1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用 (Application of 1,3, 4-thiadiazole phenyl furan thiomethyl ester compound in preparation of beta-glucuronidase inhibitor ) 是由 王鸿 崔紫宁 魏斌 周涛顺 李亚胜 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用,本发明1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物对大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)抑制活性十分显著,IC-(50)值范围为0.1-5.4μM,在治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻药物的研发方面具有广阔的应用前景。(The invention discloses an application of 1,3, 4-thiadiazole phenyl furan thio-methyl ester compounds in preparation of beta-glucuronidase inhibitors, wherein the 1,3, 4-thiadiazole phenyl furan thio-methyl ester compounds have obvious inhibitory activity on Escherichia coli beta-glucuronidase (EcGUS), IC is 50 The value range is 0.1-5.4 mu M, and the compound has wide application prospect in the research and development of medicaments for treating drug-induced diarrhea caused by irinotecan or non-steroidal anti-inflammatory drugs.)
(一)技术领域
本发明涉及一种1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物，特别涉及其在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的新应用，该应用有助于进一步对治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻药物的研发，属于化学医药技术领域。
(二)背景技术
伊立替康(CPT-11)，是一种常用的治疗结肠癌的药物。当它进入人体之后，会在肝脏中被代谢成无活性的SN-38葡萄糖醛酸苷(SN-38G)，随后SN-38G经胆管排泄进入肠道，肠道菌会利用自身产生的β-葡萄糖醛酸苷酶脱去SN-38G的糖基以供给自身能量需求，同时产生的SN-38在肠道中积累达到一定程度后杀伤肠道上皮细胞并造成肠粘膜不可以逆转的损伤，从而引起患者迟发性腹泻的产生，严重影响化疗进程。此外许多服用酮洛芬、双氯芬酸和吲哚美辛等含羧酸的非甾体类抗炎药也会引起类似的肠道毒性，从而引起严重的药源性腹泻。
β-葡萄糖醛酸苷酶属于糖苷酶家族2的成员，能水解β-D-连接的葡萄糖醛酸苷键。人和动物肠道内的许多微生物都可以产生β-葡萄糖醛酸苷酶，2010年有学者首次证实了抑制肠道菌β-葡萄糖苷酶能缓解CPT-11引起的药源性腹泻，随后关于肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的开发和应用受到了广泛关注。虽然肠道中的β-葡萄糖醛酸苷酶的来源不限于大肠杆菌，但大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)，在人和动物肠道中分布广泛而且又易制备，因此EcGUS常被作为肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂研究的常用靶标，选择性的抑制肠道内EcGUS的活性，可直接降低肠道内SN-38的积累，从而保护患者的肠道受损。
本发明所述1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物含5-苯基-2-呋喃结构，5-苯基-2-呋喃结构具有多种生物学活性，例如抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗虫等，最初被应用于预防和治疗植物细菌性病害方面的研究(Pestic.Biochem.Physiol.160(2019)87-94)。本发明中所列的化合物全都由华南农业大学崔紫宁教授慷慨提供(Pestic.Biochem.Physiol.160(2019)87-94)，然而该类化合物是否有EcGUS抑制活性还未有报道。
(三)
发明内容
本发明目的是提供一种1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用，有助于进一步对治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻药物的研发。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种式(I)或(II)所示1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)抑制剂中的应用，
式(I)中R为单取代或多取代，所述R为氢、卤素、硝基、C1～C4的烷基或C1～C4的烷氧基；式(II)中R同式(I)。
进一步，所述式(I)中R单取代基为：2-Cl、3-Cl、4-Cl、2-F、3-F、4-F、2-NO2、3-NO2、4-NO2、4-Br、4-Me、4-MeO、-H；式(I)中R双取代基为：2,4-di-F、2,6-di-F。
进一步，所述1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物为式(II)所示，R为3-F。
进一步，所述1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物对β-葡萄糖醛酸苷酶抑制作用的IC50值范围为0.1-5.4μM。
进一步，所述β-葡萄糖醛酸苷酶源自肠道菌，优选大肠杆菌；β-葡萄糖醛酸苷酶可以从生物化学制品公司采购，比如西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，也可以从大肠杆菌中制备。
本发明还提供一种所述1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物在制备治疗药源性腹泻药物中的应用。
进一步，所述药源性腹泻药物为治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起腹泻的药物。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
本发明中的1,3,4-噻二唑苯基呋喃硫代甲酯类化合物对EcGUS抑制活性是首次被报道，而且抑制活性十分显著，IC50值范围为0.1-5.4μM(优于阳性对照即D-葡萄糖二酸-1,4-内酯的IC50值67.3μM)，在研发治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻药物方面具有广阔的应用前景，有望进一步应用于对治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻药物的研发。
(四)附图说明
图1为纯化所得的EcGUS原酶电泳图。
图2为对硝基苯酚(PNP)标准曲线。
图3为式Ⅰ、II所示化合物和阿莫沙平(为上市的抗抑郁药，也是文献报道的对EcGUS抑制活性最强的对照药)、D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(终浓度均为10μM)对EcGUS的抑制率柱状图。
图4为化合物II-5与EcGUS分子对接结果图，A为化合物II-5与EcGUS分子对接的2D平面作用图，B为化合物II-5与EcGUS分子对接的空间位置整体图，C为化合物II-5与EcGUS分子对接的局部3D立体作用图。
(五)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明实施例所用化合物I-1～I-15和II-1～II-15的制备参考Pestic.Biochem.Physiol.160(2019)87-94。
实施例1：EcGUS抑制剂的筛选
(1)EcGUS的制备：将-80℃下保存的大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))接种到200mL含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(胰蛋白酶10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.0)中，于200rpm、37℃条件下培养至OD600达到0.5，接着加入终浓度100mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于200rpm、30℃条件下过夜培养诱导EcGUS的表达，SDS-PAGE电泳检测酶的表达情况。待表达完成后，将培养液在4℃，9000rpm条件下离心5min，收集菌体，再用PBS(pH 7.4)洗涤菌体2-3遍，然后按原菌液(离心前培养液)体积的1/10加裂解液(20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，300mM NaCl，5mM咪唑(imidazole)，体积浓度10％甘油(glycerol)，溶剂为水，pH 7.4)20mL重悬菌体，在300W，超声10s间隔10s条件下超声破碎菌体20min(置于冰上)，接着在4℃，8000rpm条件下离心10min，取上清。然后用纯净水和NTA-0缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5M氯化钠，体积溶度10％甘油，pH 7.9)各15ml分别清洗15mL的Ni-NTA琼脂糖树脂柱料(购于GE医疗公司)2～3次，再将上清与Ni-NTA琼脂糖树脂柱料在4℃下螯合3h，然后用NTA-0缓冲液，NTA-20缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5M氯化钠，体积溶度10％甘油，20mM咪唑，pH 7.9)，NTA-250缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5M氯化钠，体积溶度10％甘油，250mM咪唑，pH 7.9)各15mL分别梯度洗脱，洗脱液每5mL收集一管，分别收集到9管洗脱液，每管洗脱液均进行SDS-PAGE电泳，结果显示NTA-20缓冲液收集的4管洗脱液中含有EcGUS，且EcGUS的分子量约为71kD，然后将这4管洗脱液合并，最后使用10kD的Millipore蛋白超滤管(截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3)过滤，收集截留液即为酶液，获得EcGUS原酶液(见图1)约7mL。
(2)对硝基苯酚(PNP)标准曲线制作：配制1mM的PNP溶液(PBS溶解)，在96孔板中进行操作，每组做3个平行，分别加0，10，20，40，60，80μL 1mM的PNP溶液，用PBS补齐至100μL，在37℃下孵育30min，使用酶标仪分别测405nM波长下0min和30min的吸光度，然后利用Excel制作散点图(见图2)，得到吸光度与PNP浓度的关系式为y＝3.2617x+0.0547，其中y为吸光度，x为PNP浓度，经单位转换和去除空白干扰，在μM浓度下吸光度与PNP浓度的关系式为y＝0.003262x。
(3)EcGUS抑制剂的筛选(抑制剂终浓度10μM)：
抑制剂：将表1中式Ⅰ、II所示化合物分别用二甲基亚砜(DMSO)配成0.1mM的母液待用。
阳性对照：D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone，DSL，购于Sigma-Aldrich)和阿莫沙平(Amoxapine，AMX，目前文献报道对EcGUS抑制活性最强的阳性对照，购于Sigma-Aldrich)用二甲基亚砜(DMSO)配成0.1mM的溶液，作为阳性对照，待用。
底物：4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(β-PNPG，购于Sigma-Aldrich)，用PBS配成2.5mM的母液，待用。
酶：步骤(1)中制备的β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)，用PBS稀释500倍后用试剂盒测得浓度为1μg/mL，作为反应酶液。
反应：在96孔板中进行，反应体系(100μL)如下，空白组：酶10μL+PBS 70μL+体积浓度1％DMSO纯水溶液10μL+2.5mM底物10μL；实验组：酶10μL+PBS 70μL+0.1mM抑制剂10μL+2.5mM底物10μL；阳性对照组：酶10μL+PBS 70μL+0.1mM阳性对照10μL+2.5mM底物10μL；每组做3个平行，按酶、PBS、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样，然后使用酶标仪在405nm波长下分别测量0min和30min的OD值(期间37℃下孵育)，通过计算得到各化合物在终浓度10μM下的对EcGUS的相对活性值，并用GraphPad Prism 6.0软件画出相对活性柱状图(见图3)，30个式Ⅰ、II所示化合物的抑制活性均大于阳性对照化合物DSL，抑制率在74.6％-104.8％之间。
上述的具体计算过程如下：
ΔOD＝OD30min–OD0min；
ΔCPNP＝ΔOD/0.003262(0.003262为步骤(2)所得的吸光度与PNP浓度的相关性系数)
相对活性(％)＝实验组ΔCPNP/空白组ΔCPNP；
抑制率(％)＝1–相对活性(％)；
(4)IC50值的测定：测定30个式Ⅰ、II所示化合物的IC50值，在终浓度0.001-100μM内设置一系列抑制剂浓度点(如0.001、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1、3、10μM)，反应在96孔板中进行，反应体系(总体积为100μL)如下：空白组：酶10μL+PBS 70μL+体积分数1％DMSO纯水溶液10μL+2.5mM底物10μL；实验组：酶10μL+PBS 70μL+不同浓度抑制剂10μL+2.5mM底物10μL；每组设3个平行，按酶、PBS、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样，然后在酶标仪405nm波长下分别测量0min和30min的OD值(期间37℃下孵育)，通过计算得到各抑制剂在不同溶度条件下对EcGUS的相对活性值，最后将抑制剂浓度点微摩尔每升(μM)转化成纳摩尔每升(nM)并取10为底的导数得lg值，并以lg值为横坐标，相对活性为纵坐标，利用GraphPad Prism 6.0软件画出IC50曲线图并经该软件分析得各抑制剂对EcGUS的IC50值(各化合物IC50值见表1)，所有30个式Ⅰ、II所示化合物对EcGUS的IC50都小于阳性对照化合物DSL，达到0.08-5.4μM，而且化合物Ⅱ-5(IC50＝0.08μM)达到了AMX(IC50＝0.08μM)的体外抑制活性。
表1式Ⅰ、II所示化合物对EcGUS的半数抑制浓度(IC50值)
实施例2：分子对接模拟
采用分子对接(Molecular docking)的方法分析抑制活性最好的抑制剂Ⅱ-5与EcGUS相互作用的规律。
运用了MOE-2014.0901软件进行分子对接研究，以了解抑制剂Ⅱ-5与EcGUS的相互作用。首先从PDB数据库中下载EcGUS蛋白晶体结构(PDB ID：3K4D)，然后用MOE-2014.0901进行处理(具体步骤为：结构准备-结构纠正-质子化-能量最小化)得到可对接的蛋白，接着准备小分子Ⅱ-5，使用MOE-2014.0901自带的画图功能画出小分子的结构式，并进行快速准备，得到可对接的小分子Ⅱ-5。最后进行分子对接，选择Site Finder自动识别蛋白的对接口袋，然后选择三角对接法进行对接，软件根据打分情况产生30个配体-蛋白复合物的构象，选择打分最好的那个构象，即为与蛋白口袋对接最优的分子构象。图4中(A)、(B)和(C)给出了抑制剂Ⅱ-5与EcGUS的对接模拟图。从(A)、(C)中发现，抑制剂Ⅱ-5的羰基氧原子与氨基酸残基谷氨酸Glu413，噻二唑的氮原子与组氨酸His330都形成强氢键作用力，氢键距离分别为1.84、此外，抑制剂Ⅱ-5又与氨基酸残基酪氨酸Tyr472形成p-π共轭相互作用。最后，从(B)中也可以发现抑制剂Ⅱ-5刚好插入与活性位点残基相互作用的酶的活性口袋中。