1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酸酯类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酸酯类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用 (Application of 1,3, 4-thiadiazole phenyl furan thiocarbamate compound in preparation of alpha-glucosidase inhibitor ) 是由 崔紫宁 王鸿 何敏 魏斌 李亚胜 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酸酯类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。本发明1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性十分显著,明显优于对照药物阿卡波糖,IC-(50)值范围为0.2μM-49.6μM,在制备预防或治疗II型糖尿病药物研发方面具有广阔的应用前景。(The invention discloses an application of 1,3, 4-thiadiazole phenyl furan thioformate compounds in preparation of alpha-glucosidase inhibitors. The 1,3, 4-thiadiazole phenyl furan thiomethyl ester compound has very obvious inhibition activity on alpha-glucosidase, and is obviously superior to a control drug acarbose and IC 50 The value range is 0.2-49.6 mu M, and the compound has wide application prospect in the research and development aspect of preparing medicaments for preventing or treating type II diabetes.)
技术领域
本发明属于化学医药技术领域。更具体地，涉及1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酸酯类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
背景技术
糖尿病是一种由胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足导致的以高血糖为特征的慢性代谢紊乱综合征。近年来，世界上糖尿病人数逐年增多，据国际糖尿病联合会(IDF)2019年发布的最新消息显示，每11位成人中就有2个糖尿病患者，而且2019年中国糖尿病患者人数位居榜首，达1.164亿，其中90％以上为II型糖尿病患者。II型糖尿病病症主要为胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗，发病前期由于肝脏葡萄糖生成增多和外周葡萄糖的摄取减少，最后导致高血糖。到目前为止，该病没有可以根治的特效药，所以口服降糖药控制餐后血糖才是关键。
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)能水解1,4-α-糖苷键，主要用于消化食物中的麦芽糖和蔗糖，食物在小肠中只有与该酶结合才能被消化吸收而导致血糖升高，所以口服一些α-葡萄糖苷酶抑制剂能延缓食物多糖分解为葡萄糖，从而减慢人体对葡萄糖的吸收，降低餐后血糖。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂是用于治疗II型糖尿病的一类特效药物，然而市场上的一些α-葡萄糖苷酶抑制剂，比如阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇这3种降糖药存在一定的副作用，比如阿卡波糖、伏格列波糖被吸收进入体内，对肝脏会造成损伤，需定期检测肝功，而合用其它降糖药时可能会发生低血糖，如患者发生低血糖时必须静脉注射或口服葡萄糖，这会给患者带来很多不便。因此，筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂并将其应用于临床具有极大的发展前景。
1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物是一种含5-苯基-2-呋喃结构的衍生物，就其结构而言，呋喃环富含电子基团，能很容易和许多生物大分子形成分子间氢键，因此含5-苯基-2-呋喃结构的化合物具有多种生物学活性，例如抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗虫等，但该类化合物是否有α-葡萄糖苷酶抑制活性尚未有相关研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酸酯类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，所述化合物的结构如式(I)所示：
式(I)中，所述R1为苯环上的取代基，其数量可以是一个或多个，所述R1任选自氢、卤素、硝基、C1～C4烷基或C1～C4烷氧基；
所述R2任选自氢、C1～C4烷基或C1～C4烷氧基。
本发明1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性是首次被报道，而且抑制活性十分显著，IC50值远小于阳性对照-阿卡波糖的IC50值。在预防或治疗由α-葡萄糖苷酶引发的相关疾病药物及其药物的研发方面具有广阔的应用前景。
优选地，所述1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物R1数量可以是一个或多个，R1任选自氢、氟、氯、溴、硝基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基；其中，所述氟、氯、溴的数量可以是多个；
R2任选自氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基。
优选地，所述1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物R1任选自氢、2-氯、3-氯、4-氯、2-氟、3-氟、4-氟、2-硝基、3-硝基、4-硝基、4-溴、4-甲基、4-甲氧基、2,4-二氟、2,6-二氟；R2任选自氢、甲基。
更优选地，所述1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物R1选自氢、3-氯、3-氟、4-甲基、4-甲氧基、4-硝基；R2为氢。
本发明同时还保护一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，包含有1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物或其药学上可接受的盐，其中所述1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物的结构如式(I)所示：
式(I)中，所述R1为苯环上的取代基，其数量可以是一个或多个，所述R1任选自氢、卤素、硝基、C1～C4烷基或C1～C4烷氧基；
所述R2任选自氢、C1～C4烷基或C1～C4烷氧基。
优选地，所述抑制剂的剂型可为粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂、悬浮剂、乳油、微乳剂或水剂。
本发明同时还保护1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗α-葡萄糖苷酶相关疾病药物中的应用。
优选地，所述α-葡萄糖苷酶相关疾病为II型糖尿病。
本发明同时还保护1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分与一种或多种药用赋形剂组成的药物组合物。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
本发明1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性是首次被报道，且抑制活性十分显著，甚至明显优于对照药物阿卡波糖，是一类新的α-葡萄糖苷酶抑制剂。该类化合物可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于预防或治疗由α-葡萄糖苷酶引发的相关疾病，如II型糖尿病，具有重要的药用价值和广泛的应用前景。
附图说明
图1为1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的浓度依赖抑制曲线；
图2为阿卡波糖和1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类衍生物14和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制类型图；
图3抑制剂14与α-葡萄糖苷酶对接模拟图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
其中，本发明α-葡萄糖苷酶为商业酶，源自酿酒酵母，购自Sigma-Aldrich(货号：G0660)。
实施例1微孔板法筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂
(1)酶的准备：精密称取购买的α-葡萄糖苷酶2mg，用磷酸盐缓冲液(PBS)配制成2mg/mL(22.10U/mL)的母液，-20℃保存待用；每次实验时将酶液准备为0.15U/mL(如取2mg/mL的母液6μL加878μL的PBS即可)。
(2)对硝基苯酚(PNP)标曲制作：配制1mM的PNP溶液(PBS溶解)，在96孔板中进行操作，每组做3个平行，分别加0、10、20、40、60、80μL 1mM的PNP溶液，用PBS补齐至100μL，使用酶标仪分别测405nM波长下0min和30min的吸光度(期间反应在37℃下孵育30min)，然后利用Excel制作散点图，得到吸光度与PNP浓度的关系式为y＝3.2617x+0.0547，其中y为吸光度，x为PNP浓度，经单位转换和去除空白干扰，在μM浓度下吸光度与PNP浓度的关系式为y＝0.003262x。
(3)α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选(抑制剂终浓度10μM)：
抑制剂：将1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物(表1化合物1-化合物30)分别用二甲基亚砜(DMSO)配成浓度为0.1mM的溶液，作为抑制剂，待用。
阳性对照：阿卡波糖(Acarbose，ACAR，购于Sigma-Aldrich)用二甲基亚砜(DMSO)配成浓度为0.1mM的溶液，作为阳性对照，待用。
底物：4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(α-PNPG，购于Sigma-Aldrich)，用PBS配成浓度为2.5mM的母液，待用。
酶：步骤(1)中配制的0.15U/mL的α-葡萄糖苷酶作为反应酶液。
IC50值的测定：测定30个1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物的IC50值，在终浓度0.001～100μM内设置一系列抑制剂浓度点(如0.001、0.01、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、30μM)，反应在96孔板中进行，反应体系如下：空白组：酶10μL+PBS 70μL+体积分数1％DMSO 10μL+2.5mM底物10μL；实验组：酶10μL+PBS 70μL+不同浓度抑制剂10μL+2.5mM底物10μL；每组设3个平行，按酶、PBS、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样，然后在酶标仪405nm波长下分别测量0min和30min的OD值(期间37℃下孵育)，通过计算得到各抑制剂在不同溶度条件下对α-葡萄糖苷酶的相对活性值，最后将抑制剂浓度点单位μM转化成nM并取10为底的导数得lg值，并以lg值为横坐标，相对活性为纵坐标，利用Graphad Prism 6.0软件画出IC50曲线图(见图1)，并经该软件分析得各抑制剂对α-葡萄糖苷酶的IC50值，各化合物IC50值见表1。
上述的具体计算过程如下：
ΔOD＝OD30min–OD0min；
ΔCPNP＝ΔOD/0.003262(0.003262为步骤(2)所得的吸光度与PNP浓度的相关性系数)
相对活性(％)＝(实验组ΔCPNP/空白组ΔCPNP)×100％；
表1 1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物的IC50值
从表1中可知，1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物对α-葡萄糖苷酶的IC50都小于阳性对照化合物ACAR，IC50值范围为0.2μM-49.6μM，对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用。
实施例2阳性对照ACAR和化合物14对α-葡萄糖苷酶的抑制类型研究
选取IC50值最小的化合物14(R为4-Me，IC50＝0.2μM)和阳性对照ACAR(IC50＝516.9μM)进行抑制类型的研究。首先将底物α-PNPG用PBS配制成浓度为2、3、5、10mM的溶液，即反应体系终浓度为200、300、500、1000μM，接着抑制剂也用PBS配制成一系列浓度梯度的溶液。比如阳性对照ACAR配制浓度为0、3000、6000、9000μM的溶液，即反应体系终浓度为0、300、600、900μM；化合物14配制浓度为0、0.2、0.5、1μM的溶液，即终浓度为0、0.02、0.05、0.1μM。以化合物14为例制作底物与抑制剂的溶度组合表，见表2。
表2底物与化合物14不同浓度点的排列组合表
注释：CPNPG表示底物终浓度，CIn表示抑制剂(化合物14)终浓度，○表示一个实验组(相当于96孔板的一个样孔)，每个浓度组合做3组平行。
然后按反应体系：酶10μL+PBS 70μL+不同浓度抑制剂10μL+不同浓度底物10μL(不同浓度的抑制剂与底物的组合见表2)，在96孔板中进行反应，每个组合设3个平行，按酶、PBS、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样加样，使用酶标仪在405nm波长下分别测量0min和30min的吸光度(期间37℃下孵育)，按实施例1步骤(3)计算过程计算不同溶度组合对应的PNP浓度差值，最后计算出1/V(μmol/min/mg)和1/PNPG值，V(μmol/min/mg)即酶的催化速度，表示在温度、pH值、底物浓度一定的条件下，每毫克酶每分钟催化产生产物的摩尔量；
计算过程如下：
1/V(μmol/min/mg)＝1/(ΔCPNP*100/10/30/1)；1/PNPG＝1/ΔCPNP；
其中ΔCPNP表示0min和30min体系中PNP的浓度差，100表示反应体系100μL，10表示酶的加入量10μL，30表示反应时间30min，1表示酶的配制溶度为1μg/mL。
最后利用Graphad Prism 6.0软件线性回归画出抑制双倒数曲线图，结果见图3，阳性对照ACAR和化合物14分别对应图3中的A、B，根据曲线交点判断抑制类型。
从图2可以看出，阳性对照ACAR和化合物14图像与y轴都有一个交点，表明化合物14和阳性对照ACAR对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类似，属于竞争性抑制。本发明化合物14在酶活反应过程中，能抢夺α-PNPG底物与α-葡萄糖苷酶的结合位点，从而抑制α-葡萄糖苷酶的降解活性。
实施例3分子对接模拟
采用分子对接(Molecular docking)的方法分析抑制活性最好的化合物14与α-葡萄糖苷酶相互作用的规律。
主要运用了MOE2014.09软件进行分子对接研究，具体实施步骤如下：由于α-葡萄糖苷酶的真实蛋白晶体结构还未解析成功，所以进行同源建模寻找与α-葡萄糖苷酶同源性高的蛋白晶体结构。从UniProt蛋白质资源数据库查找到α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(编号P53341)。在MOE-2014.0901中使用默认参数对PDB数据库进行相似性搜索，选择酿酒酵母异麦芽糖酶的晶体结构(PDB ID：3AJ7，分辨率)作为模板，其具有较高的目标序列同源性(72.4％)，基于目标模板比对建立α-葡萄糖苷酶同源模型。同源模型建立好后，接着用MOE-2014.0901准备蛋白模型结构(具体步骤为：结构准备-结构纠正-质子化-能量最小化)得到可对接的蛋白，接着准备小分子，使用MOE-2014.0901自带的画图功能画出小分子的结构式，并进行快速准备，得到可对接的小分子。最后进行分子对接，选择Site Finder自动识别蛋白的对接口袋，然后选择三角对接法进行对接，软件根据打分情况产生30个配体-蛋白复合物的构象，选择打分最好的那个构象，即为与蛋白口袋对接最优的分子构象。
图3中(A)和(B)为化合物14与α-葡萄糖苷酶同源模型蛋白的对接模拟图。从(A)图中可以发现，化合物14可以很好的进入α-葡萄糖苷酶同源模型蛋白的活性口袋空腔中。从(B)图中发现，化合物14的噻二唑的硫原子与Glu304形成了一个氢键作用力，大小为此外，化合物14又与氨基酸残基Arg312形成p-π共轭相互作用。综上，分子对接模拟很好的展示了化合物14与α-葡萄糖苷酶的相互作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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