣膜，去除残余血凝块，直至瓣叶呈白色，全程应严格无菌操作并尽量缩短瓣膜离体到细胞培养之间的时间；将洗净的瓣膜组织放入含有青霉素(1000U/ml)及链霉素(1000U/ml)的无菌PBS中泡10～15分钟。

2.称取100mg二型胶原酶粉剂(购自美国Sigma-Aldrich公司)，混悬溶解于50ml无菌PBS缓冲液中，配制成2％的二型胶原酶消化液，然后用0.22um的滤网过滤，以去除消化酶工作液中的细菌，防止细胞污染。

3.将瓣膜组织放入15ml的无菌离心管中，加入3～5ml的二型胶原酶消化液，确保瓣膜与消化液完全接触，置于37℃，5％CO₂的培养箱中孵育10～15分钟。

4.孵育结束后，在细胞超净台中将瓣膜组织转移到10cm无菌培养皿中，轻轻的用无菌棉签刮去瓣膜的内皮组织。

5.将瓣膜组织置于新的10cm无菌培养皿中，用无菌眼科剪将组织剪成约1cm×1cm的组织块，然后放入T25培养瓶中，加入5～8ml 2％的二型胶原酶消化液，确保瓣膜组织与消化液完全接触，放入37℃，5％CO₂的培养箱中孵育16～18小时。注意瓣膜组织不宜剪得过小，孵育时间也不宜过长，次日及时终止孵育，防止瓣膜组织被消化过头，影响细胞存活。

6.孵育结束后，在细胞超净台，将组织消化液转移到15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清。

7.将离心后的瓣膜组织用培养液重悬后，接种于T25培养瓶中，平铺均匀，置于37℃，5％CO₂的培养箱中继续进行培养。此后每2～3天换液一次，长满80％～90％以上传代。

8.免疫印迹法检测细胞内钙化相关蛋白的表达水平：

对P5-P8代的人瓣膜间质细胞，移置于6孔板中，分别设置常规培养的阴性对照组(正常培养基)、DMSO处理的溶剂对照组(钙化培养基+DMSO溶剂)、XCT790处理组(钙化培养基+XCT790)，每隔两天换一次液，培养5天后，用RIPA buffer(购自中国碧云天生物技术有限公司)裂解后，14,000g离心30min，收集上清液冻存于-80℃备用。

其中，所用培养基如下：

正常培养基：含10％FBS的高糖DMEM培养基；

钙化培养基+DMSO溶剂：10mmol/Lβ-磷酸甘油，100nmol/L地塞米松，50umol/L维生素C，DMSO 50uL，溶剂为含10％FBS的高糖DMEM培养基，补足至50mL；

钙化培养基+XCT790：10umol/L XCT790(用DMSO 50uL溶解)，10mmol/Lβ-磷酸甘油，100nmol/L地塞米松，50ug/mL维生素C，溶剂为含10％FBS的高糖DMEM培养基，补足至50mL。

BCA法(购自美国Thermal Fisher公司)测定蛋白浓度：40μg蛋白样品在15％(v/v)SDS-PAGE胶用Hoefer Mini-Gel system(Amersham Biosciences,购自美国Piscataway公司)电泳分离，用Hoefer Transfer Tank(Amersham Biosciences，美国Piscataway公司)将蛋白转移至PVDF膜(购自美国BioRad公司)上，膜置于缓冲液[Tris缓冲盐溶液，含0.1％(v/v)Tween-20(TBS-T)，7％(w/v)牛奶，pH 7.6]室温下封闭1h，加入相应一抗(1:1000，购自美国Cell Signaling Technology公司)于4℃条件下孵育过夜；膜用0.5％(v/v)TBS-T洗涤后室温下与结合碱性磷酸酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗体(购自美国Promega公司)孵育1小时，最后TBS-T及TBS洗涤后用ECL溶液显色(购自美国Merk Millipore公司)，在Gel Doc EZImaging System中成像，用Image Lab software Quantity One软件对条带进行定量分析，实验结果见图1。

结果显示XCT790处理明显降低了钙化相关蛋白Runx2及ALP的表达。

9.应用ALP活性检测试剂盒检测人瓣膜间充质细胞内ALP的活性：

对P5-P8代的人瓣膜间质细胞，移置于6孔板中，分别设置常规培养的阴性对照组(正常培养基，同前)、DMSO处理的溶剂对照组(钙化培养基+DMSO溶剂，同前)、XCT790处理组(钙化培养基+XCT790，同前)，每隔两天换一次液，培养7天后，用RIPA buffer(购自中国碧云天生物技术有限公司)裂解后，14,000g离心30min，收集上清液用BCA法(购自美国Thermal Fisher公司)测定蛋白浓度。将50ul各组收集的蛋白上清，加入反应底物，在37℃孵育15分钟，加入终止液后在微孔板酶标仪上检测405nm波长处的吸光度数值，并计算各组活性，各组结果以阴性对照组为1进行均质化，结果如图2所示，ALP活性在溶剂对照组较阴性对照组呈明显升高，但在经XCT790处理后，ALP活性又明显下降了。

10.应用茜素红染色检测细胞外钙沉积：

对P5-P8代的人瓣膜间质细胞，移置于6孔板中，分别设置常规培养的阴性对照组(正常培养基，同前)、DMSO处理的溶剂对照组(钙化培养基+DMSO溶剂，同前)、XCT790处理组(钙化培养基+XCT790，同前)，每隔两天换一次液，培养3周后加入茜素红染液避光孵育30分钟，用PBS洗去多余的染液后，钙沉积部分会显示出棕红色，结果如图3所示，经过XCT790处理后细胞外钙沉积较溶剂对照组有明显的下降。

11.应用钙含量定量试剂盒检测细胞外钙含量：

对P5-P8代的人瓣膜间质细胞，移置于6孔板中，分别设置常规培养的阴性对照组(正常培养基，同前)、DMSO处理的溶剂对照组(钙化培养基+DMSO溶剂，同前)、XCT790处理组(钙化培养基+XCT790，同前)，每隔两天换一次液，培养2周后，用蒸馏水洗去培养基，加入0.6N HCl于4℃孵育24h，取50ul上清加入反应底物，在室温孵育5分钟，于微孔板酶标仪上检测610nm波长处的吸光度数值，各组结果以阴性对照组为1进行均质化，结果如图4所示，细胞外钙含量在溶剂对照组较阴性对照组呈明显升高，但在经XCT790处理后，细胞外钙含量又明显下降了。