醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用
阅读说明：本技术 醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用 (Application of methazolamide in preparation of medicine for treating type 1 diabetic cardiomyopathy ) 是由 侯宁 袁文常 陈晓晴 李逸朗 李从林 蔡佳璇 练宇玲 于 2021-03-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了醋甲唑胺的一种新用途,尤其是醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的新用途。本申请发明人在研究中发现,醋甲唑胺能够降低1型糖尿病心肌病的血糖、改善1型糖尿病心肌病的心脏形态结构异常和心脏收缩、舒张功能障碍,且能够改善高糖引起的心肌肥大,对于1型糖尿病心肌病的治疗具有良好的效果。本发明为1型糖尿病心肌病的治疗提供了新的药物选择。(The invention discloses a new application of methazolamide, in particular to a new application of methazolamide in preparing a medicament for treating type 1 diabetic cardiomyopathy. The inventor of the application finds in research that methazolamide can reduce blood sugar of type 1 diabetic cardiomyopathy, improve abnormal cardiac morphological structure and cardiac contraction and relaxation dysfunction of type 1 diabetic cardiomyopathy, improve myocardial hypertrophy caused by high sugar, and has a good effect on treatment of type 1 diabetic cardiomyopathy. The invention provides a new medicine selection for treating type 1 diabetic cardiomyopathy.)
技术领域
本发明涉及醋甲唑胺的一种新用途，尤其是醋甲唑胺在治疗1型糖尿病心肌病中的新应用。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由于人体完全不能分泌或不能分泌足够的胰岛素或无法有效使用胰岛素而导致血液中的葡萄糖水平升高时发生的一种慢性疾病。糖尿病是一个日益严重的全球问题。根据国际糖尿病联盟的最新报道，全球约4.25亿人(20-79岁)患有糖尿病，患病率为8.8％，预计到2045年会达到9.9％(约6.29亿)；而且，2017年，约有400万的成人(20-79岁间)死于糖尿病，占全球死亡数量的10.7％。糖尿病最常见、最严重的并发症之一则是糖尿病心肌病。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是无冠状动脉疾病或高血压的糖尿病患者心肌的结构和功能异常的病变，是导致糖尿病患者晚期死亡的重要原因之一。其特征包括心肌肥大、心肌间质及血管周围纤维化、心室舒张功能障碍、收缩功能异常和心力衰竭等。有效的血糖控制是治疗DCM的基本手段，合并控制血脂、血压等，以防治心力衰竭，延缓DCM病程；但目前仍缺乏特异性药物治疗。因此，发现新药物靶点和新型治疗药物具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的问题而提供一种醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用。本申请发明人在研究中意外发现，醋甲唑胺除了现有技术中已知的用途外，当其用于1型糖尿病心肌病时具有良好的治疗效果，为1型糖尿病心肌病的治疗提供了新的药物选择。
作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的优选实施方式，所述醋甲唑胺的剂量为10mg/kg/d。
作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的优选实施方式，所述醋甲唑胺的剂量为25mg/kg/d。
作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的优选实施方式，所述醋甲唑胺的剂量为50mg/kg/d。
作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的优选实施方式，所述醋甲唑胺在所述药物中的质量百分含量不低于5％；作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的更优选实施方式，所述醋甲唑胺在所述药物中的质量百分含量为5％～25％。
作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的优选实施方式，所述药物中还含有双胍类、噻唑烷二酮类成分中的至少一种。本发明所述醋甲唑胺应用于治疗1型糖尿病心肌病时，可以单独用药或与其它药物进行联合用药，当所述醋甲唑胺与其它药物进行联合用药时，所述其它药物包括但不限于双胍类、噻唑烷二酮类成分，所述双胍类包括但不限于二甲双胍。
作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的优选实施方式，所述醋甲唑胺能够降低1型糖尿病心肌病的血糖。本申请发明人使用链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠模型来评估醋甲唑胺(MTZ)改善糖尿病心肌病的作用，通过实验发现，在持续给药16周后，醋甲唑胺不能降低非糖尿病小鼠的血糖水平，但能降低糖尿病小鼠的随机血糖和空腹血糖，尤其是给药剂量为25mg/kg/d和50mg/kg/d时，对于糖尿病小鼠的随机血糖和空腹血糖有显著降低。
作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的优选实施方式，所述醋甲唑胺能够改善1型糖尿病心肌病的心脏形态结构异常。本申请发明人使用链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠模型来评估醋甲唑胺改善糖尿病心肌病的作用，利用苏木精-曙红和Masson染色以分析心脏形态，1型糖尿病心肌病小鼠的心脏呈现出心肌纤维混乱，肌丝断裂，细胞边界模糊以及血管周围区域严重纤维化，通过给药醋甲唑胺进行实验发现，醋甲唑胺能够治疗改善上述心脏形态结构异常，尤其是醋甲唑胺剂量为50mg/kg/d的组别改善效果更加显著。
作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的优选实施方式，所述醋甲唑胺能够改善1型糖尿病心肌病引起的心脏收缩和舒张功能障碍。本申请发明人使用链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠模型来评估醋甲唑胺改善糖尿病心肌病的作用，通过实验发现，醋甲唑胺可以改善1型糖尿病心肌病引起的收缩和舒张功能障碍，尤其是低剂量的醋甲唑胺，对于1型糖尿病心肌病引起的收缩和舒张功能障碍改善效果更加显著。
作为本发明所述醋甲唑胺在制备治疗1型糖尿病心肌病的药物中的应用的优选实施方式，所述醋甲唑胺能够改善高糖引起的心肌肥大。本申请发明人使用链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠模型来评估醋甲唑胺改善糖尿病心肌病的作用，对原代培养心肌细胞(NRCMs)进行高糖处理，建立体外糖尿病模型，进一步研究醋甲唑胺是否影响高糖环境下的心肌细胞。通过实验发现，醋甲唑胺通过降低ANP水平，减少心肌细胞大小，抑制高糖诱导的心肌肥大。
本发明使用链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠模型来评估醋甲唑胺(MTZ)改善糖尿病心肌病的作用。醋甲唑胺(MTZ)治疗显著降低了糖尿病小鼠的随机血糖和空腹血糖，并改善了葡萄糖耐量。与糖尿病组相比，醋甲唑胺(MTZ)治疗改善了糖尿病小鼠心脏的形态和心脏功能障碍。
附图说明
图1为各组小鼠心脏的苏木精-曙红染色和Masson染色的心脏形态示意图。
图2为各组小鼠免疫印迹和α-肌动蛋白免疫荧光染色结果示意图。
图2中，A和B：α-肌动蛋白染色的代表性荧光图和细胞大小测量；C：免疫印迹的代表性条带和相对蛋白水平的定量结果(n＝5)；*P<0.05或***P<0.001vs.#P<0.05或###P<0.001vs.Glu。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1本发明所述醋甲唑胺治疗1型糖尿病心肌病的效果试验
一、实验方法
1.药品及药品配制
醋甲唑胺(Selleck)
链脲佐菌素(Sigma-Aldrich)
用柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH 4.5)配制链脲佐菌素溶液；用2％二甲基亚砜：30％PEG300：2％Tween80：ddH2O溶剂制备醋甲唑胺溶液。
2.动物及分组
取C57BL/6J小鼠(8周，20±2g)在22±3℃，50-70％湿度下饲养，自由进食和饮水。随机分为2组：对照组(Control)和糖尿病组(T1DM)。适应一周后，T1DM组小鼠腹膜内注射45mg/kg/d的链脲佐菌素溶液，注射6天。注射完成3天后，将随机血糖水平≥16.7mM的小鼠视为患有1型糖尿病(T1DM)。对照组小鼠给予等体积的柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH 4.5)。在建立T1DM模型4周后，T1DM组小鼠分为4组：T1DM组和糖尿病给药组(T1DM+MTZ10、T1DM+MTZ25和T1DM+MTZ50)，给药组小鼠分别以10、25、50mg/kg/d的剂量灌胃醋甲唑胺(MTZ)溶液，持续16周。对照组小鼠分为2组：对照组(Control)和对照给药组(Control+MTZ 50)，给药组小鼠以50mg/kg/d的剂量灌胃醋甲唑胺(MTZ)溶液，持续16周。使用血糖仪每2周和4周分别监测各组小鼠的随机和空腹血糖水平。
3.超声心动图分析
经过16周的醋甲唑胺(MTZ)治疗后，小鼠的心脏功能通过带有MS-400(15MHz)线性阵列超声换能器的VisualSonics Vevo 2100成像系统(VisualSonics Inc)进行测量。在异氟烷麻醉下，在胸骨旁长轴和短轴视图中检测左心室，并在乳头肌水平的M模式下测量多个左心室功能指数。在光谱多普勒成像中测量血流动力学指数。
4.组织学分析
将新鲜的心脏用4％多聚甲醛固定，包埋在石蜡中并切片。组织切片用苏木精-曙红染色或Masson三色染色剂进行染色，以便分析。
5.细胞培养和药物处理
将新生1-3天Sprague-Dawley大鼠的心脏剪碎，并依次用胰酶和II型胶原酶消化。通过连续洗涤、分离、贴壁离心后收集心肌细胞，并在含有4.5g/L葡萄糖并补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。将新生大鼠心肌细胞(NRCMs)在含有1g/L葡萄糖和1％FBS的DMEM培养基中培养14h进行饥饿处理，然后用葡萄糖(33mM)和MTZ(25、50、100、200μM；Selleck#S4039)处理48h。后续进行免疫印迹和免疫荧光分析。
6.统计分析
数据以平均值±SEM，并采用GraphPad Prism 8.0和SPSS v18.0软件进行分析。使用one-wayANOVA进行均方差分析，或者使用Welch’s ANOVA进行方差不等分析。P<0.05被认为具有统计学意义。
二、实验结果
1.醋甲唑胺(MTZ)对糖尿病小鼠血糖的影响
与T1DM组相比，治疗2周后T1DM+MTZ10、T1DM+MTZ25和T1DM+MTZ50组观察到随机血糖降低，治疗6周后T1DM+MTZ25和T1DM+MTZ50组的随机血糖降低具有统计学差异，并在6周后保持稳定(如表1所示)。与T1DM组相比，治疗8周后T1DM+MTZ10、T1DM+MTZ25和T1DM+MTZ50组的空腹血糖降低具有统计学差异(如表2所示)。持续给药16周后，醋甲唑胺(MTZ)不能降低非糖尿病小鼠的血糖水平，但显著降低了T1DM+MTZ25和T1DM+MTZ50组小鼠的随机血糖和空腹血糖。
在T1DM+MTZ50组小鼠中观察到，醋甲唑胺(MTZ)降低了总尿糖浓度，但是醋甲唑胺(MTZ)治疗对T1DM小鼠的尿液排泄量无明显影响(如表3所示)。因此，醋甲唑胺(MTZ)的降血糖作用并不依赖于增强尿液中葡萄糖的排泄。
为了明确醋甲唑胺(MTZ)是否会影响小鼠的葡萄糖耐受，对各组小鼠进行了腹膜内葡萄糖耐受测试(IPGTT)。IPGTT后，T1DM组小鼠的血糖曲线下面积显著增加，MTZ给药显著降低T1DM小鼠的血糖曲线下面积(如表3所示)。因此，醋甲唑胺(MTZ)可以改善T1DM小鼠体内的葡萄糖稳态。
表1醋甲唑胺(MTZ)对1型糖尿病小鼠随机血糖的影响
***p<0.001versus Control group；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001versus T1DM
表2醋甲唑胺(MTZ)对1型糖尿病小鼠空腹血糖的影响
**p<0.01,***p<0.001versus Control group；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001versus T1DM
表3醋甲唑胺(MTZ)对1型糖尿病小鼠尿糖、尿量和血糖曲线下面积的影响
***p<0.001versus Control group；#p<0.05versus T1DM
2.醋甲唑胺(MTZ)对糖尿病小鼠心脏形态结构的影响
为了研究醋甲唑胺(MTZ)在T1DM心脏中的作用，收集各组小鼠心脏进一步分析。与对照组相比，T1DM组的心脏重量和体重均下降(如表4所示)。但是，醋甲唑胺(MTZ)治疗对T1DM组小鼠的心重、体重和心重/体重比无明显影响。
利用苏木精-曙红和Masson染色以分析心脏形态(结果如附图1所示)。T1DM心脏呈现出心肌纤维混乱，肌丝断裂，细胞边界模糊以及血管周围区域严重纤维化。醋甲唑胺(MTZ)治疗改善了上述心脏形态结构异常，尤其是50mg/kg MTZ处理。
表4醋甲唑胺(MTZ)对1型糖尿病小鼠体重和心脏重量的影响
**p<0.01,***p<0.001versus Control group；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001versus T1DM
3.醋甲唑胺(MTZ)对糖尿病小鼠心脏功能的影响
与对照组相比，收缩期和舒张期的T1DM心脏均呈现出较薄的左心室前壁厚度(LVAW)和左心室后壁厚度(LVPW)(如表5所示)。这些特征反映了T1DM心脏的收缩功能变差。10和50mg/kg醋甲唑胺(MTZ)治疗后，T1DM心脏的LVAW和LVPW等室壁厚度增加。而经醋甲唑胺(MTZ)治疗的非糖尿病心脏的LVAW和LVPW变化无统计学意义。频谱多普勒成像显示，T1DM心脏的E峰幅度和A峰幅度降低，以及E/A比值降低的趋势(如表5所示)。在T1DM心脏中，醋甲唑胺(MTZ)治疗增加了E峰幅度，尤其是10mg/kg剂量；另外，醋甲唑胺(MTZ)进一步降低了A峰幅度，并提高E/A比值。醋甲唑胺(MTZ)治疗不会影响非糖尿病心脏的上述指标。因此，醋甲唑胺(MTZ)可以改善T1DM引起的收缩和舒张功能障碍，尤其是低剂量的醋甲唑胺(MTZ)。
其次，对NRCMs进行高糖处理，建立体外糖尿病模型，进一步研究醋甲唑胺(MTZ)是否影响高糖环境下的心肌细胞。免疫印迹和α-肌动蛋白免疫荧光染色结果表明，高糖环境会增加心钠素(ANP)蛋白表达和心肌细胞大小(如附图2所示)。醋甲唑胺(MTZ)通过降低ANP水平，减少心肌细胞大小，抑制高糖诱导的心肌肥大。因此，醋甲唑胺(MTZ)可能在改善高糖引起的心肌肥大和T1DM的心脏功能中起重要作用。
表5醋甲唑胺(MTZ)对1型糖尿病小鼠心脏功能的影响
*p<0.05,***p<0.001versus Control group；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001versus T1DM
LVAW；s：左心室前壁厚度(收缩期)；LVAW；d：左心室前壁厚度(舒张期)；
LVPW；s：左心室后壁厚度(收缩期)；LVPW；d：左心室后壁厚度(舒张期)
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。