一种利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法
阅读说明：本技术 一种利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法 (Method for monitoring freshwater benthonic animals by utilizing environmental sediment samples ) 是由 金珂 杨江华 张效伟 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于底栖动物鉴定技术领域,公开了一种利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法,包括以下步骤：1)首先采集环境沉积物样本,清洗后保存；2)向步骤1)保存的环境沉积物样本中加入无水乙醇进行浸提处理,处理一段时间后取混合均匀的浸提液,将所述浸出液进行真空离心,弃上清液,获得干燥的组织残渣,进行DNA提取；3)利用提取得到的DNA条形码片段进行扩增,得到扩增产物；4)将扩增产物进行测序与分析。本发明的方法将样品首先采用无水乙醇浸提,使底栖动物DNA均匀释放到溶液中,达到均质的状态,通过采集含有DNA样品的乙醇溶液,离心浓缩后进行DNA提取,可实现大范围环境样品的准确监测。(The invention belongs to the technical field of benthonic animal identification, and discloses a method for monitoring freshwater benthonic animals by using an environmental sediment sample, which comprises the following steps: 1) firstly, collecting an environmental sediment sample, cleaning and then storing; 2) adding absolute ethyl alcohol into the environmental sediment sample stored in the step 1) for leaching treatment, taking the uniformly mixed leaching liquor after a period of treatment, carrying out vacuum centrifugation on the leaching liquor, discarding supernatant fluid to obtain dry tissue residues, and carrying out DNA extraction; 3) amplifying the DNA barcode fragment obtained by extraction to obtain an amplification product; 4) sequencing and analyzing the amplified product. According to the method, the sample is firstly extracted by absolute ethyl alcohol, so that DNA of the benthonic animals is uniformly released into the solution to reach a homogeneous state, and accurate monitoring of a large-range environmental sample can be realized by collecting the ethanol solution containing the DNA sample, carrying out DNA extraction after centrifugal concentration.)
技术领域
本发明属于底栖动物鉴定技术领域，具体涉及一种利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法。
背景技术
淡水大型底栖动物是流域生态健康评价的重点监测对象之一，目前的监测流程主要为采集沉积物样本、人工挑拣、形态学鉴定，这一流程有着耗时长、人力成本高、需要专家具有较高的鉴定水准等局限性。通过提取沉积物样品中的DNA，通过PCR扩增的方式对沉积物的种类进行溯源的方式可以有效克服现有技术中利用形态学鉴定存在的耗时长，人力成本高，操作繁琐的缺陷。
经检索，针对沉积物样品中生物的DNA提取方式，现有技术已有相关的申请案公开，如中国专利申请号为200510079754.1，授权公告日期为2008年12月3日的申请案公开了一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法，包括将海洋沉积物用变性溶液处理，加入沙子振荡，加入蛋白酶和溶菌酶进行裂解，再加入SDS和PVPP溶液进行进一步裂解，加入萃取剂进行处理，萃取液用异丙淀，最后用核酸吸附树脂进行纯化。
再如中国专利申请号为CN200610136833.6，公开日期为2009-06-10的申请案公开了深海沉积物总基因组的抽提方法，包括样品的处理和DNA的抽提。用无菌人工海水基本盐溶解离心收集的深海沉积样品，向实验样品中加入高浓度细胞裂解液，在沸水浴中裂解细胞，加入酚/氯仿/异戊醇混和液离心，重复抽提，收集上清液；上清液用无水乙醇沉淀，离心收集沉淀；用乙醇洗涤沉淀物，沉淀物经真空干燥，溶解沉淀，即为基因组DNA提取液。该申请案的方法运用微生物学、生物化学、分子生物学、物理学和化学的原理，以解决针对生境特殊的深海微生物的总基因组DNA提取过程中存在的效率低、通用性差、产率低、花费高、样品耗量大等问题，从而提高深海样品中DNA的产率和种类数量，使其分子生态学研究结果更全面，更准确。
COI基因是动物细胞线粒体内细胞色素氧化酶亚基一的编码基因，其序列在物种之间有较大差异，是常用的物种鉴定条形码区域之一。经检索，中国专利申请号201910840869.X，公开日期为2020.03.20申请案公开了一种底栖动物COI基因的高通量测序方法及其应用，该申请案的方法主要包括以下步骤：S1、将底栖动物混合样品的DNA样本为模板，PCR扩增COI基因；S2、以S1步骤中的PCR扩增产物为模板，进行PCR扩增，扩增的引物对包括正向引物和反向引物，所述引物对上包括焦磷酸测序高通量测序接头，每个样品对应一种焦磷酸测序高通量测序接头，得到PCR产物作为DNA文库；S3、将S2步骤中获得的DNA文库进行质量检测，然后选择合格的DNA文库进行emPCR扩增和高通量测序。该申请案的方法测序方法通量高，一次性测序即可获得COI标准条形码基因～658bp的数据，准确率高，提供了更大分类学分辨率。针对底栖动物样品，其实施例中公开的采集及处理方法为：首先，利用索伯网或彼得森采泥器在不同生境采集底栖动物样品，每个点采集3个平行样本，清洗粗挑后放入300mL标准采样品瓶内，95％酒精固定保存。使用组织基因组DNA提取试剂盒对上述准备的生物混合样品进行DNA提取，测定DNA浓度并统一稀释成终浓度5ng/μl。
基于现有技术的缺陷，亟需发明一种能够提高监测准确度，覆盖范围广的针对环境沉积物样品中淡水底栖动物监测方法。
发明内容
1.要解决的问题
现有技术中对环境沉积物样品中淡水底栖动物监测方法存在一次性采集量小，底栖动物的覆盖度低，导致的监测结果准确度低的缺陷，本发明的方法将环境沉积物样品首先采用无水乙醇浸提一段时间，使底栖动物DNA均匀释放到无水乙醇中，达到均质的状态，从而将沉积物的固体样品转化成为均一化的溶液形式，通过采集含有DNA样品的溶液进行DNA提取，可实现大范围环境样本的准确监测。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种利用环境沉积物样品中淡水底栖动物监测方法，包括以下步骤：
1)首先采集环境沉积物样本，清洗后保存；
2)向步骤1)保存的环境沉积物样本中加入无水乙醇进行浸提处理，处理一段时间后取混合均匀的浸提液，将所述浸出液进行真空离心，弃上清液，获得干燥的组织残渣，进行DNA提取；
3)利用提取得到的DNA条形码片段进行扩增，得到扩增产物；
4)将步骤3)得到的扩增产物进行测序与分析，得到底栖动物的物种信息。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)将清洗后的样本在-20℃～-80℃冷冻保存，冷冻时间为1-3天。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤2)中浸提的时间为3～30天。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤2)中，按照1g沉积物换算为1ml的换算方式向沉积物样本中加入3～5倍体积的无水乙醇。
作为本发明更进一步的改进，所述真空离心条件为：在300～1000rpm，37℃条件下离心2～3小时。
作为本发明更进一步的改进，步骤2)中使用组织DNA提取试剂盒对所述组织残渣进行DNA提取，再测定DNA浓度。
作为本发明更进一步的改进，步骤2)中使用OMEGA Tissue试剂盒对所述组织残渣进行DNA提取；使用Qubit2.0或NANODROP 2000平台测定DNA浓度。
用于扩增和测序的DNA条形码为COI基因上一段长约313bp的片段，该片段被广泛运用于大型底栖动物的DNA条形码研究。
其上游引物序列为：mlCOIintF：GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC；
其下游引物序列为：jgHCO2198：TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA。
作为本发明更进一步的改进，使用mlCOIintF-dgHCO2198引物对进行PCR扩增，所述PCR扩增条件为：
S1、构建PCR扩增体系：25μl PrimeStarMax扩增酶，5μl DNA模板，所述DNA模板总量约20ng，上下游引物各1.25μl，无酶水17.5μl；
S2、98℃预变性3分钟；
S3、98℃变性15秒，46～48℃复性30秒，72℃延伸45秒，共重复35个循环；
S4、72℃延伸5分钟，得到PCR扩增产物。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤4)包括以下步骤：
4-1)、通过高通量测序技术对所述扩增产物测序；
4-2)、测序结果在qiime、usearch等软件平台上处理，对照NCBI数据库进行物种注释；
4-3)、将所述物种注释结果进行人工筛检，作为生物监测结果。
得到的PCR扩增产物用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
作为本发明更进一步的改进，根据步骤4)的生物监测结果进一步整理得到底栖物种名单。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法，首先将沉积物样品采用无水乙醇浸提一段时间，能够使样品中底栖动物的DNA均匀释放到无水乙醇中，达到均质的状态，从而将原本为固体形态的沉积物样本转化成为溶液形式，再对溶液形式的DNA样本进行离心浓缩，进而DNA提取，这种前处理的方式更大程度上保证了样品的均匀性，可以通过采集少量的样品实现大范围的底栖动物监测，而现有技术中直接对采集得到的固体样品进行离心处理的方式，需要采集的大量的生物样品，且容易导致不均匀性。因此本发明的方法有效克服了现有技术在环境样品采集过程中存在的一次性采集量小，底栖动物的覆盖度低，导致的监测结果准确度低的缺陷。
(2)本发明的利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法，首先对沉积物样本进行冷冻处理，再解冻处理，可以使经过冷冻处理的底栖动物细胞和组织更迅速的脱落，进而使更多样本释放到无水乙醇浸提液中，保证提取的DNA样本浓度，从而更好的实现扩增需求。
(3)本发明的利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法，使底栖动物的鉴定速度大大加快。一次100个样点的流域监测，样品前处理和鉴定流程，按照现有的方法大约需要约4人的小组35个工作日，而利用本发明的监测方法，仅需1-2人约7个工作日即可完成监测过程。
(4)本发明的利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法，监测结果可靠性强。现有技术中采用形态学监测，难以保证结果的统一性：不同专家、不同操作条件，可能对同一物种产生不同的鉴定结果，本方法采取标准化的分子生物学和生物信息学流程，不同样品、不同人员的实验结果具有统一性，有利于大范围时间序列和空间序列的整体研究。
(5)本发明的利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法，提供的监测流程，包含环境样品采集、样品保存、样品前处理、分子生物学实验、生物信息学分析等一系列步骤，为淡水大型底栖动物的快速监测提供了完整且易于操作的指导，可用于环境例行监测、科学研究等多个场景。
(6)本发明的利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法，利用无水乙醇浸提的前处理方式针对底栖动物监测具有更好的针对性，对提取的样品采用mlCOIintF-dgHCO2198引物对进行PCR扩增，得到的PCR扩增结果表明大多数样品呈现出明亮、清晰的条带，实现了目标物的扩增，而且物种覆盖度高，能够监测获得形态学上极难监测实现的13种属于仙女虫科的物种，更进一步说明了本发明方法监测范围的广度。
(7)本发明的利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法，通过对比了形态学检测出各物种生物量与本方法检测出各物种序列数的定量关系，发现多个物种的生物量相对丰度对数值与序列数相对丰度对数值存在显著正相关关系(p<0.01)，说明了本发明方法的可行性与可靠性。
附图说明
图1为实施例1中对COI基因文库的检测的凝胶图谱，其中图1A～图1D分别展示了不同采集位点提取得到的DNA凝胶图谱；
图2为实施例1中各类群序列注释结果占比；
图3为实施例1中各类群OUT数目占比；
图4为实施例1中形态学检测与eDNA检测各类群物种比例对比；
图5为实施例1中形态学检测与eDNA检测定量关系拟合结果对比；图5A分别展示了颤蚯科和摇蚊科的生物量相对丰度对数值与序列数相对丰度对数值存在显著正相关关系，图5B展示了环棱螺属的生物量相对丰度对数值与序列数相对丰度对数值存在显著正相关关系；
图6为对比例A、对比例B和实施例1的三种方法得到的DNA浓度比较；
图7为实施例1的方法与对比例A中两种方法所得序列来源的比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
沉积物样本采集自江苏太湖流域的72个位点，包括河流、湖泊、水库等水体类型。以下分步骤对实施方法进行具体介绍。
(1)环境沉积物样本的采集与保存
1-1)用彼得森采泥器、三角拖网等工具采集水体底部沉积物，所述的底部沉积物包含植物残渣、底栖动物个体和少量砂石。
1-2)将所述沉积物经筛网过滤、冲洗后，基本沥干混合物水分，保存在塑封袋中，并置于-20℃～-80℃冷冻保存1-3天。
(2)环境沉积物样本的前处理
2-1)将所述沉积物样本解冻后称重，1g混合物换算为1ml的换算方式，向沉积物样本中加入3～5倍体积的无水乙醇；
2-2)使用无水乙醇浸提3～30天后，摇晃使混合均匀，稍微静置后抽取至少2ml上层液体作为浸出液，用于后续实验；
2-3)将所述的浸出液在37℃进行真空离心浓缩，在300～1000rpm，离心2～3小时。弃上清液，获得干燥的组织残渣，用于DNA提取。
(3)环境DNA样本的提取
3-1)使用OMEGA Tissue试剂盒对步骤(2)中组织残渣进行DNA提取。
3-2)使用Qubit2.0或NANODROP 2000平台测定DNA浓度。
(4)DNA条形码片段的扩增
使用mlCOIintF-dgHCO2198引物对扩增步骤(3)中的环境DNA，
其上游引物为：mlCOIintF：GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC；
其下游引物为：jgHCO2198：TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA；
具体设置步骤如下：
a)25μl的PrimeStarMax扩增酶，5μl DNA模板(总量约20ng)，上下游引物各1.25μl，无酶水17.5μl；
b)98℃预变性3分钟。
c)98℃变性15秒，46～48℃复性30秒，72℃延伸45秒，共重复35个循环。
d)72℃延伸5分钟。
e)得到的PCR产物用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到的COI基因文库的检测的凝胶图谱如图1A～图1D所示。
(5)DNA条形码扩增产物的测序与分析
f)通过高通量测序技术对步骤(4)中的扩增产物测序。
g)测序结果在qiime、usearch等软件平台上处理，对照NCBI数据库进行物种注释。
h)物种注释结果经人工筛检，作为生物监测结果使用。
本实施例得到的PCR扩增(图1)显示：在目标长度370bp附近，绝大多数样品呈现出明亮、清晰的条带。尽管存在一些非特异性扩增产物，但通过后续的纯化步骤，可以通过清除以满足测序要求。表明本发明的方法成功地利用环境样品获得了目标扩增产物。
本实施例1中各类群序列注释结果占比如图2所示，对注释进一步分析，并与同期形态学鉴定结果比较发现：
如图2所示，73个样品共计1427942条序列，455527条有注释结果。其中水生昆虫、软体动物、环节动物等主要底栖动物类群各有22670、194226、241366条，合计占序列总数的约1/3。
如图3所示，已注释的455527条序列共包含172个OTU，其中水生昆虫、软体动物、环节动物等主要底栖类群占半数。
进一步整理得到底栖物种名单。其中，摇蚊占物种总数的约1/3，水生昆虫约占物种总数的一半。14种环节动物中，有13种属于仙女虫科，这在形态学检测中是极难发现的。
图4为本实施例1中形态学检测与eDNA(本发明的方法)检测各类群物种比例对比；如图4所示，形态学检测结果中各主要类群物种数量占比与本方法检测结果相近，本方法检出物种中，摇蚊科比例较高。
绝大多数位点的优势度前三位为颤蚓科、软体动物。摇蚊科动物中，中国长足摇蚊是优势度最高的物种。71个位点中，有1个位点的第一优势物种，5个位点的第二优势物种，3个位点的第三优势物种为中国长足摇蚊。
此外，对比了形态学检测出各物种生物量与本方法检测出各物种序列数的定量关系，发现生物量相对丰度对数值与序列数相对丰度对数值存在显著正相关关系(p<0.01)，拟合结果如图5所示。图5A分别展示了颤蚯科和摇蚊科的生物量相对丰度对数值与序列数相对丰度对数值存在显著正相关关系，图5B展示了环棱螺属的生物量相对丰度对数值与序列数相对丰度对数值存在显著正相关关系。
以上结果说明了本方法用于底栖动物群落监测的可行性与可靠性。
本实施例中的对比实验为采用形态学鉴定样本的方法得到的大型底栖动物名录，对比实验的沉积物样本采集自江苏太湖流域的水厂桥、平桥、横涧、洑溪涧四个位点，均为溪流类型水体。采用形态学鉴定样本的方法得到四个位点的大型底栖动物名录。表1为本方法与形态学鉴定方法的对比结果，经对比可知：
1)在属级别，形态学鉴定检出42个不同的属，本方法检出45个不同的属。本方法检出结果中，有18个属(43％)确定为形态学鉴定出的属。
2)在科级别，形态学鉴定检出40个不同的科，本方法检出24个不同的科。本方法检出结果中，有14个科(35％)确定为形态学鉴定出的科。由此初步判断，本发明的方法在属级别上识别率最高(43％)。
表1本方法与形态学鉴定方法的对比结果
对比例A
本对比例A利用环境沉积物监测淡水底栖动物的方法基本与实施例1相同，不同之处在于：步骤1-2)中，所述沉积物样本经筛网过滤、冲洗，基本沥干混合物水分后直接置于95％酒精保存，得到沉积混合物，即未经过本发明的步骤(2)的处理。
此后将95％酒精保存(1-3天)后的沉积混合物按照后续的方式进行DNA提取，而不是提取酒精样本。
如图6所示，结果表明按照对比例A直接提取所述沉积混合物的方式得到的DNA浓度值更高，但测序获得的序列大多是浮游动物或原生动物(结果如图7所示)。由此可见，现有技术中对采集得到的固体样品直接进行提取的处理方式，虽然DNA浓度高，但由于底栖动物种类较多且在环境中分布的不均匀性，容易使结果无法涵盖大范围的完整的监测数据，造成一些物种无法监测得到。
本发明首先将沉积物采用冷冻处理后，采用无水乙醇浸提，再将乙醇提取液作为DNA提取样本，最终所得DNA浓度值虽然相对较低，但同样能满足扩增的需求，重要的是，该处理方式能够保证物种覆盖的均匀性与广度，最终测序获得序列中物种更为丰富，通过采用底栖动物的针对性引物进行DNA扩增，得到的底栖大型无脊椎动物占比更高(结果如图7所示)。
因此，相较于直接提取沉积混合物，本方法采用无水乙醇浸提，更有可能还原环境中的底栖大型无脊椎动物DNA信息。
对比例B
本对比例B的利用环境沉积物监测淡水底栖动物的方法基本与实施例1相同，不同之处在于：所述步骤1-2)中，未进行-20℃～-80℃冷冻保存，步骤2-1)中无需进行解冻处理，直接按照与实施例1相同的方式加入乙醇。
由图6显示的三种提取方式得到的DNA浓度对比可知，在-20℃～-80℃冷冻保存，并在无水乙醇浸提前进行解冻处理可以显著提高提取所得DNA的浓度值(图6，p<0.01)。因此对样品采取冷冻保存，乙醇浸提前解冻的处理方式可以使更多的样本细胞释放到浸提液中，有效保证用于扩增的DNA浓度，进而提高DNA监测效果。