阅读说明：本技术 一种棘沟赖利绦虫鉴定的pcr方法 (PCR method for identifying echinocandis labyrinthi tapeworm ) 是由 张鼎 刘晶英 杨述远 田文霞 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及一种棘沟赖利绦虫鉴定的PCR方法,属于感染家禽的赖利属绦虫种属的鉴别领域。棘沟赖利绦虫是威胁鸡健康和养殖最大的赖利属绦虫种类,目前对于棘沟赖利绦虫的鉴定仍然依赖于传统的虫体形态学特征差异分析,存在用时长、操作复杂和判断不准确等缺点。本发明参考已公布的赖利属绦虫核糖体基因序列,自主设计18s rDNA和ITS-2 rDNA引物,通过对PCR方法进行优化,准确扩增棘沟赖利绦虫18s rDNA和ITS-2 rDNA基因产物,建立一种基于18srDNA和ITS-2 rDNA双基因确认的快速、准确鉴定棘沟赖利绦虫的PCR方法。(The invention particularly relates to a PCR (polymerase chain reaction) method for identifying echinochloa lisnerica tapeworm, belonging to the field of identification of Lysidium tapeworm species infecting poultry. The echinochloa lisnerica tapeworm is the largest Lyricia tapeworm species threatening the health and cultivation of the chicken, the identification of the echinochloa lisnerica tapeworm still depends on the traditional morphological characteristic difference analysis of the polypide, and the defects of long time, complex operation, inaccurate judgment and the like exist. The invention refers to a published ribosomal gene sequence of the Lysidium tapeworm, autonomously designs 18s rDNA and ITS-2rDNA primers, and establishes a PCR method for quickly and accurately identifying the Lysidium tapeworm based on the confirmation of double genes of 18srDNA and ITS-2rDNA by optimizing a PCR method and accurately amplifying gene products of the Lysidium tapeworm 18s rDNA and ITS-2 rDNA.)

一种棘沟赖利绦虫鉴定的PCR方法

技术领域

本发明具体涉及一种棘沟赖利绦虫鉴定的PCR方法，属于感染家禽的赖利属绦虫种属的鉴别领域。

背景技术

绦虫病是严重危害鸡健康和养殖业的寄生虫疾病。寄生于鸡的绦虫隶属于扁形动物门、绦虫纲、圆叶目、戴文科的赖利属绦虫。赖利属绦虫寄生于家鸡、火鸡和雉鸡等多种家禽的小肠中，通过营养吸收和毒素释放，造成鸡发育受阻、生长缓慢、出现消瘦、贫血、中毒等症状。大量的绦虫寄生还会造成鸡肠道阻塞，诱发肠梗阻和急性炎症。鸡可以单独感染一种绦虫，也可以遭受多种绦虫的混合感染。近年来全球报道的鸡感染赖利属绦虫病例大大增加，已发现的赖利属绦虫有200多种。目前对于赖利属绦虫种类的鉴定，主要依赖于形态学特征观察，通过对虫体大小、头节形状、顶突、小钩以及孕卵节片结构等的细微差异加以区分。常规的形态学鉴定方法存在用时长、操作复杂和判断不准确等缺点，而且随着赖利属绦虫发现数量的增加，关于赖利属绦虫形态学的描述产生较大分歧，大大加大了赖利属绦虫鉴定的难度。

核糖体是细胞中广泛存在的细胞器，是细胞蛋白质合成的主要场所。真核生物的核糖体DNA(rDNA)是细胞核内编码核糖体RNA(rRNA)的基因，真核生物rDNA由重复的单拷贝基因串联组成，每个单拷贝基因由18s、5.8s和28s组成一个转录元，18s、5.8s和28s之间分别被rDNA内转录间隔区ITS1和ITS2分隔开。核糖体18S是真核生物的染色体上编码核糖体小亚基RNA的基因，在核糖体中进化速率最慢，具有高度保守性。ITS序列是核糖体DNA中介于18S和28S之间的内转录间隔区，核糖体DNA第一内转录间隔区ITS1位于18S rDNA和5.8SrDNA之间的，核糖体DNA第二内转录间隔区位于5.8S rDNA和28S rDNA之间。近年来随着寄生虫基因测序数据的完善，18s和ITS2被广泛用于寄生虫属内、种内鉴定及遗传进化关系分析。棘沟赖利绦虫是威胁鸡健康和养殖最大的赖利属绦虫种类，本发明的目的在于提供一种快速、准确鉴定棘沟赖利绦虫的PCR方法，解决传统棘沟赖利绦虫种属鉴定缺点。

发明内容

棘沟赖利绦虫是威胁鸡健康和养殖最大的赖利属绦虫种类，目前对于棘沟赖利绦虫的鉴定仍然依赖于传统的虫体形态学特征，存在用时长、操作复杂和判断不准确等缺点。本发明参考已公布的赖利属绦虫核糖体基因序列，自主设计18s rDNA和ITS-2 rDNA引物，通过对PCR方法进行优化，准确扩增棘沟赖利绦虫18s rDNA和ITS-2 rDNA基因产物，建立一种基于18s rDNA和ITS-2 rDNA双基因确认的快速、准确鉴定棘沟赖利绦虫的PCR方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种棘沟赖利绦虫鉴定的PCR方法，提供棘沟赖利绦虫种属鉴定的18s rDNA和ITS-2 rDNA两种基因检测引物，所述方法包括以下步骤：

步骤1，棘沟赖利绦虫的收集与形态学鉴别：收集绦虫感染鸡病例，放血法处死病鸡，取出完整消化道，小心剪开肠道，将发现的绦虫与肠道一起置于清水中，待绦虫头节脱离肠黏膜并充分舒展后转入生理盐水中清洗，清洗干净后将每条虫体进行单独保存，一部分虫体冻存于-80℃冰箱，准备提取虫体DNA，一部分虫体固定于戊二醛水溶液中，做扫描电镜观察，一部分虫体置于多聚甲醛水溶液中固定，做苏木素-伊红染色；

步骤2，DNA提取：绦虫虫体30mg，用组织DNA提取试剂盒提取绦虫虫体DNA；

步骤3，PCR扩增：

(1)引物设计：

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18s rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：18s-F:5′-CTGAGAAACGGCTACCACT-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18s rDNA基因下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：18s-R:5′-ACGCCAGACGAACTACAC-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的ITS-2 rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ITS-2-F:5′-TATTGCGGCCATAGGTTT-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的ITS-2 rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：ITS-2-R:5′-CGTGAGTACCCGCTGAAC-3′；

(2)PCR反应：

准备第一PCR反应管和第二PCR反应管，第一PCR反应管中加入2×MasterMix，步骤2提取的绦虫虫体DNA为模板，18s rDNA上、下游引物，去离子水，进行PCR反应；第二PCR反应管中加入2×MasterMix，步骤2提取的绦虫虫体DNA为模板，ITS-2 rDNA上、下游引物，去离子水，进行PCR反应；制备琼脂糖凝胶溶液用TAE电泳缓冲液，凝胶凝固前GelRed荧光染料，以示踪凝胶电泳中的PCR扩增产物；凝胶凝固后向点样孔中加入PCR扩增产物溶液，在电压条件下电泳，在凝胶成像仪下观察PCR扩增产物分子大小及电泳条带清晰度，拍照；

步骤4，PCR扩增产物测序：用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将第一PCR反应管和第二PCR反应管PCR扩增产物的电泳条带进行回收，分别将回收得到的18s rDNA与ITS-2 rDNAPCR扩增产物与pMD19-T载体连接，连接pMD19-T载体后转化入DH5α感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基对pMD19-T载体转化的DH5α感受态细胞进行阳性筛选，阳性菌落扩大培养后对菌落进行PCR测序，获得18s rDNA和ITS-2 rDNA PCR扩增产物基因序列；

步骤5，序列分析：分别将18s rDNA和ITS-2rDNA PCR扩增产物基因序列与GenBank数据库中公布的赖利属绦虫18s rDNA、ITS-2 rDNA序列进行比对，用MEGA软件分别将18srDNA和ITS-2rDNA PCR扩增产物基因序列与已公布的序列进行遗传进化关系分析。

进一步，所述步骤1中戊二醛水溶液的体积分数为2.5％，配方为：10mL体积分数为25％戊二醛水溶液加入50mL 0.2M磷酸缓冲液和40mL蒸馏水，调PH＝7.4，加入蒸馏水补至100mL，其中0.2M磷酸缓冲液配方为：向磷酸二氢钠2.6g和磷酸氢二钠29g中加入蒸馏水补至500mL，调PH＝7.4；

扫描镜观察具体步骤为：剪取1～2cm用体积分数为2.5％戊二醛水溶液固定4h的虫体片段，用含质量/体积分数1％g/mL四氧化锇的0.2M的甲次砷酸钠水溶液孵育1h，梯度乙醇脱水，CO₂临界点干燥和喷金后置于扫描电子显微镜下观察。

进一步，所述梯度乙醇的梯度为：体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％。

进一步，所述步骤1中多聚甲醛水溶液的质量/体积分数为4％g/mL，配方为：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入0.1mol/L磷酸缓冲液500～800ml，加热至55～60℃，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加1mol/L的NaOH使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的磷酸缓冲液至1000mL；

苏木素-伊红染色具体步骤为：剪取1～2cm用质量/体积分数为4％g/mL多聚甲醛水溶液固定24h的虫体片段，自来水充分清洗后置于染色缸中，用苏木素-伊红染液染色虫体片段0.5～1h，体积分数为1％的盐酸酒精调色30s，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

所述梯度乙醇的梯度为：体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％。

棘沟赖利绦虫判断要点：体长5～10cm，呈乳白色，不透明。头节呈圆球形，四周有4个圆形吸盘，中央有1个可伸缩的顶突，顶突上分布有两圈交替排列的小钩，每圈小钩数目约22～25个。颈节较短，起始部与头节等宽，向后逐渐增宽。颈节节片宽大于长，外形呈梯形，内部生殖系统尚未发育成熟，染色不明显。成节呈长方形，长度略大于宽度，节片内有一套生殖系统，生殖孔左右交替排列于节片外缘上1/3的位置。雄性生殖系统雄茎囊位于排泄管外侧，睾丸数目30～40个，分布于节片前段的两侧，卵巢的上方。雌性生殖系统中受精囊发达，呈梨性，位于排泄管内侧，睾丸下方。卵巢呈分叶状，位于节片中央，卵黄腺位于卵巢后方。孕节肥厚，节片长大于宽，内无子宫，被卵囊所取代。卵囊呈圆形或椭圆形，散在分布于孕节各处，数量约200～400个，每个卵囊内包含1个胚化的六钩蚴。

进一步，所述步骤3(2)中第一PCR反应管的体积为200μL；第一PCR反应管进行PCR反应的反应体系为50μL；

第一PCR反应管加入2×MasterMix为25μL，步骤2提取的绦虫虫体DNA为1μL，18srDNA上、下游引物各1μL，浓度为0.5μM，去离子水为22μL；

第一PCR反应管进行PCR反应的反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。

进一步，所述步骤3(2)中第二PCR反应管的体积为200μL；第二PCR反应管进行PCR反应的反应体系为50μL；

第二PCR反应管加入2×MasterMix为25μL，步骤2提取的绦虫虫体DNA为1μL，ITS-2rDNA上、下游引物各1μL，浓度为0.5μM，去离子水22μL；

第二PCR反应管进行PCR反应的反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。

进一步，所述步骤3(2)中琼脂糖凝胶溶液的质量/体积分数为1.5％g/mL，GelRed荧光染料与琼脂糖凝胶溶液的体积比例为1:5000～1:10000，PCR扩增产物溶液的体积为5～8μL；电压条件的电压为120V～150V，电泳的时间为30min～40min。

进一步，所述步骤4氨苄青霉素的浓度为50μg/mL。

进一步，所述步骤4中18s rDNA扩增产物基因序列如SEQ ID NO.5所示，ITS-2rDNAPCR扩增产物基因序列如SEQ ID NO.6所示。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

1)本发明前期曾通过传统的虫体形态学鉴定，筛选棘沟赖利绦虫用于本发明中PCR引物和方法的建立。传统的虫体形态学鉴定需对绦虫不同部位的节片进行染色、鉴定，存在样本需求量大、工作量大、耗时长、染色过程复杂和难以得到理想的染色结果等缺点(图1)。本发明建立的PCR鉴定方法所需样本量少(约30mg)，工作量小(无需区分节片部位)，用时短(小于24h)且结果判定简单。

2)本发明设计的引物能分别特异性地扩增出虫体样品中的18s rDNA和ITS-2rDNA序列，用本发明中PCR方法扩增出的条带单一、清晰(图2)。18s rDNA(图3、图4)和ITS-2rDNA(图5、图6)PCR测序结果能准确比对到GeneBank中公布的赖利属绦虫对应序列，且遗传进化关系分析显示与棘沟赖利绦虫具有高度的同源性。

附图说明

图1为棘沟赖利绦虫形态学鉴定；

图2为18s rDNA和ITS-2 rDNA PCR凝胶电泳；

图3为本发明扩增的18s rDNA序列GeneBank序列比对结果；

图4为本发明扩增的18s rDNA序列基因进化关系分析；

图5为本发明扩增的ITS-2 rDNA序列GeneBank序列比对结果；

图6为本发明扩增的ITS-2 rDNA基因序列遗传进化关系分析。

具体实施方式

实施例1

一种棘沟赖利绦虫鉴定的PCR方法，提供棘沟赖利绦虫种属鉴定的18s rDNA和ITS-2 rDNA两种基因检测引物，所述方法包括以下步骤：

步骤1，棘沟赖利绦虫的收集与形态学鉴别：收集绦虫感染鸡病例，放血法处死病鸡，取出完整消化道，小心剪开肠道，将发现的绦虫与肠道一起置于清水中，待绦虫头节脱离肠黏膜并充分舒展后转入生理盐水中清洗，清洗干净后将每条虫体进行单独保存，一部分虫体冻存于-80℃冰箱，准备提取虫体DNA，一部分虫体固定于体积分数为2.5％的戊二醛水溶液(配方为：10mL体积分数为25％戊二醛水溶液加入50mL 0.2M磷酸缓冲液和40mL蒸馏水，调PH＝7.4，加入蒸馏水补至100mL，其中0.2M磷酸缓冲液配方为：向磷酸二氢钠2.6g和磷酸氢二钠29g中加入蒸馏水补至500mL，调PH＝7.4)中，做扫描电镜观察，一部分虫体置于质量/体积分数为4％g/mL多聚甲醛水溶液(配方为：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入0.1mol/L磷酸缓冲液500mL，加热至60℃，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加1mol/L的NaOH使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的磷酸缓冲液至1000mL)中固定，做苏木素-伊红染色；

扫描电镜观察：剪取1cm用体积分数为2.5％戊二醛水溶液固定4h的虫体片段，用含质量/体积分数1％g/mL四氧化锇的0.2M的甲次砷酸钠水溶液孵育1h，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水，CO₂临界点干燥和喷金后置于扫描电子显微镜下观察。

苏木素-伊红染色：剪取1cm用质量/体积分数为4％多聚甲醛水溶液固定24h的虫体片段，自来水充分清洗后置于染色缸中，用苏木素-伊红染液染色虫体片段0.5h，体积分数为1％的盐酸酒精调色30s，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

步骤2，DNA提取：绦虫虫体30mg，用组织DNA提取试剂盒(购自天根生物科技公司)提取绦虫虫体DNA；

步骤3，PCR扩增：

(1)引物设计：

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18s rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：18s-F:5′-CTGAGAAACGGCTACCACT-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18s rDNA基因下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：18s-R:5′-ACGCCAGACGAACTACAC-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的ITS-2 rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ITS-2-F:5′-TATTGCGGCCATAGGTTT-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的ITS-2 rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：ITS-2-R:5′-CGTGAGTACCCGCTGAAC-3′；

(2)PCR反应：

准备200μL的第一PCR反应管和200μL的第二PCR反应管，第一PCR反应管中加入25μL 2×MasterMix(中科瑞泰公司)，1μL步骤2提取的绦虫虫体DNA为模板，18s rDNA上、下游引物各1μL，浓度为0.5μM，去离子水为22μL，进行PCR反应，反应体系为50μL；第二PCR反应管中加入25μL 2×MasterMix(中科瑞泰公司)，1μL步骤2提取的绦虫虫体DNA为模板，ITS-2rDNA上、下游引物各1μL，去离子水为22μL，进行PCR反应；第一PCR反应管和第二PCR反应管进行PCR反应的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。制备琼脂糖凝胶溶液用TAE电泳缓冲液，凝胶凝固前加入GelRed荧光染料(Biotium公司)为琼脂糖凝胶溶液的1/5000，以示踪凝胶电泳中的PCR扩增产物；凝胶凝固后向点样孔中加入5μLPCR扩增产物溶液，在120V电压条件下电泳30min，在凝胶成像仪下观察PCR扩增产物分子大小及电泳条带清晰度，拍照；18s rDNA PCR产物长度为1623bp；ITS-2 rDNA PCR产物长度为564bp。

步骤4，PCR扩增产物测序：用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生物科技公司)将第一PCR反应管和第二PCR反应管PCR扩增产物的电泳条带进行回收，分别将回收得到的18s rDNA与ITS-2 rDNA PCR扩增产物与pMD19-T载体连接，连接pMD19-T载体后转化入DH5α感受态细胞，用含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基对pMD19-T载体转化的DH5α感受态细胞进行阳性筛选，阳性菌落扩大培养后对菌落进行PCR测序，获得18s rDNA PCR扩增产物基因序列(如SEQ ID NO.5所示)和ITS-2 rDNA PCR扩增产物基因序列(如SEQ ID NO.6所示)；

步骤5，序列分析：分别将18s rDNA和ITS-2 rDNA PCR扩增产物基因序列与GenBank数据库中公布的赖利属绦虫18s rDNA、ITS-2 rDNA序列进行比对，用MEGA软件分别将18s rDNA和ITS-2rDNA PCR扩增产物基因序列与已公布的序列进行遗传进化关系分析。

实施例2

一种棘沟赖利绦虫鉴定的PCR方法，提供棘沟赖利绦虫种属鉴定的18s rDNA和ITS-2 rDNA两种基因检测引物，所述方法包括以下步骤：

步骤1，棘沟赖利绦虫的收集与形态学鉴别：收集绦虫感染鸡病例，放血法处死病鸡，取出完整消化道，小心剪开肠道，将发现的绦虫与肠道一起置于清水中，待绦虫头节脱离肠黏膜并充分舒展后转入生理盐水中清洗，清洗干净后将每条虫体进行单独保存，一部分虫体冻存于-80℃冰箱，准备提取虫体DNA，一部分虫体固定于体积分数为2.5％的戊二醛水溶液(配方为：10mL体积分数为25％戊二醛水溶液加入50mL 0.2M磷酸缓冲液和40mL蒸馏水，调PH＝7.4，加入蒸馏水补至100mL，其中0.2M磷酸缓冲液配方为：向磷酸二氢钠2.6g和磷酸氢二钠29g中加入蒸馏水补至500mL，调PH＝7.4)中，做扫描电镜观察，一部分虫体置于质量/体积分数为4％g/mL多聚甲醛水溶液(配方为：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入0.1mol/L磷酸缓冲液800mL，加热至55℃，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加1mol/L的NaOH使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的磷酸缓冲液至1000mL)中固定，做苏木素-伊红染色；

扫描电镜观察：剪取2cm用体积分数为2.5％戊二醛水溶液固定4h的虫体片段，用含质量/体积分数1％g/mL四氧化锇的0.2M的甲次砷酸钠水溶液孵育1h，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水，CO₂临界点干燥和喷金后置于扫描电子显微镜下观察。

苏木素-伊红染色：剪取2cm用质量/体积分数为4％多聚甲醛水溶液固定24h的虫体片段，自来水充分清洗后置于染色缸中，用苏木素-伊红染液染色虫体片段1h，体积分数为1％的盐酸酒精调色30s，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

步骤2，DNA提取：绦虫虫体30mg，用组织DNA提取试剂盒(购自天根生物科技公司)提取绦虫虫体DNA；

步骤3，PCR扩增：

(1)引物设计：

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18s rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：18s-F:5′-CTGAGAAACGGCTACCACT-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18s rDNA基因下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：18s-R:5′-ACGCCAGACGAACTACAC-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的ITS-2rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ITS-2-F:5′-TATTGCGGCCATAGGTTT-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的ITS-2rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：ITS-2-R:5′-CGTGAGTACCCGCTGAAC-3′；

(2)PCR反应：

准备200μL的第一PCR反应管和200μL的第二PCR反应管，第一PCR反应管中加入25μL 2×MasterMix(中科瑞泰公司)，1μL步骤2提取的绦虫虫体DNA为模板，18s rDNA上、下游引物各1μL，浓度为0.5μM，去离子水为22μL，进行PCR反应，反应体系为50μL；第二PCR反应管中加入25μL 2×MasterMix(中科瑞泰公司)，1μL步骤2提取的绦虫虫体DNA为模板，ITS-2rDNA上、下游引物各1μL，去离子水为22μL，进行PCR反应；第一PCR反应管和第二PCR反应管进行PCR反应的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。制备琼脂糖凝胶溶液用TAE电泳缓冲液，凝胶凝固前加入GelRed荧光染料(Biotium公司)为琼脂糖凝胶溶液的1/10000，以示踪凝胶电泳中的PCR扩增产物；凝胶凝固后向点样孔中加入8μLPCR扩增产物溶液，在150V电压条件下电泳40min，在凝胶成像仪下观察PCR扩增产物分子大小及电泳条带清晰度，拍照；18s rDNAPCR产物长度为1623bp；ITS-2rDNAPCR产物长度为564bp。

步骤4，PCR扩增产物测序：用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生物科技公司)将第一PCR反应管和第二PCR反应管PCR扩增产物的电泳条带进行回收，分别将回收得到的18s rDNA与ITS-2 rDNA PCR扩增产物与pMD19-T载体连接，连接pMD19-T载体后转化入DH5α感受态细胞，用含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基对pMD19-T载体转化的DH5α感受态细胞进行阳性筛选，阳性菌落扩大培养后对菌落进行PCR测序，获得18s rDNA PCR扩增产物基因序列(如SEQ ID NO.5所示)和ITS-2rDNA PCR扩增产物基因序列(如SEQ ID NO.6所示)；

步骤5，序列分析：分别将18s rDNA和ITS-2 rDNA PCR扩增产物基因序列与GenBank数据库中公布的赖利属绦虫18s rDNA、ITS-2 rDNA序列进行比对，用MEGA软件分别将18s rDNA和ITS-2 rDNA PCR扩增产物基因序列与已公布的序列进行遗传进化关系分析。

实施例3

一种棘沟赖利绦虫鉴定的PCR方法，提供棘沟赖利绦虫种属鉴定的18s rDNA和ITS-2 rDNA两种基因检测引物，所述方法包括以下步骤：

步骤1，棘沟赖利绦虫的收集与形态学鉴别：收集绦虫感染鸡病例，放血法处死病鸡，取出完整消化道，小心剪开肠道，将发现的绦虫与肠道一起置于清水中，待绦虫头节脱离肠黏膜并充分舒展后转入生理盐水中清洗，清洗干净后将每条虫体进行单独保存，一部分虫体冻存于-80℃冰箱，准备提取虫体DNA，一部分虫体固定于体积分数为2.5％的戊二醛水溶液(配方为：10mL体积分数为25％戊二醛水溶液加入50mL 0.2M磷酸缓冲液和40mL蒸馏水，调PH＝7.4，加入蒸馏水补至100mL，其中0.2M磷酸缓冲液配方为：向磷酸二氢钠2.6g和磷酸氢二钠29g中加入蒸馏水补至500mL，调PH＝7.4)中，做扫描电镜观察，一部分虫体置于质量/体积分数为4％g/mL多聚甲醛水溶液(配方为：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入0.1mol/L磷酸缓冲液600mL，加热至58℃，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加1mol/L的NaOH使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的磷酸缓冲液至1000mL)中固定，做苏木素-伊红染色；

扫描电镜观察：剪取2cm用体积分数为2.5％戊二醛水溶液固定4h的虫体片段，用含质量/体积分数1％g/mL四氧化锇的0.2M的甲次砷酸钠水溶液孵育1h，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水，CO₂临界点干燥和喷金后置于扫描电子显微镜下观察。

苏木素-伊红染色：剪取2cm用质量/体积分数为4％多聚甲醛水溶液固定24h的虫体片段，自来水充分清洗后置于染色缸中，用苏木素-伊红染液染色虫体片段1h，体积分数为1％的盐酸酒精调色30s，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

步骤2，DNA提取：绦虫虫体30mg，用组织DNA提取试剂盒(购自天根生物科技公司)提取绦虫虫体DNA；

步骤3，PCR扩增：

(1)引物设计：

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18s rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：18s-F:5′-CTGAGAAACGGCTACCACT-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18s rDNA基因下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：18s-R:5′-ACGCCAGACGAACTACAC-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的ITS-2 rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ITS-2-F:5′-TATTGCGGCCATAGGTTT-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的ITS-2rDNA基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：ITS-2-R:5′-CGTGAGTACCCGCTGAAC-3′；

(2)PCR反应：

准备200μL的第一PCR反应管和200μL的第二PCR反应管，第一PCR反应管中加入25μL 2×MasterMix(中科瑞泰公司)，1μL步骤2提取的绦虫虫体DNA为模板，18s rDNA上、下游引物各1μL，浓度为0.5μM，去离子水为22μL，进行PCR反应，反应体系为50μL；第二PCR反应管中加入25μL 2×MasterMix(中科瑞泰公司)，1μL步骤2提取的绦虫虫体DNA为模板，ITS-2rDNA上、下游引物各1μL，去离子水为22μL，进行PCR反应；第一PCR反应管和第二PCR反应管进行PCR反应的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。制备琼脂糖凝胶溶液用TAE电泳缓冲液，凝胶凝固前加入GelRed荧光染料(Biotium公司)为琼脂糖凝胶溶液的1/8000，以示踪凝胶电泳中的PCR扩增产物；凝胶凝固后向点样孔中加入6μLPCR扩增产物溶液，在140V电压条件下电泳35min，在凝胶成像仪下观察PCR扩增产物分子大小及电泳条带清晰度，拍照；18s rDNA PCR产物长度为1623bp；ITS-2 rDNA PCR产物长度为564bp。

步骤4，PCR扩增产物测序：用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生物科技公司)将第一PCR反应管和第二PCR反应管PCR扩增产物的电泳条带进行回收，分别将回收得到的18s rDNA与ITS-2 rDNA PCR扩增产物与pMD19-T载体连接，连接pMD19-T载体后转化入DH5α感受态细胞，用含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基对pMD19-T载体转化的DH5α感受态细胞进行阳性筛选，阳性菌落扩大培养后对菌落进行PCR测序，获得18s rDNA PCR扩增产物基因序列(如SEQ ID NO.5所示)和ITS-2 rDNA PCR扩增产物基因序列(如SEQ ID NO.6所示)；

步骤5，序列分析：分别将18s rDNA和ITS-2 rDNA PCR扩增产物基因序列与GenBank数据库中公布的赖利属绦虫18s rDNA、ITS-2 rDNA序列进行比对，用MEGA软件分别将18s rDNA和ITS-2rDNA PCR扩增产物基因序列与已公布的序列进行遗传进化关系分析。

图1中A1/A2：绦虫头节；B1/B2：绦虫成熟节片；C1/C2：绦虫孕卵节片；D：绦虫整体。sc：头节；su：吸盘；r：顶突；h：小钩；gp：生殖孔；cp：雄茎囊；t：睾丸；sp：受精囊；ec：卵囊；on：六钩蚴。

图2中用本发明中PCR方法扩增出的条带单一、清晰，18s rDNA PCR产物长度为1623bp；ITS-2 rDNA PCR产物长度为564bp。

图3中本发明扩增的18s rDNA序列准确比对到已公布的赖利属绦虫18s rDNA序列。

图4中本发明扩增的18s rDNA与已公布的棘沟赖利绦虫18s rDNA序列具有最近的遗传进化关系。Raillietina echinobothrida Shanxi为本发明扩增的18s rDNA序列。

图5中本发明扩增的ITS-2 rDNA序列准确比对到已公布的赖利属绦虫ITS-2rDNA序列。

图6中本发明扩增的ITS-2 rDNA与已公布的棘沟赖利绦虫ITS-2 rDNA序列具有最近的遗传进化关系。Raillietina echinobothrida Shanxi为本发明扩增的ITS-2 rDNA序列。

序列表

SEQ ID NO.1：

ctgagaaacggctaccact

SEQ ID NO.2：

acgccagacgaactacac

SEQ ID NO.3：

tattgcggccataggttt

SEQ ID NO.4：

cgtgagtacccgctgaac

SEQ ID NO.5：

ctgagaaacggctaccacttccaagggaggcagcaggcgcgcaaattacccactcccagcacggggaggtggtgacgaaaaataccgatgcgggactcctatgaggctccgtaatcggaatgagtggactctaaatcctttcacgaggatcaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaactccagctccaatagcgtatattaaagttgctgcagttaaaaagctcgtagttggatctcggtcgcatttttgcctgttggtattattgggcggcggtgctaggctgccggcgtgtcgtgcttgtgtaccggtacccggaagggtccgcgcatgggtgcgtgcgtgggcagtctgttgaatgcgcagtcgtcccaagctggcatggcgaggatgtaacctgtaagccatgtctgtggagtaacatccacaggtgtatgcgggtgtcgggcagtgcactgcacttgttgtggagcctgtcggcccgtgtgcatgccctcttggtgcccttaaaaaggtgtcggggggcggatggcacgtttactttgaacaaatttgagtgctcaaatcaggccgatgttgcctgaatacttttgcatggaataatggaataggacttcggttctatttcgttggttttcggatccgaagtaatgatcaaaagagacaggcggggacgtttgtatggctgcgctagaggtgaaattcgtggaccgtagccagacaaactaaagcgaaagcattcgtcaagcatgttttcattgaccatgagcgaaagtcagaggctcgaagacgatcagataccgtcctagttctgaccataaacgatgccaactgacgatccgtggtggtagttataaccttccccacgggcagtccccgggaaacctttaagtctttgggttccgggggaagtatggttgcaaagctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaactcacccgggccggacactwtgaggattgacagattgatagctctttcttgatttggtggttggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctggttaattccgataacgaacgagactccagcctgctaattagtgcgtttgtccactgcccctgctggacggcgttgaatgcggctgctagtgggtttcggcctgctctgcggctagtcagacggcgttagtcctcgggggcggcgcgaatgctcacttcttagagggacaagcgggagaagccgcacgaaatagagcaataacaggtctgtgatgcccttagatgtccggggccgcacgcgcgctacaatggcggtgtcaacgagtgagaccttctggcccgaaagggttggataaactggtcaatcaccgtcatgacagggatcggggcttggaattgttccccgtgaacgaggaattcctagtaagtgcaagtcataagcttgcgctgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaatggtttagtaaggtccttggatcgacgcctttgtagctgccaccgaaaggtgtgtagttcgtctggcgt

SEQ ID NO.6：

tattgcggccataggtttacctgtggccacgtctgtccgagcgtcggcttataaactatcactgcgccttaaaagcagtggcttgggagactgccgtgttatcgtaaccttgtatgtgtgtgtgtgtgtgtatatgcgtacgtgcaaataggtctgcgatatggcatggcttctctttaaggaatggtcacctatggtggcgttgagcttgtggttgtgctacgaccgctgactgcggctcgagtcgtcgtacgtgagtatgtgtgtgtgtgtgcgagcgagcgctgttctgggggtgaaggcgctcgtgcgtgtgtactctccttgtctcgacttgggccgtgtctgcagttgaacaaccgtggcctagggtaacttctgctgccagagacacgaattgttcgctgtggctgtaaacgttacgtggttgtggtgctcaactcaagacgtgcaaatatgtggtgagtgtttacgtgtgtgtgcataatgtggtaaacctcatcatcatggtcgcttttgcgcattgcttcctgacct cggatcagtcgtgagtacccgctgaac

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 一种棘沟赖利绦虫鉴定的PCR方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 棘沟赖利绦虫(Raillietina echinobothrida)

<400> 1

ctgagaaacg gctaccact 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 棘沟赖利绦虫(Raillietina echinobothrida)

<400> 2

acgccagacg aactacac 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 棘沟赖利绦虫(Raillietina echinobothrida)

<400> 3

tattgcggcc ataggttt 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 棘沟赖利绦虫(Raillietina echinobothrida)

<400> 4

cgtgagtacc cgctgaac 18

<210> 5

<211> 1623

<212> DNA

<213> 棘沟赖利绦虫(Raillietina echinobothrida)

<400> 5

ctgagaaacg gctaccactt ccaagggagg cagcaggcgc gcaaattacc cactcccagc 60

acggggaggt ggtgacgaaa aataccgatg cgggactcct atgaggctcc gtaatcggaa 120

tgagtggact ctaaatcctt tcacgaggat caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc 180

cgcggtaact ccagctccaa tagcgtatat taaagttgct gcagttaaaa agctcgtagt 240

tggatctcgg tcgcattttt gcctgttggt attattgggc ggcggtgcta ggctgccggc 300

gtgtcgtgct tgtgtaccgg tacccggaag ggtccgcgca tgggtgcgtg cgtgggcagt 360

ctgttgaatg cgcagtcgtc ccaagctggc atggcgagga tgtaacctgt aagccatgtc 420

tgtggagtaa catccacagg tgtatgcggg tgtcgggcag tgcactgcac ttgttgtgga 480

gcctgtcggc ccgtgtgcat gccctcttgg tgcccttaaa aaggtgtcgg ggggcggatg 540

gcacgtttac tttgaacaaa tttgagtgct caaatcaggc cgatgttgcc tgaatacttt 600

tgcatggaat aatggaatag gacttcggtt ctatttcgtt ggttttcgga tccgaagtaa 660

tgatcaaaag agacaggcgg ggacgtttgt atggctgcgc tagaggtgaa attcgtggac 720

cgtagccaga caaactaaag cgaaagcatt cgtcaagcat gttttcattg accatgagcg 780

aaagtcagag gctcgaagac gatcagatac cgtcctagtt ctgaccataa acgatgccaa 840

ctgacgatcc gtggtggtag ttataacctt ccccacgggc agtccccggg aaacctttaa 900

gtctttgggt tccgggggaa gtatggttgc aaagctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag 960

ggcaccacca ggagtggagc ctgcggctta atttgactca acacgggaaa actcacccgg 1020

gccggacact wtgaggattg acagattgat agctctttct tgatttggtg gttggtggtg 1080

catggccgtt cttagttggt ggagcgattt gtctggttaa ttccgataac gaacgagact 1140

ccagcctgct aattagtgcg tttgtccact gcccctgctg gacggcgttg aatgcggctg 1200

ctagtgggtt tcggcctgct ctgcggctag tcagacggcg ttagtcctcg ggggcggcgc 1260

gaatgctcac ttcttagagg gacaagcggg agaagccgca cgaaatagag caataacagg 1320

tctgtgatgc ccttagatgt ccggggccgc acgcgcgcta caatggcggt gtcaacgagt 1380

gagaccttct ggcccgaaag ggttggataa actggtcaat caccgtcatg acagggatcg 1440

gggcttggaa ttgttccccg tgaacgagga attcctagta agtgcaagtc ataagcttgc 1500

gctgattacg tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc tactaccgat tgaatggttt 1560

agtaaggtcc ttggatcgac gcctttgtag ctgccaccga aaggtgtgta gttcgtctgg 1620

cgt 1623

<210> 6

<211> 564

<212> DNA

<213> 棘沟赖利绦虫(Raillietina echinobothrida)

<400> 6

tattgcggcc ataggtttac ctgtggccac gtctgtccga gcgtcggctt ataaactatc 60

actgcgcctt aaaagcagtg gcttgggaga ctgccgtgtt atcgtaacct tgtatgtgtg 120

tgtgtgtgtg tatatgcgta cgtgcaaata ggtctgcgat atggcatggc ttctctttaa 180

ggaatggtca cctatggtgg cgttgagctt gtggttgtgc tacgaccgct gactgcggct 240

cgagtcgtcg tacgtgagta tgtgtgtgtg tgtgcgagcg agcgctgttc tgggggtgaa 300

ggcgctcgtg cgtgtgtact ctccttgtct cgacttgggc cgtgtctgca gttgaacaac 360

cgtggcctag ggtaacttct gctgccagag acacgaattg ttcgctgtgg ctgtaaacgt 420

tacgtggttg tggtgctcaa ctcaagacgt gcaaatatgt ggtgagtgtt tacgtgtgtg 480

tgcataatgt ggtaaacctc atcatcatgg tcgcttttgc gcattgcttc ctgacctcgg 540

atcagtcgtg agtacccgct gaac 564