一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法及其应用

文档序号：1265131 发布日期：2020-08-25 浏览：22次 >En<

阅读说明：本技术 一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法及其应用 (DNA detection method based on CRISPR/Cas9 and application thereof ) 是由王进科徐新慧于 2020-04-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法及其应用,该方法通过将待检DNA分子与一对dCas9-sgRNA室温孵育,形成dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物,再利用sgRNA上的捕获序列将复合物捕获到固相基质表面并捕获信号报告分子,实现靶DNA分子的检测。本发明的方法可在不经传统核酸检测中进行核酸扩增、核酸杂交等复杂、耗时环节的情况下,快速、简单地实现低至飞摩级DNA分子的检测。本发明成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和扩增等关键瓶颈问题,实现了可视化和超灵敏的DNA快速检测,在核酸检测领域具有极其广泛的应用价值。(The invention discloses a DNA detection method based on CRISPR/Cas9 and application thereof, the method comprises the steps of incubating a DNA molecule to be detected and a pair of dCas9-sgRNA at room temperature to form a dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA compound, capturing the compound on the surface of a solid phase matrix by using a capture sequence on the sgRNA, capturing a signal reporter molecule, and realizing the detection of the target DNA molecule. The method can quickly and simply realize the detection of the DNA molecules with low femtomolar level without complicated and time-consuming links such as nucleic acid amplification, nucleic acid hybridization and the like in the traditional nucleic acid detection. The invention successfully avoids the key bottleneck problems of nucleic acid hybridization, amplification and the like in the field of nucleic acid detection and typing at present, realizes visualized and ultrasensitive DNA rapid detection, and has extremely wide application value in the field of nucleic acid detection.)

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法及其应用。

背景技术

对于基础研究、各种检测及诊断应用，DNA检测和基因分型一直很重要。因此，DNA检测和基因分型技术一直受到广泛关注，从而促进了该类技术发展。归纳起来，主要有三类DNA检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术。PCR是最常用的DNA检测和基因分型技术。基于PCR的DNA检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重PCR扩增。PCR检测可以通过传统PCR(tPCR)，定量PCR(qPCR)和最近开发的数字PCR来实现。因为具有明显的优点，如实时检测和高灵敏度，Q-PCR在几乎所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字 PCR，作为临床检测工具，具有很大的潜力和优势。然而，PCR技术在用于区分高度相关的基因型时，要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除PCR技术外，DNA微阵列等多种DNA杂交技术也被广泛用于检测和分型DNA。然而，由于其昂贵的设备，复杂的检测流程和难以避免的非特异性杂交，DNA微阵列技术不能像PCR一样成为常规DNA检测和基因分型工具。DNA测序是另一种有效的DNA检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(NGS)技术的出现，诸如IlluminaNovaSeq等NGS平台的DNA测序工具越来越多。然而，由于需要昂贵的设备和化学试剂，它们仍然不能像PCR一样用于常规研究，检测和诊断。此外，近年来还开发出了各类核酸等温扩增技术用于核酸检测，如滚环扩增 (RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、多重置换扩增(MDA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖扩增(HDA)、切刻酶扩增反应(NEAR)等，但这些检测技术都依赖形形色色的目标核酸的扩增程序才能实现核酸的检测。

Ishino等人于1987年首先在大肠杆菌(E.coli)的基因组中发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)，并由Jansen等人在2002年定义为CRISPR。现在，已知的CRISPR系统包括三种不同类型(类型I，II和III)。I型和III型系统由多种Cas蛋白组成，而II型系统只需要一种Cas蛋白Cas9。Cas9与 CRISPR相关的RNA(crRNA)和反式激活的crRNA(tracrRNA)相关联。 TracrRNA能够激活Cas9核酸酶，crRNA与目标DNA的20个核苷酸序列互补。因此后者决定了CRISPR-Cas9系统的特异性。crRNA引导的Cas9核酸酶可以与原始毗邻基序(PAM)相邻的靶DNA结合，并在PAM序列(NGG)上游三个碱基处切割靶DNA。将tracrRNA和crRNA整合成一个单导向RNA(sgRNA) 后，极大地简化了II型CRISPR系统的应用。由sgRNA引导着Cas9去切割靶 DNA。目前，CRISPR-Cas9系统由于其简便性和高效性，被许多研究者广泛应用于基因组编辑领域。另外，dCas9(dead Cas9)是由Cas9改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)，dCas9 (deadCas9)作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。

尽管Cas9/sgRNA已广泛应用于基因编辑和调控，但目前还没有充分地探讨用于核酸检测领域。凭借高特异性的DNA识别及切割能力(能够区分单碱基)， Cas9/sgRNA及其他CRISPR相关核酸酶(如Cpf1等)在DNA检测和分型上有具有很大的潜力。最近，CRISPR-Cas9系统已被用于检测Zika病毒并且能够对美国和非洲Zika病毒进行分型。鉴于CRISPR的工具的高度特异性，CRISPR-Cas9 在区分病毒株时可以达到单碱基的分辨率，可以在单碱基水平上对直系同源的细菌和病毒进行分型检测。最近CRISPR系统(III型的Cas13a/C2c2)已经应用于 Zika病毒的检测并且具有超高灵敏度(病毒颗粒的量低至2aM)。这些研究表明， CRISPR系统用于开发核酸检测技术时具有很大的潜力和优势。然而，在目前报道的基于Cas9的核酸检测方法中，他们是先用待检测RNA反转录出单链DNA，再生成双链DNA，然后用Cas9/sgRNA系统切割双链DNA来达到分型RNA的目的。因此，Cas9/sgRNA系统目前尚未充分开发用于核酸的检测和分型。

基于CRISPR系统对核酸分子的序列特异性切割功能，CRISPR系统在核酸检测领域的应用正在逐步被开发。除了上述Cas9酶之外，其他Cas蛋白的应用也已经展现了在CRISPR系统在核酸检测领域的应用价值。例如，最近III型 CRISPR系统的Cas13a(也称C2c2)已经应用于Zika病毒的检测并且具有超高灵敏度(病毒颗粒的量低至2aM)(该方法被命名为Sherlock)(Science 2017； 356:438-442；Science 2018；360:439–444)。但Sherlock技术由于依赖只能切割 RNA的cas13a酶，只能用于检测RNA；若要检测DNA，需要运用重组酶扩增 (RPA)技术先对DNA进行等温扩增，扩增期间通过引物在扩增产物末端引入T7启动子序列，再进行体外转录，产生RNA，之后对RNA进行Cas13a特异切割，进而激活Cas13a对单链RNA的非特异性切割活性，达到检测DNA的目的。该检测技术依赖于重组酶扩增及体外转录，虽有利于提高检测额灵敏度，但检测过程繁琐，成本高。此外，基于Cas12a(也称为Cpf1)特异性切割靶双链DNA (dsDNA)后会非特异性单链DNA(ssDNA)的特性，发展了用于检测靶DNA 分子的新技术(该方法被命名为Detectr)(Science 2018；360:436–439)。Detectr 技术可检测amole级的分子，具有很高的灵明度，但Detectr像Sherlock一样，也依赖于一个核酸等温扩增过程，成本高且费时。与Detectr相似的另一项基于Cas12a的核酸检测技术被命名为HOLMES(Cell Research 2018；28:491–493； CellDiscovery 2018；4:20)。利用类似的原理还提出了基于Cas12b的HOLMESv2 (HOLMES2.0)技术(ACS Synth.Biol.2019；8:2228-2237)，该技术利用Cas12b 的ssDNA侧向切割活性。HOLMESv2技术也依赖于一种等温核酸扩增技术 LAMP或非对称PCR(asymmetric PCR)扩增技术。这些研究表明，CRISPR系统用于开发核酸检测技术时具有很大的潜力和优势，但目前还存在依赖于各种核酸扩增技术，必须对DNA或RNA进行反转录、体外转录、PCR扩增、RPA扩增、LAMP扩增、非对称PCR扩增等预扩增，才能用于各种Cas蛋白(Cas13a、 Cas12a、Cas12b)及gRNA的特异性切割及荧光报告分子的非特异性切割(信号放大)检测。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9 的DNA检测方法，简称为CADD，即“CRISPR/Cas9辅助的DNA检测 (CRISPR/Cas9-Assisted DNADetection)”。该方法经过三个步骤即可完成DNA 检测，本发明开发的CRISPR/Cas9的DNA检测方法，可在不经酶反应、扩增、高温杂交等复杂程序的情况下，实现低至飞摩(fM)级DNA分子的检测；此外，本方法在不经传统核酸特异性扩增(如PCR、RPA等)、高温杂交(如芯片杂交)、测序等传统程序的情况系，实现高效的DNA分子分型。

本发明还提供基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法的应用，包括在各种DNA 分子检测中的应用，特别是在检测乳头状瘤病毒(HPV)中的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于CRISPR/Cas9的DNA 检测方法，包括如下步骤：

(1)将待检DNA分子与一对dCas9-sgRNA室温孵育，形成 dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物；

(2)利用其中一个dCas9-sgRNA的sgRNA上的捕获序列将 dCas9-sgRNA-DNA复合物捕获到固相基质表面；

(3)利用另一个dCas9-sgRNA的sgRNA上的捕获序列捕获信号报告分子。

其中，步骤(1)所述一对dCas9-sgRNA是指两种dCas9-sgRNA复合物，即dCas9-sgRNAa和dCas9-sgRNAb；其中sgRNAa与sgRNAb分别具有不同的5′ 端靶DNA结合序列与3′端捕获序列。

其中，sgRNA是指单引导RNA(single-guide RNA)；其不同于常规sgRNA 的地方在于其3′端含有一种捕获序列，为一种具有捕获功能的sgRNA(capture sgRNA)。

其中，dCas9为失活Cas9(deactivated Cas9)，这种Cas9蛋白失去了切割 DNA的活性，但能与sgRNA结合并靶向结合DNA。

作为优选，所述sgRNAa的3′端捕获序列的优选序列为(SEQ ID NO.1)5′ -CGGAACCTTA CGAAT ACCAG ATGC-3′；所述sgRNAb的3′端捕获序列的优选序列为(SEQ ID NO.2)5′-TACTT CATGT TACAG ACGAC TCCCA C-3′ 或(SEQ ID NO.3)5′-ATCTA GTGGA ACCTCAAACA TACC-3′。

其中，所述sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列均为20bp长度的序列；其中在检测乳头状瘤病毒DNA分子时，sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列的优选序列为说明书序列表1所述序列。

其中，所述sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列均为20bp长度的序列，其功能为通过与靶DNA杂交引导dCas9-sgRNA复合物与靶DNA结合形成dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物所述sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列的序列分别如SEQ ID NO.4-37所示。

序列表1、靶向15种hrHPV DNA、T7 RNA聚合酶DNA及TERT启动子的sgRNA序列(按顺序为SEQ ID NO.4-37)

其中，本发明的方法可以检测任何靶DNA，在检测乳头状瘤病毒DNA分子时，sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列的优选序列为说明书序列表1中所述序列SEQ IDNO.4-33中的一对；检测大肠杆菌T7 RNA聚合酶DNA 时，sgRNAa及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列的优选序列分别为序列表1 中所述序列SEQ ID NO.34-35；在检测突变型TERT启动子DNA时，sgRNAa 及sgRNAb的5′端靶DNA结合序列的优选序列分别为序列表1述序列SEQ IDNO.36-37。

其中，步骤(2)所述利用sgRNA上的捕获序列将dCas9-sgRNA-DNA复合物捕获到固相基质表面，是指借助sgRNAa的3′端捕获序列可将 dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物捕获到一种固相基质表面。

作为优选，步骤(2)所述固相基质包括各种固相基质，如各种微球(beads) (如磁性微球、编码微球、聚合物微球等)、微孔板、玻璃片及纳米颗粒(如纳米金)等；所述固相基质表面固定有捕获寡核苷酸；其中捕获寡核苷酸的序列与 sgRNAa的3′端捕获序列碱基互补；作为优选，捕获寡核苷酸的序列为(SEQ ID NO.38)5'-GCATC TGGTA TTCGT AAGGTTCCG-3'。

其中，步骤(3)所述利用sgRNA上的捕获序列捕获信号报告分子，是指借助sgRNAb的3′端捕获序列将信号报告分子捕获到 dCas9-sgRNA-DNA-dCas9-sgRNA复合物上。

作为优选，步骤(3)所述信号报告分子为杂交链反应的发卡1；其中所述杂交链反应(Hybridization Chain Reaction，HCR)由发卡1(Hairpin 1)和发卡 2(Hairpin 2)两种DNA分子组成；其中sgRNAb的3′端捕获序列(SEQ ID NO.39)5′-TACTT CATGT TACAG ACGACTCCCA C-3′可通过杂交打开发卡1；打开的发卡1可与发卡2杂交，打开发卡2；打开的发卡2又可与发卡1杂交，打开发卡1；如此循坏，形成不断延长的DNA链；作为优选，所述发卡1 的3′端序列为(SEQ ID NO.40)5′-G TGGGA GTCGT CTGTA ACATG AAGTA-3'。

其中，杂交链反应的发卡1或发卡2或两者用荧光分子标记，用于报告检测信号；其中，杂交链反应的发卡1或发卡2也可以用淬灭基团及荧光分子双标记，制备成分子信标(molecular beacon，MB)。

作为优选，步骤(3)所述信号报告分子为生物素标记的寡核苷酸，其中生物素标记的寡核苷酸的序列与sgRNAb的3′端捕获序列碱基互补；作为优选，其中生物素标记的寡核苷酸的优选序列为(SEQ ID NO.41)5'-TTTTT TGGTA TGTTT GAGGT TCCAC TAGAT-3'。

其中，所述生物素标记的寡核苷酸，其中的生物素分子可与酶标记的链霉亲和素(streptavidin)分子结合，其中酶优选为辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)，所述辣根过氧化物酶可通过催化底物产生色素分子，用于通过检测光吸收值报告检测信号；作为优选，所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，TMB)。

作为优选，所述信号报告分子也可为纳米颗粒标记的寡核苷酸；所述纳米颗粒包括纳米金(nanogold，AuNPs)、量子点(quantum dots，QD)等；其中纳米颗粒标记生的寡核苷酸的序列与sgRNAb的3′端捕获序列碱基互补；作为优选，其中纳米颗粒标记生的寡核苷酸的序列为(SEQ ID NO.41)5'-TTTTT TGGTA TGTTT GAGGT TCCAC TAGAT-3'。

作为优选，sgRNAb的3′端捕获序列还可以设计为其他信号报告结构，如 RNAMango结构、MS2结构、滚环引物、Cas13a-sgRNA靶点等。

利用本发明的技术原理，也可以将dCas9替换为其他Cas蛋白可实现对DNA 或RNA的检测，如将dCas9替换为Cas13a或dCas13a，可实现对RNA的检测。

本发明所述的基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法在制备检测各种DNA分子的检测试剂中的应用。本发明的DNA检测方法可以应用在各种DNA分子的定性及定量检测中。

本发明所述的基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法在制备检测乳头状瘤病毒 DNA分子的检测试剂中的应用，本发明所述DNA检测方法可以应用在乳头状瘤病毒(papillomavirus，HPV)DNA分子定性及定量检测中；其中用于检测15种高危型乳头状瘤病毒的sgRNA的5′端靶DNA结合序列如序列表1所述序列 SEQ ID NO.4-33。

其中，15种高危型乳头状瘤病毒是指HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、 HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、 HPV68和HPV73。

本发明可以以任何DNA为检测材料，也可以以HPV DNA为材料，进行本发明方法的论证。此外，本发明提出的基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法，设计并证明了一套靶向hrHPV的sgRNA，已经基本上发展了一种即用型HPV临床样品检测新的技术方法。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明开发了一种基于CRSIPR/Cas9的DNA检测新方法。该方法可以简单、快速、超灵敏地对目标DNA分子进行特异性检测和分型。本发明利用了 Cas9-sgRNA复合物对其靶DNA的特异性结合特性，成功避免了目前DNA检测和分型领域中DNA杂交和扩增等关键瓶颈问题，实现了可视化、高特异性、高灵敏的DNA快速检测。本发明提出的基于CRSIPR/Cas9的DNA检测新方法，不仅在检测原理上与目前已报道的各种基于CRISPR系统的核酸检测方法(如 Sherlock、Dectectr、HOLMES)的原理完全不同，而且其最显著的优点是不依赖于对待检核酸样品的预扩增(体外转录、RPA、LAMP等)，以及不依赖于酶反应(如DNA聚合酶反应、Cas蛋白核酸切割反应等)。本发明提出的DNA检测新方法在核酸检测领域具有广泛的应用价值。

本发明提出的基于CRSIPR/Cas9的DNA检测新方法，可用非常灵活的信号报告方式实现检测信号的报告。本发明以实例论证了其中三种信号报告方式的 CADD方法，分别为Beads-HCR CADD、Beads-ELISA CADD及DNA-Bind-ELISA CADD。在三种信号报告方式中，分别使用微球杂交链反应(Beads-HCR)、微球酶联免疫吸附测定(Beads-ELISA)及DNA结合ELISA(DNA-Bind-ELISA) 进行CADD检测的信号输出方式。在Beads-HCR中，利用荧光标记的HCR发卡分子报告检测信号；在Beads-ELISA中及DNA-Bind-ELISA中，用链霉亲和素偶联的HRP催化TMB发现显色反应来报告检测信号。其中，ELISA为英文 enzyme linkedimmunosorbent assay的缩写。

综上，本发明的方法可在不经传统核酸检测中进行核酸扩增、核酸高温杂交等复杂、耗时环节的情况下，快速、简单地实现低至飞摩级DNA分子的检测。本发明利用了Cas9-sgRNA复合物对DNA分子的特异性识别和结合特性，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和扩增等关键瓶颈问题，实现了可视化和超灵敏的DNA快速检测，在核酸检测领域具有极其广泛的应用价值。本发明基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法可以应用在制备检测各种DNA分子的检测试剂中，也可以应用在制备检测乳头状瘤病毒DNA分子的检测试剂中。

附图说明

图1为Beads-HCR CADD的原理示意图，A：Beads-HCR CADD的原理示意图。dCas9，dCas9蛋白；sgRNA，引导RNA；beads，微球；Capture，捕获； Hairpin，发卡；Target DNA，靶DNA；Mix，混合；Bind，结合；HCR，杂交链反应(Hybridization Chain Reaction)；FAM，荧光素；[email protected]，附着FAM 分子的微球。B：HCR反应的液相检测。Initiator，起发子；Initiator oligo，起发子寡核苷酸。C：在含有Hairpin 1和Hairpin 2的HCR反应液里分别加入sgRNAa 和sgRNAb、sgRNAa、sgRNAb(initiator)、initiator oligo，反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测；不加入initiator oligo的反应(no initiator oligo)作为阴性对照。电泳图右边为Hairpin 1和Hairpin 2的二级结构，下边为Hairpin 1和Hairpin 2的序列及荧光修饰。

图2为用Beads-HCR CADD检测T7聚合酶DNA。A和B：用Beads-HCR CADD检测不同浓度的T7聚合酶DNA。A：Beads荧光图像；B：Beads荧光定量分析结果。在100pM和10fM间存在DNA浓度与荧光信号之间的线性关系。 C-D：用Beads-HCR CADD检测不同浓度的BL21和DH5α两种细菌的基因组 DNA(gDNA)。C：Beads荧光图像；D：Beads荧光定量分析结果。每个视野显示明场和荧光图像。

图3为用Beads-HCR CADD检测TERT启动子DNA。A：Beads荧光图像； B：Beads荧光定量分析结果。

图4为用Beads-HCR CADD检测HPV16 DNA。A和B：用Beads-HCR CADD 检测不同浓度的HPV16 DNA。所用sgRNA靶向HPV16。A：Beads荧光图像； B：Beads荧光定量分析结果。在100pM和10fM间存在DNA浓度与荧光信号之间的线性关系。C和D：用Beads-HCR CADD检测HPV16和HPV18 DNA (pMD-HPV16和pMD-HPV18)。C：Beads荧光图像；D：Beads荧光定量分析结果。所用sgRNA靶向HPV16和HPV18的sgRNA(sgRNA16和sgRNA18)。 sgRNAct(sgRNAcocktail)为靶向15种hrHPV的sgRNA的等摩尔混合物。

图5为用Beads-HCR CADD检测宫颈癌细胞株DNA。A：Beads荧光图像； B：Beads荧光定量分析结果。提取三种宫颈癌细胞株的基因组DNA(gDNA)，用靶向HPV16和HPV18的sgRNA分别检测三种gDNA样品。

图6为用Beads-HCR CADD检测HPV DNA。A和B：用Beads-HCR CADD 检测HPV16及HPV18 DNA。所用sgRNA为靶向15种hrHPV的sgRNA及 sgRNAct。A：各种sgRNA检测pMD-HPV16的Beads荧光图像；B：各种sgRNA 检测pMD-HPV18的Beads荧光定量分析结果。C-D：用Beads-HCR CADD检测 pMD-HPV16和pMD-HPV18。C：Beads荧光图像；D：Beads荧光定量分析结果。

图7为用Beads-HCR CADD检测HPV DNA。用Beads-HCR CADD检测15 种hrHPV的DNA。所用sgRNA为靶向15种hrHPV的sgRNA及sgRNAct。A： Beads荧光图像；图中仅显示每种DNA被其对应sgRNA及sgRNAct检测的荧光图像。B-C：各种sgRNA检测各种HPV DNA的Beads荧光定量分析结果。B：每种HPV DNA被其对应sgRNA(左)及sgRNAct(右)检测的Beads荧光图像的定量分析。C：每种HPV DNA被各种sgRNA检测的Beads荧光图像的定量分析。D：每种HPV DNA被各种sgRNA检测的Beads荧光图像的定量分析结果(平均荧光强度热图)。C和D图均显示每种HPV DNA只被其对应sgRNA及sgRNAct 检测出荧光信号，而其他各种sgRNA均未检测出荧光信号。

图8为用Beads-HCR CADD检测第一批HPV临床样品。用Beads-HCR CADD检测31个临床样品中是否有15种hrHPV感染。所用sgRNA为靶向15 种hrHPV的sgRNA及sgRNAct。A：Beads荧光图像；图中仅显示样品36被各种sgRNA检测的荧光图像(右侧为sgRNAct检测该样品的放大图)。B：各种 sgRNA检测31个临床样品中HPV感染的Beads荧光图像的定量分析结果(平均荧光强度热图)。C：31个临床样品中HPV感染的PCR及CADD法检测结果的比较。PCR检测由东部战区总医院完成；hrHPV：高危型HPV；PCR-rd：用特异性PCR扩增法再次检测样品2和37中HPV45以及样品11中HPV59的感染。

图9为用特异性PCR扩增法再次检测样品2和37中HPV45以及样品11中 HPV59的感染。设计一对HPV45及HPV59特异性引物，分别扩增不同DNA样品(模板(template))。

图10为用Beads-ELISA CADD检测HPV16 DNA。A：Beads-ELISA CADD 原理示意图。B：用Beads-ELISA CADD检测不同浓度的HPV16 DNA。所用 sgRNA靶向HPV16(sgRNA16)。图片显示了对TMB显色的微孔板的成像。每列为四个重复。C：TMB显色吸光度的定量分析。在100pM和1fM间存在DNA 浓度与吸光度之间的线性关系。D：用微孔板测定的吸收光谱。

图11为用Beads-ELISA CADD检测HPV DNA。用Beads-ELISA CADD检测15种hrHPV的DNA。所用sgRNA为靶向15种hrHPV的sgRNA及sgRNAct。 A：Beads-ELISA微孔板图像；图中显示每种HPV DNA被各种sgRNA检测的 Beads-ELISA微孔板图像。B：A中Beads-ELISA微孔板吸光度的定量分析结果(热图)。C：用不同的sgRNA检测由不同的两种HPV DNA混合形成的DNA 样品。图中显示了Beads-ELISA微孔板图像。D：C中Beads-ELISA微孔板吸光度的定量分析结果(热图)。E：用Beads-ELISA CADD检测HPV临床样品(考察特异性)。右侧表格显示了各孔中的DNA样品(文字)及所用sgRNA(色度：深灰色为sgRNAct；浅灰色为sgRNAsp；sgRNAsp表示特异sgRNA，即检测某种HPV的sgRNA，其种类同同列DNA样品)。

图12为用DNA-Bind-ELISA CADD检测HPV16 DNA。A：DNA-Bind-ELISA CADD原理示意图。B：用DNA-Bind-ELISA CADD检测不同浓度的HPV16 DNA。所用sgRNA靶向HPV16(sgRNA16)。图片显示了对TMB显色的微孔板的成像。每列为三个重复。C：TMB显色吸光度的定量分析。在100pM和1fM间存在 DNA浓度与吸光度之间的线性关系。

图13为用DNA-Bind-ELISA CADD检测第二批HPV临床样品。用 DNA-Bind-ELISACADD检测33个临床样品中15种hrHPV的感染情况。所用 sgRNA为靶向15种hrHPV的sgRNA及sgRNAct。A：DNA-Bind-ELISA微孔板成像；pMD-HPVct为含有15种质粒(pMD-HPV16～pMD-HPV73)的混合物，作为阳性对照；空质粒pMD作为阴性对照。B：各种sgRNA检测33个临床样品中HPV感染的DNA-Bind-ELISA吸光度定量分析结果(热图)。C：33个临床样品中HPV感染的PCR及CADD法检测结果的比较。PCR检测由东部战区总医院完成；hrHPV：高危型HPV；reCADD：用DNA-Bind-ELISA CADD再次检测5个样品中HPV的感染。D和E：用DNA-Bind-ELISACADD再次检测5个样品中HPV的感染。D：DNA-Bind-ELISA微孔板成像；E：DNA-Bind-ELISA吸光度定量分析结果(热图)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

用Beads-HCR CADD检测大肠杆菌T7 RNA聚合酶

1.1、实验方法：

1.1.1、用PCR扩增法制备sgRNA体外转录模板

使用在线sgRNA设计软件Chop-Chop(http://chopchop.cbu.uib.no/)，以hg19 为参考基因组为每种待检DNA分子设计一对sgRNA，分别命名sgRNAa和 sgRNAb，其中sgRNAa用于与固定到磁珠或微孔板表面的捕获寡核苷酸(Capture 1c)结合，sgRNAb用于与捕获报告分子的寡核苷酸结合(图1A、图10A、图 12A)。根据设计结果，合成PCR引物，用于PCR扩增制备体外转录法制备sgRNA 的DNA模板。实施例1中为待检的T7 RNA聚合酶DNA设计一对sgRNA(表 1.1)，再设计对应的PCR引物(表1.2)。

表1.1靶向T7 RNA聚合酶DNA的sgRNA(按顺序为SEQ ID NO.34-35)

表1.2、制备T7 RNA聚合酶sgRNA体外转录模板的PCR引物

引物名称	序列(5'–3')
		F1	GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTG
Ra	AAAAAAAAGCATCTGGTATTCGTAAGGTTCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC
		Rb	GTGGGAGTCGTCTGTAACATGAAGTAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC
sgRa	AAAAAAAAGCATCTGGTATTCGTAAGGTTC
		sgRb	GTGGGAGTCGTCTGTAACATGAAGTAG
T7_a_F2	CTGCGGTTGAAGCAATGAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
		T7_a_F3	TTCTAATACGACTCACTATAGCTGCGGTTGAAGCAATGAAC
T7_b_F2	CCCACACTACAGTCTTACGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
		T7_b_F3	TTCTAATACGACTCACTATAGCCCACACTACAGTCTTACGA

所有引物使用超纯水溶解并稀释成10μM。使用表1.2中列出的寡核苷酸经过三次PCR扩增出5'带有T7启动子序列的双链DNA片段，作为体外转录法制备sgRNA的DNA模板。具体过程如下：用F1和R(Ra或Rb)(7个循环)进行第一次PCR(PCR1)。用第一次PCR的产物作为模板，使用中表2所有带有 F2的序列和sgR(sgRa或sgRb)为引物进行第二次PCR(30个循环)(PCR2)；用第二次PCR的产物作为模板，用表2中所有带有F3的序列和sgR(sgRa或 sgRb)作为引物进行第三次PCR(30个循环)(PCR3)。PCR1反应体系(50μL) 为：HS(Premix；#R040A；Takara)、0.2μM F1、0.1μM R。PCR1 反应程序为：95℃3分钟；5–10个循环：95℃20秒，58℃15秒和72℃40 秒；72℃5分钟。PCR2反应体系(50μL)为：HS(Premix； #R040A；Takara)、0.2μM F2、0.2μM sgR和5–10ng PCR1反应产物。PCR2反应程序为：95℃3分钟；25个循环：95℃20秒，58℃15秒和72℃40秒；72℃ 5分钟。PCR3反应体系为：HS(Premix；#R040A；Takara)、0.2 μM F3、0.2μM sgR、5ng PCR2反应产物。PCR3反应程序为：95℃3分钟；28–30 个循环：95℃20秒，58℃15秒和72℃40秒；72℃5分钟。PCR反应程序均在PCR仪Mastercycler Pro(Eppendorf)上进行。PCR1反应结束后，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，所获得扩增产物用于下一轮PCR的模板。 PCR2和PCR3结束后反应液用PCR清洁回收试剂盒(EasyPure PCR Purification Kit，Transgen)PCR产物。

1.1.2、体外转录法制备sgRNA

将纯化后的带有T7启动子序列的sgRNA转录模板用T7 RNA聚合酶(New EnglandBiolabs)在37℃孵育过夜进行体外转录。转录反应体系(20μL)为： 50U T7 RNA聚合酶(M0251S；NEB)、1×T7 RNA聚合酶缓冲液(NEB)、2mM rNTP(each；NEB)和1000ng DNA模板。将体外转录的RNA与Trizol溶液混合，然后用氯仿和异丙醇萃取RNA产物，最后使用乙醇沉淀后，将纯化的RNA 溶解在DEPC水中，定量后将每种sgRNA稀释成工作浓度，即300nM，分装后在-80℃冻存备用。针对每种靶标DNA制备一对sgRNA(sgRNAa和sgRNAb)，各自具有与靶标DNA结合的5′端20bp特异序列以及3′端捕获序列。

实施例1中所制备的sgRNA用于检测T7 RNA聚合酶DNA，其中sgRNAa 和sgRNAb的5′端靶DNA结合序列见表1.1；sgRNAa和sgRNAb的3′端捕获序列分别为5′-CGGAA CCTTACGAAT ACCAG ATGC-3′及5′-TACTT CATGT TACAG ACGAC TCCCA C-3′。

1.1.3、杂交链反应(HCR)发卡制备

合成FAM-hairpin-1(5'-FAM-ACAGA CGACT CCCAC ATTCT CCAGG TGGGA GTCGTCTGTA ACATG AAGTA-3')及FAM-hairpin-2(5'-CTGGA GAATG TGGGA GTCGT CTGTT ACTTCATGTT ACAGA CGACT CCCAC-FAM-3')寡核苷酸。同时合成寡核苷酸Initiator(5'-TACTTCATGT TACAG ACGAC TCCCA C-3')用于液相检测hairpin-1及FAM-hairpin-2制备效果。配置5×TE缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，5mM EDTA)备用。以上寡核苷酸使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)溶解为100μM 的水溶液，作为储存液。FAM-hairpin-1和FAM-hairpin-2的工作液浓度为10μM。制备HCR发卡体(hairpin)时，各取30μL FAM-hairpin-1和FAM-hairpin-2放入两个EP管中，首先加热到95℃，维持5分钟后，自然降温到室温，4℃，保存备用。评价hairpin-1及FAM-hairpin-2制备效果的液相HCR反应体系(20μL) 包含0.2μM FAM-hairpin-1、0.2μM FAM-hairpin-2和30nM Initiator(或者 sgRNA)。混合后室温反应20分钟,电泳检测。

1.1.4、寡核苷酸修饰磁珠的制备

化学合成寡核苷酸RE-flanking(5'-Biotin-TTTTT TTGCA TCTGG TATTC GTAAGGTTCC G-3')，用作Capture 1c。该寡核苷酸使用TE缓冲液溶解为100 μM的水溶液，作为储存液。寡核苷酸RE-flanking的工作液浓度为10μM。用此寡核苷酸偶连磁珠(Dynabeads^TMM-280 Streptavidin；Invitrogen)时，先在磁珠储存瓶中摇匀磁珠，再取1μL磁珠，所取出的磁珠量为10μg，对应的磁珠数量大约为6～7×10⁵个磁珠。使用1×HCR反应缓冲液(5mMMgCl₂，0.3M NaCl， 0.1％BSA，10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)，磁分离法清洗磁珠两次后，加入2μL浓度为10μM的RE-flanking寡核苷酸，室温旋转混匀20分钟后，使用1×HCR反应缓冲液清洗磁珠3次，包被好的磁珠可在4℃放置备用。DNA包被好的磁珠被简化命名为[email protected]。

1.1.5、细菌基因组DNA及T7 RNA聚合酶DNA片段的制备

用LB液体培养基培养BL21和DH5a菌株两种细菌，用基因组DNA提取试剂盒(B610423；上海生工)分别提取20mL BL21和DH5a两种大肠杆菌的基因组DNA(gDNA)。使用超声片段化后作为HCR检测底物。从BL21 gDNA 中扩增T7 RNA聚合酶片段，PCR反应(50μL)为：HS、0.2μM T7-F、0.2μM T7-R和5ng gDNA；PCR程序为：98℃5分钟；98℃10秒，58℃ 15秒，72℃1分钟，28个循环；72℃，5分钟。扩增产物为651bp。胶回收纯化该片段作为HCR检测的底物。引物序列为：5'-GAGTT CGGCT TCCGT CAACA AGTG-3'(T7-F)和5'-GTCCA ATTGA GACTC GTGCA ACTG-3'(T7-R)。

1.1.6、Beads-HCR检测反应体系及方法

购置重组dCas9蛋白(dCas9 Nuclease,S.pyogenes，M0652，New EnglandBiolabs)、RNA酶抑制剂(RNaseOUT^TM Recombinant Ribonuclease Inhibitor，Invitrogen)。配置5×HCR反应缓冲液：25mM MgCl₂，1.5M NaCl，0.5％的BSA，溶于5×TE缓冲液。

HCR检测的反应体系：(20μL)：1×HCR反应缓冲液、15nM sgRNAa、15nM sgRNAb、30nM dCas9蛋白、1～4×10⁴[email protected]、DNA样品(具体量根据反应需要加入，见各结果图)、40U RNA酶抑制剂。室温(25℃)孵育15分钟，全程旋转混匀。

反应结束后，1×HCR反应缓冲液磁分离清洗磁珠3次。最后一次洗涤除去溶液后，向磁珠加入20μL预制的HCR反应液。HCR反应液包含：0.2μM FAM-hairpin-1、0.2μM FAM-hairpin-2、1×HCR反应缓冲液(配置方法：4μL 5×HCR反应缓冲液、0.4μL 10μM FAM-hairpin-1、0.4μL 10μM FAM-hairpin-2、 15.2μL水)。室温反应20分钟，全程旋转混匀，保持磁珠为悬浮状态。反应结束后，首先在载玻片中心位置的下方竖直放置一个直径为0.3mm，长度为1cm 的圆柱形磁铁，保持磁铁的上表面和载玻片的距离约1cm，然后将磁珠反应液重悬后滴到载玻片上，盖玻片覆盖，然后快速拿起载玻片，放置于显微镜载物台静止1分钟后，用荧光显微镜拍照检测。

磁珠的HCR结果分析流程：用Image pro程序分析荧光显微镜拍摄的图像。首先经过对众多的单分散的磁珠在显微镜下的面积信息进行统计后发现，磁珠的平均面积可认为是1600，接下来，把所有产生荧光的区域，如果面积小于1600 的认为是一个磁珠，在1600–3200之间的认为是两个磁珠，以此类推。接下来，使用Image pro软件给出的平均荧光强度乘以面积后除以这个面积对应的磁珠面积，作为这个发光区域荧光总值，然后所有有效区域的荧光总值求和后除以磁珠的真实总面积(1600*磁珠个数)，所得的平均值，作为整个视野的平均荧光值。根据每组实验结果得出对应的标准曲线和每个磁珠的平均荧光值。

1.2、实验结果：

1.2.1、Beads-HCR CADD的检测原理及HCR体系验证

图1A示意图反映了Beads-HCR CADD的检测靶DNA的原理。一对 dCas9-sgRNA(dCas9-sgRNAa与dCas9-sgRNAb)与靶DNA结合后，利用sgRNAa 上捕获序列将dCas9-sgRNA-DNA复合物抓取到微球(beads)表面；微球仅洗涤后，加入杂交链反应(HCR)的两种发卡DNA(hairpin 1和hairpin 2)，利用 sgRNAb的捕获序列与hairpin 1的杂交启动杂交链反应，结果使微球表面产生荧光信号。图1B显示了hairpin 1和hairpin 2的二级结构。

为了考察所设计的HCR反应是否可行，分别用sgRNAa+sgRNAb、sgRNAa、 sgRNAb、initiator oligo测试了所制备的hairpin 1和hairpin 2。结果如图1C所示，可见只有HCR反应中出现sgRNAb时，HCR反应才能启动，证明sgRNAb的捕获序列与hairpin 1发生杂交反应，启动了HCR反应。initiator oligo是一个阳性对照，initiator oligo也可以与hairpin 1发生杂交反应，启动了HCR反应。而不加入sgRNAb与initiator oligo的反应则不出现HCR反应。

1.2.2、T7 RNA聚合酶DNA的梯度检测

T7 RNA聚合酶DNA，所设定的梯度范围是：100pM、10pM、1pM、100fM、 10fM、1fM、0M。用Beads-HCR反应分别检测以上不同浓度的T7 RNA聚合酶DNA。结果如图2所示，其中图2A显示了检测不同浓度DNA时Beads的荧光图像，图2B是beads荧光的定量分析结果。可见Beads-HCR CADD可定量检测T7 RNA聚合酶DNA。

1.2.3、两种细菌gDNA的检测

为了进一步考察Beads-HCR CADD的检测特异性，分别提取不同数量两种大肠杆菌的基因组DNA(gDNA)，等体积溶解。用靶向T7 RNA聚合酶DNA 的sgRNA检测gDNA。结果如图2C和2D所示，其中图2C显示了检测不同数量细菌的DNA时Beads的荧光图像，图2D是beads荧光的定量分析结果。可见Beads-HCR CADD不仅可定量检测含有T7 RNA聚合酶DNA的BL21细菌，而且具有很好的特异性(不含有T7 RNA聚合酶DNA的各种浓度DH5α细菌均检测不出信号)。

实施例2

用Beads-HCR CADD检测突变型TERT启动子DNA

2.1、实验方法：

2.1.1、用PCR扩增法制备sgRNA体外转录模板

同实施例1的1.1.1。所设计的靶向突变型TERT启动子DNA的sgRNA如表2.1所示。PCR法制备sgRNA转录模板的引物见表2.2。

表2.1、靶向TERT启动子DNA的sgRNA(按顺序为SEQ ID NO.36-37)

表2.2、制备TERT启动子sgRNA体外转录模板的PCR引物

引物名称	序列(5'–3')
		F1、Ra、Rb、sgRa、sgRb	同表1.1
TERT-a-sgRNA-F2	GGACCGCGCTCCCCACGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
		TERT-a-sgRNA-F3	TTCTAATACGACTCACTATAGGGACCGCGCTCCCCACGTGG
TERT-b-sgRNA-F2	TCCCCGGCCCAGCCCCTTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
		TERT-b-sgRNA-F3	TTCTAATACGACTCACTATAGTCCCCGGCCCAGCCCCTTCC

2.1.2、体外转录法制备sgRNA

制备方法同实施例1的1.1.2。

实施例2中所制备的sgRNA用于检测突变型TERT启动子DNA，其中 sgRNAa和sgRNAb的5′端靶DNA结合序列见表2.1；sgRNAa和sgRNAb的3′ 端捕获序列分别为5′-CGGAA CCTTACGAAT ACCAG ATGC-3′及5′-TACTT CATGT TACAG ACGAC TCCCA C-3′或5′-ATCTA GTGGAACCTC AAACA TACC-3′。

2.1.3、HCR发卡制备

同实施例1的1.1.3。

2.1.4、寡核苷酸修饰磁珠的制备

同实施例1的1.1.4。

2.1.5、TERT启动子DNA片段的制备

使用提取自HepG2细胞的基因组DNA作为PCR模板，PCR反应(50μL) 为：HS、0.2μM TERT-F、0.2μM TERT-R和20ng gDNA；PCR 程序为：98℃5分钟；98℃10秒，58℃15秒，72℃1分钟，28个循环；72℃， 5分钟。扩增产物为235bp。胶回收纯化该片段作为HCR检测的底物。引物序列为：5'-AGTGG ATTCG CGGGC ACAGA -3'(TERT-F)和5'-CAGCG CTGCC TGAAA CTC-3'(TERT-R)。胶回收纯化该片段，经过测序确认这个序列中的目标碱基(rs1327649395)为野生型TERT启动子，该片段作为HCR检测的野生型TERT启动子样品。

设计一对点突变引物加框碱基为引入突变的碱基；野生型TERT启动子该位置为CG，突变型TERT启动子该位置为TA)。使用5ng从HepG2基因组扩增的野生型TERT启动子片段作为模板，分别使用 TERT-F和PM-R，PM-F和TERT-R作为扩增引物，进行PCR扩增。扩增产物经电泳切胶回收，取两种产物各20ng作为扩增模板，再使用TERT-F和TERT-R 引物，首先不加引物PCR反应5个循环后，后续23个循环加入引物继续扩增。扩增产物进行凝胶检测和切胶回收，经测序验证突变成功。该片段作为HCR检测的突变型TERT启动子样品。

2.1.6、Beads-HCR检测反应体系及方法

HCR检测的反应体系(20μL)：1×HCR反应缓冲液、15nM sgRNAa、15nM sgRNAb、30nMdCas9蛋白、1～4×10⁴[email protected]、10pM DNA、40U RNA酶抑制剂。室温(25℃)孵育15分钟，全程旋转混匀。

Beads-HCR检测程序及结果分析方法同实施例1的1.1.6。

实验结果：

用Beads-HCR反应分别检测野生型及突变型TERT启动子DNA。结果如图 3所示，其中图3A显示了检测不同浓度DNA时Beads的荧光图像，图3B是beads 荧光的定量分析结果。可见Beads-HCR CADD可特异性检测突变型TERT启动子DNA。突变型端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)启动子会引起细胞内端粒酶表达，导致细胞恶性增殖。在90％以上的肿瘤细胞中由于 TERT启动子的突变，造成端粒酶表达。

实施例3

用Beads-HCR CADD检测HPV DNA

3.1、实验方法：

3.1.1、用PCR扩增法制备sgRNA体外转录模板

同实施例1的1.1.1。所设计的靶向15种高危型HPV(high-risk HPV，hrHPV) DNA的sgRNA如表3.1所示。PCR法制备sgRNA转录模板的引物见表3.2。

表3.1、靶向15种hrHPVDNA的sgRNA。同序列表1。

表3.2、制备15种hrHPVsgRNA体外转录模板的PCR引物

3.1.2、体外转录法制备sgRNA

制备方法同实施例1的1.1.2。

实施例3中所制备的sgRNA用于检测HPV DNA，其中sgRNAa和sgRNAb 的5′端靶DNA结合序列同序列表1所述序列SEQ ID NO.4-33；sgRNAa和 sgRNAb的3′端捕获序列分别为5′-CGGAA CCTTA CGAAT ACCAG ATGC-3′及 5′-TACTT CATGT TACAG ACGAC TCCCA C-3′或5′-ATCTA GTGGA ACCTC AAACA TACC-3′。

3.1.3、HCR发卡制备

同实施例1的1.1.3。

3.1.4、寡核苷酸修饰磁珠的制备

同实施例1的1.1.4。

3.1.5、15种hrHPV L1片段克隆质粒

发明人实验室在前期研究中(Analytical and Bioanalytical Chemistry，2018，410:2889–2900)将15种hrHPV L1全长片段克隆在pMD质粒中，制备了15种 hrHPV标准品，包括pMD-HPV16、pMD-HPV18、pMD-HPV31、pMD-HPV33、 pMD-HPV35、pMD-HPV39、pMD-HPV45、pMD-HPV51、pMD-HPV52、 pMD-HPV56、pMD-HPV58、pMD-HPV59、pMD-HPV66、pMD-HPV68与 pMD-HPV73。用质粒转化大肠杆菌，碱裂解法提取各种质粒DNA以及空质粒 pMD。

3.1.6、HPV检测临床样品DNA获取及检测

使用亚能生物技术(深圳)有限公司人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)。使用该试剂盒提取宫颈细胞DNA样品。再使用该试剂盒进行HPV的检测(PCR-反向点杂交法)。共两批临床样品DNA经用此法临床检测后，第一批临床样品DNA(31个)用Beads-HCR CADD方法检测，第二批样品(33个)用DNA-Bind-ELISA CADD方法检测。

3.1.7、Beads-HCR检测反应体系及方法

单靶标HCR检测反应体系(20μL)：1×HCR反应缓冲液、15nM sgRNAa、 15nMsgRNAb、30nM dCas9蛋白、1～4×10⁴[email protected]、DNA样品(量根据需要加入)、40U RNA酶抑制剂。室温(25℃)孵育15分钟，全程旋转混匀。

多靶标HCR检测反应体系(20μL)：1×HCR反应缓冲液、15nM×N sgRNAa、15nMsgRNAb、15nM×N dCas9蛋白、1～4×10⁴[email protected]、DNA 样品(量根据需要加入)、40URNA酶抑制剂。其中N为检测的靶标数(如同时检测HPV16和HPV18，则检测的靶标数为2)。室温(25℃)孵育15分钟，全程旋转混匀。

反应程序、条件及磁珠的HCR结果分析方法同实施例1。

3.1.8、临床样品Beads-HCR检测结果的PCR验证

为了验证第一批临床样品中的2、11和37号样品的混合感染情况，设计如下引物用于分别扩增HPV45和HPV59的L1特异序列。引物序列为：5′-TTCTG TGGCC AGAGT TGTCA-3′(HPV45-test-F)、5′-ACAGT TGTTC ACGGC GTAGG-3′(HPV45-test-R)、5′-TAGGT GTTGAAATCG GTCGG G-3′ (HPV59-test-F)、5′-AGACT TGCGA CGCTT AACAC-3′(HPV59-test-R)。

首先分别使用HPV45和HPV59的克隆载体、pMD空载体、临床样品和HeLa 细胞的基因组作为模板扩增目标序列，PCR反应(50μL)为：1×Hieff^TM PCR Master Mix、0.2μM上游引物(HPV45-test-F或者HPV59-test-F)、0.2μM下游引物(HPV45-test-R或者HPV59-test-R)和模板DNA(其中，临床样品和HeLa 细胞的基因组使用量为20ng，克隆载体为1ng)；PCR程序为：98℃5分钟； 98℃10秒，58℃15秒，72℃1.5分钟，28个循环；72℃，5分钟。其中HPV45 的扩增产物为722bp，HPV59的扩增产物为1208bp。扩增产物使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

3.2、实验结果

3.2.1、HPV16质粒DNA的梯度检测

用Beads-HCR方法检测不同浓度pMD-HPV16(100pM、10pM、1pM、100 fM、10fM、1fM、100aM)。结果如图4A和4B所示，其中图4A显示了检测不同浓度DNA的Beads荧光图像，图4B是beads荧光的定量分析结果。可见 Beads-HCR CADD可定量检测pMD-HPV16 DNA。

3.2.2、HPV16和HPV18的分型检测

为了初步考察Beads-HCR方法检测HPV的特异性，首先用Beads-HCR方法检测了pMD-HPV16和pMD-HPV18。分别使用sgRNA16、sgRNA18、sgRNAct 检测1pM的pMD-HPV16和pMD-HPV18 DNA；其中sgRNAct为15种hrHPV 的特异sgRNA(sgRNAsp)的等摩尔混合物(cocktail)。结果如图4C和4D所示，其中图4C显示了检测pMD-HPV16和pMD-HPV18 DNA的Beads荧光图像，图4D是beads荧光的定量分析结果。可见Beads-HCR CADD可特异性检测两种 HPV DNA。

3.2.3、三种宫颈癌细胞gDNA的检测

为了初步考察Beads-HCR方法是否能够检测类似实际临床样品DNA中的 HPV DNA，提取三种宫颈癌细胞株的gDNA。HeLa细胞是已知HPV18感染的宫颈癌细胞株，SiHa细胞是已知HPV16感染的宫颈癌细胞株，而C-33a是无 HPV感染的宫颈癌细胞株。分别使用sgRNA16、sgRNA18、sgRNAct检测来自三种宫颈癌细胞株的gDNA。结果如图5所示，其中图5A显示了检测3个gDNA 样品的Beads荧光图像，图5B是beads荧光的定量分析结果。可见Beads-HCR CADD可特异性检测gDNA中的HPV DNA。

3.2.4、15种hrHPV的分型检测

为了能够系统检测15种hrHPV，用靶向15种hrHPV的sgRNA及sgRNAct 检测15种hrHPV的DNA(pMD-HPV16～pMD-HPV73)。将空载体pMD作为阴性对照。部分结果如图6及图7所示，其中图6A和6B显示了使用靶向15种 hrHPV的sgRNA及sgRNAct分别检测pMD-HPV16和pMD-HPV18的Beads荧光图像。可见所设计的靶向15种hrHPV的sgRNA具有很高的特异性。为了更清晰地显示beads图像，图6C和图6D显示了用靶向HPV31的sgRNA及sgRNAct 分别检测pMD-HPV31的Beads荧光图像及明场图像。图7A显示了使用靶向15 种hrHPV的sgRNA及sgRNAct分别检测15种hrHPV DNA的Beads荧光图像。图中仅呈现了每种DNA被其对应的sgRNA及sgRNAct检测的Beads荧光图像，其他sgRNA检测的阴性图像因数量众多为呈现。图7B显示了每种DNA被其对应的sgRNA及sgRNAct检测的Beads荧光图像的定量分析结果。图7C全面地显示了用15种hrHPV的sgRNA及sgRNAct分别检测15种hrHPV DNA的Beads 荧光图像的定量分析结果；图7D用热图的方式全面地显示了用15种hrHPV的 sgRNA及sgRNAct分别检测15种hrHPV DNA的Beads荧光图像的平均荧光值。从图7C及图7D可见，每种HPV DNA仅仅被其对应的sgRNA及sgRNAct能够检测出信号，而其他sgRNA均未检测出信号，阴性对照DNA pMD不能被所有 sgRNA检测出信号，可见所设计的sgRNA在检测15种hrHPV DNA时，具有很高的特异性。

3.2.5、HPV临床样品的检测

为了考察针对15种hrHPV DNA设计的sgRNA是否可用于检测HPV临床样品，使用靶向15种hrHPV的sgRNA及sgRNAct分别检测31个临床样品DNA，每个检测反应使用的DNA量均为150ng。结果如图8所示，其中图8A显示了其中用各种sgRNA检测36号样品的beads荧光图像，其中还放大显示了用 sgRNAct检测该样品的beads荧光图像及明场图像。图8C用热图的方式全面地显示了用15种hrHPV的sgRNA及sgRNAct分别检测31个临床样品的Beads 荧光图像的平均荧光值。图8C显示了用Beads-HCR CADD及PCR-反向点杂交法(图8C中PCR列所示)检测31个临床样品结果的比较，可见Beads-HCR CADD 对这些样品中15种hrHPV的感染与否(yes或no)及分型做出了准确检测；此外，Beads-HCR CADD检测还发现样品2、11及37中未被PCR-反向点杂交法检测出的混合感染；之后用特异性PCR扩增方法(PCR-rd)确证了这些混合感染 (图9)，说明本方法的检测结果更准确。

实施例4

用Beads-ELISA CADD检测HPV DNA

4.1、实验方法：

4.1.1、用PCR扩增法制备sgRNA体外转录模板

同实施例1的1.1.1。在使用PCR制备sgRNA体外转录模板是反应中，使用引物Rc替换引物Rb、使用sgRc代替sgRb。这种代替，使最终制备出的sgRNAb 具有与上述Beads-HCR检测中所使用的sgRNAb不同的3′端捕获序列，便于用于Beads-ELISA及后面的DNA-BindELISA检测。

表4.1、靶向15种hrHPV DNA的sgRNA。同序列表1。

表4.2、制备15种hrHPV sgRNA体外转录模板的PCR引物

4.1.2、体外转录法制备sgRNA

制备方法同实施例1的1.1.2。所制备sgRNAb可用于捕获寡核苷酸re-biotin。

实施例4中所制备的sgRNA用于检测HPV DNA，其中sgRNAa和sgRNAb 的5′端靶DNA结合序列同序列表1所述序列SEQ ID NO.4-33；sgRNAa和 sgRNAb的3′端捕获序列分别为5′-CGGAA CCTTA CGAAT ACCAG ATGC-3′及5′-ATCTA GTGGA ACCTC AAACA TACC-3′。

4.1.4、寡核苷酸修饰磁珠的制备

同实施例1的1.1.4。

4.1.4、Beads-ELISA检测反应体系及方法

购置10×dCas9缓冲液(100mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mM MgCl₂； 100μg/mlBSA；[email protected]℃；NEBuffer 3.1；NEB；dCas9酶自带该缓冲液；可配置了10×dCas9缓冲液)、辣根过氧化物酶偶连的链霉亲合素(HRP-conjugated Streptavidin)(0.4mg/ml)(上海生工，货号：D111054-0100)、TMP显色液(TMB Chromogen Solution for ELISA；P0209-100ml；Beyotime)。合成生物素标记的寡核苷酸re-biotin(5′-biotin-TTTTT TGGTATGTTT GAGGT TCCAC TAGAT-3′)。

单靶标检测反应(20μL)：1×HCR反应缓冲液、15nM sgRNAa、15nM sgRNAc、30nMdCas9蛋白、1～4×10⁴[email protected]、DNA样品(量根据需要加入)、40U RNA酶抑制剂。室温(25℃)孵育15分钟，全程旋转混匀。

多靶标检测反应(20μL)：1×HCR反应缓冲液、15nM×N sgRNAa(即每种 sgRNAa15nM)、15nM×N sgRNAc、15nM×N dCas9蛋白、1～4×10⁴[email protected]、 DNA样品(量根据需要加入)、40U RNA酶抑制剂。其中N为检测的靶标数(如同时检测HPV16和HPV18，则检测的靶标数为2)。室温(25C)孵育15分钟，全程旋转混匀。

反应结束后，使用含有0.5％BSA的1×dCas9缓冲液(含有10U的RNA抑制剂，下同)清洗磁珠三次(每次维持孵育3分钟以保证彻底封闭磁珠表面)，然后在最后一遍封闭后加入终浓度为0.5μM的短链re-biotin，旋转孵育3分钟，使用含有0.5％BSA的1×dCas9缓冲液清洗磁珠三次(每次分离洗涤，洗涤加入重悬后即可磁分离)，然后加入20μL 1000倍稀释的HRP-conjugated Streptavidin (原液浓度为:0.4mg/ml)，孵育3分钟后(根据经验，如果这一步延长孵育时间，会增加假阳性的可能性)，然后使用含有0.5％BSA的1×dCas9缓冲液清洗三次后(磁分离洗涤，洗涤加入重悬后即可磁分离)，转入96孔板中(此时反应体积为30μL；即最后用30μL 0.5％BSA的1×dCas9缓冲液重悬磁珠)，然后加入50μL TMP显色液，反应10分钟后使用酶标仪测定630nm的吸光值，使用 biorad凝胶成像仪在stainingfree模式下拍照，或者使用手机在白光下拍照(经过观察，碧云天的这个TMP显色液反应后30分钟内信号是稳定的，630nm吸光值和成像的亮度不变，超过30分钟会有不同程度的固体颗粒物析出，信号越强的越容易析出)(TMP显色液加入后一般5分钟即达饱和)。首先，使用酶标仪对ELISA的检测产物做全波段的吸收光检测，以确定最佳的检测波长。

4.2、实验结果

4.2.1、Beads-ELISA CADD的检测程序及原理

为了考察处理除上述HCR方法实现CADD检测方法的信号输出，本发明设计的Beads-ELISA方法。其检测原理如图10A所示，其基本原理同Beads-HCR，只是改变CADD方法第三步的信号报告体系，即让sgRNAb的3′端捕获序列杂交结合一种生物素标记的寡核苷酸re-biotin。之后用辣根过氧化物酶(HRP)偶连的链霉亲合素结合生物素，再用HRP的可溶性显色底物TMB进行酶促显色，测定光吸收值来反映CADD的检测信号。因该信号显示程序同传统的ELISA方法，因此被命名为Beads-ELISA。

4.2.2、pMD-HPV16梯度检测

使用pMD-HPV16作为检测目标，用靶向HPV16的sgRNA(sgRNA16)检测不同浓度pMD-HPV16，每个浓度检测设4个重复。结果如图10所示，其中图10B显示了TMB显色结果的微孔板成像结果；图10C显示了图10B的酶标仪630nm吸光值定量分析结果；图10D显示了酶标仪在310nm～700nm的全波段测定结果；这些结果说明Beads-ELISA方法可定量检测靶DNA。该测定中还使用pMD作为阴性对照，可见即使检测最高剂量(100pM)的pMD，也不未产生检测信号。

4.2.3、15种hrHPV的分型检测

为了进一步考察Beads-ELISA是否可检测15种hrHPV，用靶向15种hrHPV 的sgRNA及sgRNAct检测15种hrHPV的DNA(pMD-HPV16～pMD-HPV73)。将空载体pMD作为阴性对照，同时将15种hrHPV DNA的等摩尔混合物 (pMD-HPVct)作为阳性对照。结果如图11所示，其中图11A显示了使用各种 sgRNA分别检测15种hrHPV DNA的Beads-ELISA图像；图11B用热图的方式显示了图11A的定量结果。可见运用Beads-ELISA方法可特异地检测每种hrHPV DNA。

为了进一步考察Beads-ELISA是否可检测混合感染，用15种hrHPV的DNA 两两组合(混合两种DNA)模拟两种HPV混合感染。用各种sgRNA及sgRNAct 检测各种模拟混合感染样品，结果如图11C及11D所示，其中图11C显示了使用各种sgRNA分别检测各模拟混合感染样品的Beads-ELISA图像；图11D用热图的方式显示了图11C的定量结果。可见运用Beads-ELISA方法可特异地检测 hrHPV的混合感染。

为了用临床样品检测Beads-ELISA的特异性，用Beads-ELISA再次检测了数种hrHPV的DNA(pMD-HPV16～pMD-HPV73)及临床DNA样品，结果如图11E 所示，可将每种HPVDNA均被对应的sgRNA及sgRNAct检测出，而根据上述 Beads-HCR检测结果选取的单种临床样品DNA或两种临床样品DNA(150ng) 的混合物均未检测出信号，说明Beads-ELISA检测具有很好的特异性，即使在复杂的基因组DNA中，如果缺乏HPV感染，也不会出现假阳性信号。

实施例5

用DNA-Bind-ELISA CADD检测HPV DNA

5.1、实验方法：

5.1.1、用PCR扩增法制备sgRNA体外转录模板

同实施例4的4.1.1。

5.1.2、体外转录法制备sgRNA

制备方法同实施例1的1.1.2。

实施例5中所制备的sgRNA用于检测HPV DNA，其中sgRNAa和sgRNAb 的5′端靶DNA结合序列同序列表1所述序列SEQ ID NO.4-33；sgRNAa和 sgRNAb的3′端捕获序列分别为5′-CGGAA CCTTACGAAT ACCAG ATGC-3′及 5′-ATCTA GTGGA ACCTC AAACA TACC-3′。

5.1.3、DNA-Bind微孔板准备

DNA-BIND 96-well微孔板购于Corning公司；该种微孔板的表面具有 N-Oxysuccinimide基团，可用于将带氨基分子共价固定在微孔板表面。使用 DNA-BIND 96-well微孔板说明书将氨基修饰的寡核苷酸RE-NH₂(5'-NH₂-TTTTT TGCAT CTGGT ATTCGTAAGG TTCCG-3′)固定在微孔板的底部，封闭后使用保鲜膜密封后放置于4℃冰箱中备用。

5.1.2、DNA-Bind-ELISA检测反应体系及方法

单靶标检测反应(20μL)：1×HCR反应缓冲液、15nM sgRNAa、15nM sgRNAb、30nMdCas9蛋白、DNA样品(量根据需要加入)、40U RNA酶抑制剂。室温(25℃)孵育15分钟，全程旋转混匀。

多靶标检测反应(20μL)：1×HCR反应缓冲液、15nM×N sgRNAa(即每种 sgRNAa15nM)、15nM×N sgRNAb、15nM×N dCas9蛋白、DNA样品(量根据需要加入)、40U RNA酶抑制剂。其中N为检测的靶标数(如同时检测HPV16 和HPV18，则检测的靶标数为2)。室温(25℃)孵育15分钟，全程旋转混匀。

使用上述反应体系，首先在200μL EP管中进行上述检测反应。反应结束后，加入终浓度为0.5μM的寡核苷酸re-biotin，使用1×dCas9缓冲液，将反应体系扩大为80μL后转入寡核苷酸稀释的微孔板中，轻微震荡后，放在水平混匀仪上室温杂交孵育15分钟；然后使用1×dCas9缓冲液清洗3次(每次清洗都使用2000 RPM离心30sec或者瞬时离心后从孔的边缘吸走清洗液)，最后使用80μL 1×dCas9缓冲液湿润孔底后(即加入80μL 1×dCas9缓冲液)，再加入20μL 1000 倍稀释的HRP-conjugated Streptavidin(原液浓度为：0.4mg/ml)，孵育3分钟后迅速使用0.5％BSA的1×dCas9缓冲液清洗三次，然后加入30μL 1×dCas9缓冲液湿润孔底后(即加入30μL 1×dCas9缓冲液)，再加入50μL TMP显色液，反应10分钟后使用酶标仪测定630nm的吸光值，使用Biorad凝胶成像仪在 staining free模式下拍照。

5.2、实验结果

5.2.1、DNA-Bind-ELISA CADD的检测程序及原理

为了考察Beads-ELISA方法是否用其他固相载体可实现，本发明设计了 DNA-Bind-ELISA方法。其检测原理如图12A所示，其基本原理同Beads-ELISA 方法，只是改变捕获的固相载体，即将Beads-ELISA中的固相载体从beads替换成微孔板，将固定在beads表面的捕获寡核苷酸固定在微孔板中，即让sgRNAa 的3′端捕获序列与固定在微孔板中的寡核苷酸杂交结合。CADD第三步的信号报告体系完全同Beads-ELISA方法。

5.2.2、pMD-HPV16梯度检测

为了考察DNA-Bind-ELISA的可行性，首先用该方法检测不同浓度 pMD-HPV16；每个浓度设3个重复检测。结果如图12B和图12C，其中图12B 显示了检测微孔板的成像，图12B显示了图12B的定量分析结果，可见 DNA-Bind-ELISA可定量测定靶DNA pMD-HPV16。阴性对照pMD在最高浓度下也未产生信号。

5.2.3、检测第二批临床样品

用DNA-Bind-ELISA方法第二批临床样品(共33个)。每个检测反应所用临床样品的量均为150ng。结果如图13所示，其中图13A显示了微孔板显色后的成像结果；图13B用热图的方式显示了图13A的吸光度定量结果。图13C显示了用DNA-Bind-ELISA(图13C中CADD列)及PCR-反向点杂交法(图13C中 PCR列)检测33个临床样品结果及其相互比较，可见DNA-Bind-ELISA CADD 对这些样品中15种hrHPV(hrHPV)的感染与否及分型做出了准确检测；此外， DNA-Bind-ELISA CADD还检测更多的复合感染(如样品2、5、15、33)。为了确证检测结果，对5个样品进行了复检，结果如图13D和13E所示，其中图13D 显示了微孔板显色成像结果，图13E用热图的方式显示了图13D的吸光度定量分析结果。这些结果证明DNA-Bind-ELISA CADD可以用于检测临床样品中HPV 感染。

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种基于CRISPR/Cas9的DNA检测方法

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA