阅读说明：本技术 评价或选择感觉刺激降低剂的方法 (Methods of evaluating or selecting sensory stimulation reducing agents ) 是由 二之宫理恵 西岛贵史 佐藤纪子 于 2018-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种对降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂进行评价或选择的方法、及降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂。本发明的对降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂的评价或选择方法包括以下的(1)～(3)的工序：(1)使受试物质与可表达CES1的细胞接触的工序；(2)测定该细胞中的CES1的表达的工序；及(3)基于(2)中所测定的结果,将促进CES1的表达的受试物质评价为降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂的工序。(The present invention provides a method for evaluating or selecting a sensory stimulation reducing agent for reducing sensory stimulation due to parabens, and a sensory stimulation reducing agent for reducing sensory stimulation due to parabens. The method for evaluating or selecting a sensory stimulation reducing agent for reducing sensory stimulation due to parabens of the present invention comprises the following steps (1) to (3): (1) a step of contacting a test substance with a cell capable of expressing CES 1; (2) measuring the expression of CES1 in the cell; and (3) evaluating the test substance that promotes the expression of CES1 as a sensory stimulation reducing agent that reduces sensory stimulation by parabens based on the results of the measurement in (2).)

评价或选择感觉刺激降低剂的方法

技术领域

本发明涉及一种对抑制由对羟基苯甲酸酯类所引起的感觉刺激的感觉刺激降低剂进行评价或选择的方法、及缓和由对羟基苯甲酸酯类所引起的刺激感的感觉刺激降低剂。

背景技术

关于皮肤化妆品等皮肤外用剂，为了防止细菌的混入、繁殖，在制剂中混合防腐剂的情形是较多的。其中，对羟基苯甲酸酯类作为抗菌力及安全性均较高的防腐剂，最经常混合于皮肤外用剂中。然而，在对紫外线、干燥、化学物质等过敏的人，即，所谓敏感肌肤的人中，有时会有感觉到因对羟基苯甲酸酯类带来的刺痛感或火辣辣的感觉等的一时性的不快的刺激感的情形。

对此，现有技术中，作为抑制对皮肤的刺激感的制剂，例如，报告有如下：抑制由表面活性剂引起的刺激的由含疏水性基团的多糖类衍生物组成的刺激抑制剂(专利文献1)、抑制由染发剂引起的刺激的染发剂用刺激抑制剂(专利文献2)。另外，作为对羟基苯甲酸酯类的刺激抑制剂，报告有可以使用TRPA1的抑制物质(专利文献3)。

另一方面，已知属于十字花科芸薹属的青花菜(Brassica oleraceavar.italica)的发芽体即发芽青花菜是萝卜硫素的含量较高的植物，关于其提取物，已经报告有具有美白、皱纹、松弛等的预防改善作用(专利文献4)，或皮脂产生促进作用(专利文献5)等。

然而，还没有报告指出发芽青花菜的提取物或萝卜硫素具有预防及改善敏感肌的作用。

[专利文献1]日本专利特开2001-64185号公报

[专利文献2]日本专利特开2002-363053号公报

[专利文献3]日本专利特开2008-79528号公报

[专利文献4]日本专利特开2003-155221号公报

[专利文献5]日本专利特愿2009-114152号公报

发明内容

本发明提供以下的1)～9)。

1)一种对降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂进行评价或选择的方法，其包括以下的(1)～(3)的工序：

(1)使受试物质与可表达CES1的细胞接触的工序；

(2)测定该细胞中的CES1的表达的工序；及

(3)基于(2)中所测定的结果，将促进CES1的表达的受试物质评价为降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂的工序。

2)一种感觉刺激降低剂，其中，以萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物作为有效成分。

3)一种CES1表达促进剂，其中，以萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物作为有效成分。

4)萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物在用于制造感觉刺激降低剂中的用途。

5)萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物在用于制造CES1表达促进剂中的用途。

6)一种萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物，其是用于降低感觉刺激。

7)一种萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物，其是用于促进CES1的表达。

8)萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物在用于降低感觉刺激中的非治疗性用途。

9)萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物在用于促进CES1表达中的非治疗性用途。

10)一种降低感觉刺激的方法，其中，使用萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物。

11)一种促进CES1表达的方法，其中，使用萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物。

附图说明

图1是三维培养表皮的IL-1α产生量。MP：添加对羟基苯甲酸甲酯，PHBA：添加对羟基苯甲酸。数据是平均值±SD。

图2是敏感肌肤者的皮肤感觉刺激得分。MP：涂抹对羟基苯甲酸甲酯，PHBA：涂抹对羟基苯甲酸。

图3是健康者及敏感肌肤者的CES1表达量。数据是平均值±SD。

图4是健康者及敏感肌肤者的对羟基苯甲酸甲酯的代谢活性。数据是平均值±SD。

图5是发芽青花菜提取物的CES1表达促进作用。

图6是发芽青花菜提取物的降低因对羟基苯甲酸甲酯所致的感觉刺激的作用。

具体实施方式

本发明涉及提供一种对降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂进行评价或选择的方法。另外，本发明涉及提供一种降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂。

本发明者等人对由对羟基苯甲酸酯类所引起的感觉刺激进行了研究，结果发现：对羟基苯甲酸甲酯在活体内通过代谢酶羧酸酯酶1(CES1)而代谢并转换为对羟基苯甲酸(PHBA)，在该PHBA几乎无感觉刺激；进一步，敏感肌的人与健康者相比CES1的表达是降低的；并发现：通过将CES1的表达设为指标，能够对降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂进行探索或评价。并且，发现：萝卜硫素或如发芽青花菜这样的含有萝卜硫素的植物的提取物具有CES1的表达促进作用，能够成为具有降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的效果的感觉刺激降低剂。

根据本发明，能够对在活体内迅速地将对羟基苯甲酸酯类分解，降低由对羟基苯甲酸酯类所引起的感觉刺激的新型的感觉刺激降低剂进行探索或评价。

另外，根据本发明，能够提供一种在活体内迅速地将对羟基苯甲酸酯类分解，降低由对羟基苯甲酸酯类所引起的感觉刺激的新型的感觉刺激降低剂。

在本发明中，作为“对羟基苯甲酸酯类”，例如，可列举：对羟基苯甲酸甲酯(p-羟基苯甲酸甲酯)、对羟基苯甲酸乙酯(p-羟基苯甲酸乙酯)、对羟基苯甲酸丙酯(p-羟基苯甲酸丙酯)、对羟基苯甲酸异丙酯(p-羟基苯甲酸异丙酯)、对羟基苯甲酸丁酯(p-羟基苯甲酸丁酯)、对羟基苯甲酸异丁酯(p-羟基苯甲酸异丁酯)、对羟基苯甲酸苄酯(p-羟基苯甲酸苄酯)等对羟基苯甲酸酯及其钠盐。

另外，所谓“降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激”，是指抑制或缓和由对羟基苯甲酸酯类所引起的皮肤的刺痛感或火辣辣的感觉等一时性的不快的刺激感。

在本发明中，所谓“CES1”，是指羧酸酯酶1，也作为丝氨酸酯酶1或SES1所熟知。该酶是哺乳动物肝脏羧基酯酶(EC 3.1.1.1)的家族的成员，对具有酯、硫酯或酰胺官能基团的内源性基质进行水解。在人类中，除了肝脏以外，也报告指出了在肺、皮肤中的表达，其与医药品的代谢活化或化学物质等活体外异物的解毒有关。

如下述实施例所示，在人类三维培养表皮样本中添加对羟基苯甲酸甲酯(MP)或对羟基苯甲酸(PHBA)进行培养后，测定培养基中的炎症性细胞因子(IL-1α)量，其结果：在添加MP的情况下，IL-1α的产生是增加的，但是，在添加PHBA的情况下，几乎没有看见IL-1α的产生(图1)。另外，在意识到敏感肌的人的皮肤上涂抹MP或PHBA，对其刺激感进行了试验，其结果：在涂抹MP时感觉到了某些刺激感，相对于此，在涂抹PHBA时，几乎没有感觉到刺激感(图2)。

进一步，从健康者及敏感肌肤者采取皮肤，测定了皮肤中的MP的代谢活性与CES1的表达量，结果确认到：与健康者的皮肤相比，敏感肌肤者的皮肤中的MP的代谢活性较低，CES1表达量非常低(图3、图4)。

这些结果提示了：促进CES1的表达的物质作为降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂是有用的，另外，能够将CES1的表达作为指标而对降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂进行评价或选择。

对降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂进行的评价或选择的方法包括以下的(1)～(3)的工序：

(1)使受试物质与可表达CES1的细胞接触的工序；

(2)测定该细胞中的CES1的表达的工序；及

(3)基于(2)中所测定的结果，将促进CES1的表达的受试物质评价为降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂的工序。

此处，作为“可表达CES1的细胞”，可列举：天生具有CES1基因且具有表达其的能力的细胞、及后天地且可表达地导入了CES1基因的细胞。该细胞可以是从活体所采取的细胞、或从活体所采取的组织或器官中所含的细胞，也可以是培养细胞。该细胞优选为源自哺乳动物的细胞，更优选为源自人类的细胞。

作为天生具有CES1基因且具有表达其的能力的细胞，可列举：源自活体的所有组织的细胞，优选为可列举：从哺乳动物(优选为人类)所采取的源自皮肤的细胞，例如，源自表皮组织的细胞(表皮角化细胞等)、源自真皮组织的细胞(纤维芽细胞等)，此外，源自这些细胞的细胞培养物、器官培养物等，优选为源自表皮组织的细胞，更优选为表皮角化细胞。

关于外来的可表达CES1基因的细胞，可通过将组装有CES1基因的表达载体导入至任意的哺乳动物细胞中，并使该细胞转化而获得。关于表达载体中的转录调节区域(启动子等)，只要能够进行与活体内相同的表达控制，则并没有特别的限定，优选为使用CES1基因的转录调节区域(启动子等)。另外，作为外来的可表达CES1基因的细胞，也可以使用在CES1基因的转录调节区域(启动子等)导入了结合有报告基因(reporter gene)的载体的细胞。组装有CES1基因或CES1基因的转录调节区域(启动子等)的载体的制作方法、及向哺乳动物细胞导入载体的方法，是本领域技术人员已知的。

另外，作为培养细胞，除了源自上述天生具有CES1基因且具有可表达其的能力的细胞、及外来的可表达地导入了CES1基因的细胞的培养细胞以外，也可以列举：可表达CES1的株细胞，优选为从哺乳动物(优选为人类)采取的源自皮肤的培养细胞，更优选为正常人类的培养表皮角化细胞。另外，也可以优选地使用三维培养皮肤细胞，具体而言，可列举：EpiDerm TM(MatTek Corporation公司制造)、EpiSkin(SkinEthic公司制造)、RHE(SkinEthic公司制造)、Labcyte表皮样本(J-TEC公司制造)等。

作为与上述细胞接触的受试物质，只要是希望用作降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂的物质，则并没有特别的限制，例如，可列举：动植物、海洋生物、微生物等及其提取物；源自这些的天然成分；合成化合物；及这些的混合物及组合物等。

作为使受试物质与上述细胞接触的方法，只要是在该领域中公知的方法即可，例如，可列举：将该受试物质添加至细胞培养培养基、或直接添加至细胞(例如，滴加、涂抹、散布、喷雾、贴片等)。关于受试物质的浓度及接触量，只要基于受试物质的形态、化学性质、细胞毒性、所预想的皮肤致敏性的强度等而适当地设定即可。例如，可列举：将稀释为适当浓度的受试物质的规定量，在37℃、5％CO₂的条件下，暴露于该细胞中24～48小时。

关于上述细胞中的CES1的表达，能够以CES1蛋白质的表达、CES1蛋白质的活性、对该蛋白质进行编码的CES1mRNA的表达、CES1基因的启动子的活化等作为指标而进行测定。对于设为指标的参数(例如，蛋白质表达、蛋白质的生物活性、mRNA(Messenger RNA，信使核糖核酸)表达、CES1基因启动子的活化等)的测定方法，只要按照该领域中公知的方法进行测定即可。

作为测定方法，例如，作为mRNA表达的测定方法，可列举：点杂交(dot blot)法、诺瑟印迹杂交(Northern blot)法、RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，逆转录-聚合酶链反应)、实时RT-PCR、微阵列等、及这些的组合。

作为CES1基因的启动子的活性测定方法，可列举：使用报告基因的启动子活性或转录活性的荧光-光学测定(报告实验(reporter assay))。

作为蛋白质表达的测定方法的例，可列举：SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)、色谱法、免疫学测定法(例如，免疫组织化学、ELISA(The enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附实验)、蛋白质印迹法(Western Blot)、免疫沉淀等)、比色定量法、质量分析等、及这些的组合。

关于CES1蛋白质的活性，例如，可通过使作为CES1的基质的对羟基苯甲酸甲酯暴露于CES1表达细胞中，培养一定时间后，利用HPLC对培养液中的对羟基苯甲酸进行定量而测定。

接着，基于如上所述测定的表达，评价受试物质的CES1的表达促进效果，该评价例如通过如下方式进行：在添加受试物质的前后进行比较，或者，对受试物质添加组与受试物质非添加组或对照物质添加组进行比较。或者，评价也可以通过在各种浓度的受试物质之间比较测定结果而进行。

并且，提高或促进了CES1的表达的受试物质被选择为降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂。

对于如此所获得的降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂而言，由于其降低由对羟基苯甲酸酯类所引起的感觉刺激，所以可通过混合于含有对羟基苯甲酸酯类的化妆品、医药品等中而使用。

通过上述本发明的方法，发现：萝卜硫素、及如发芽青花菜这样的含有萝卜硫素的植物的提取物具有CES1的表达促进作用，这些可作为感觉刺激降低剂。

即，本发明进一步提供一种以萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物作为有效成分的感觉刺激降低剂或CES1表达促进剂。

此处，萝卜硫素(Sulforaphane)是指异硫氰酸4-(甲基亚磺酰)丁酯。

萝卜硫素可通过利用公知的方法从含有萝卜硫素或其糖苷的植物进行分离精制等而取得。另外，经分离精制的萝卜硫素由Sigma-Aldrich公司等出售，在本发明中，也可以使用该市售品。

在本发明中，不仅经分离的萝卜硫素可以成为感觉刺激降低剂或CES1表达促进剂的有效成分，而且，含有上述萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物也可以成为感觉刺激降低剂或CES1表达促进剂的有效成分。

作为含有萝卜硫素或其糖苷的植物，例如，可列举：十字花科(Brassicaceae)植物，优选为十字花科芸薹属(Brassica)的植物。具体而言，可列举：青花菜、花椰菜、卷心菜等。其中，从萝卜硫素的含量的方面而言，优选为青花菜(Brassica oleraceavar.italica)，更优选为发芽后成为成体之前的发芽青花菜(也称为“青花菜胚芽”)。

另外，作为萝卜硫素的糖苷，可列举：萝卜硫素葡糖异硫氰酸盐等。

对于含有萝卜硫素或其糖苷的植物，可以使用该植物的全部或一部分的粉碎物、冷冻干燥物、榨汁等。例如，对于发芽青花菜，可以优选地使用发芽体的芽、子叶、种子、根的一部分或全草的干燥粉碎物。

作为上述植物的提取物，可列举：通过公知的提取方法进行提取所获得的各种溶剂提取液、其稀释液、其浓缩液或其干燥粉末。作为公知的提取方法，例如，可列举：浸渍、出、浸出、固液提取、回流提取、超临界提取、超声波提取及微波提取等。例如，关于浸渍，可列举：在0℃～溶剂沸点(优选为15～40℃)下，浸渍并浸出1小时～4周。关于固液提取，可列举：在0℃～溶剂沸点(优选为15～40℃)下，以30～1000rpm进行30分钟～2周的搅拌或振荡。另外，为了防止提取物的氧化，也可以并用如下的方法：进行煮沸脱气或通入氮气等惰性气体，从而将溶存氧除去，即，在所谓的非氧化环境下进行提取。另外，在回流提取的情况下，可以使用索氏提取器等提取器具来进行。

作为用于提取的溶剂，也可以使用极性溶剂、非极性溶剂的任一种。作为溶剂的具体例，例如，可列举：水；一元醇、二元醇或多元醇等的醇类；丙酮、甲基乙基酮等酮类；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类；二乙醚、四氢呋喃等链状或环状的醚类；聚乙二醇等聚醚类；己烷等饱和或不饱和的烃类；苯、甲苯等芳香族烃类；二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳等卤代烃类；吡啶类；二甲基亚砜；乙腈；二氧化碳、超临界二氧化碳；油脂、蜡、其他油类；及这些的混合物。从药理活性及通用性的方面而言，可优选地列举：水、醇类及这些的混合液。

作为上述醇类，并没有特别的限定，例如，可列举：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇等一元醇类；1,3-丁二醇、乙二醇、丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇等二元醇类；甘油等三元以上的醇类等。其中，从药理活性及操作性的方面而言，优选为一元醇类及二元醇类。另外，上述醇类优选为碳原子数为1～10的醇，更优选为碳原子数为1～4的醇。

作为上述醇类的优选例，可列举：甲醇、乙醇、1,3-丁二醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、伯丁醇、叔丁醇等。

上述醇类的水溶液中的醇的浓度优选为20质量％以上，更优选为30质量％以上，更优选为40质量％以上，且优选为80质量％以下，更优选为70质量％以下，进一步优选为60质量％以下。另外，上述醇类的水溶液中的醇的浓度优选为20～80质量％，更优选为30～70质量％，进一步优选为40～60质量％。

上述醇类中，从通用性的观点而言，更优选为乙醇。因此，作为用于制备上述植物的提取物的更优选的溶剂，可列举：水、乙醇、乙醇水溶液。

作为提取处理中的溶剂的使用量，相对于植物(干燥质量换算)1g，优选为1～1000mL。此处，在本说明书中，体积表示25℃下的体积。另外，干燥质量表示的是将试样在105℃的电恒温干燥机中干燥3小时而将挥发物质去除后的剩余成分的干燥固形物成分的质量。关于提取条件，只要是能够进行充分的提取处理的条件，则并没有特别的限定。例如，提取时间优选为1小时以上，更优选为3天以上，更优选为1周以上，另一方面，优选为2个月以下，更优选为5周以下，更优选为2周以下。提取温度优选为0℃以上，更优选为5℃以上，另一方面，优选为溶剂沸点以下，更优选为90℃以下。通常，如果是低温，则进行长时间的提取；如果是高温，则进行短时间的提取。作为提取条件的例，可列举：在15～40℃下进行3天～5周、优选为1～2周，在60～90℃下进行1～5小时等，但并不限定于这些，可以由本领域技术人员适当地进行选择。

在本发明中，可以直接使用植物提取物，也可以将该提取物进行稀释、浓缩或干燥后，制备为粉末或糊状而使用。另外，在冷冻干燥后予以使用时，也可以使用通常用于提取的溶剂例如水、乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、水-乙醇混合液、水-丙二醇混合液、水和1,3-丁二醇的混合液等溶剂进行稀释而使用。另外，也可以内包于脂质体等囊泡或微胶囊等中而使用。

对于如此所获得的植物提取物，也可以根据需要而将其供给给通过合成吸附剂进行的处理、过滤处理、浓缩处理等的分离-精制工序，从而提高萝卜硫素的含有比率。作为提高了萝卜硫素的含有比率的发芽青花菜提取物，出售有“青花菜胚芽提取物”(ORYZA油化株式会社)，在本发明中，也可以使用该市售品。

如下述实施例所示，萝卜硫素及作为含有萝卜硫素的植物的发芽青花菜的提取物具有促进CES1的表达的作用，并且，具有降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的作用。

因此，萝卜硫素或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物能够成为感觉刺激降低剂或CES1表达促进剂，能够用于降低感觉刺激的用途、以及用于促进CES1的表达的用途，另外，也可以用于制造感觉刺激降低剂或CES1表达促进剂中的用途。

此处，“用途”可以是向人类或非人类动物的给药或摄取，另外，可以是治疗性用途，也可以是非治疗性用途。另外，所谓“非治疗性”，是指不包含医疗行为的概念，即，不包含对人进行手术、治疗或诊断的方法的概念，更具体而言，不包含医师或接受医师的指示的人对人实施手术、治疗或诊断的方法的概念。

本发明的“感觉刺激降低剂”中的“感觉刺激降低”，是指抑制或缓和由对羟基苯甲酸酯类所引起的皮肤的刺痛感或火辣辣的感觉等一时性的不快的刺激感。此处，“对羟基苯甲酸酯类”是指如上所述的含义。

对于该感觉刺激降低效果，可通过如下所述的实施例中所示的官能评价而测定。

另外，在“CES1表达促进剂”中的“CES1表达”中，包括如上所述的CES1蛋白质的表达、CES1蛋白质的活性、对该蛋白质进行编码的CES1mRNA的表达、及CES1基因的启动子的活性，优选为CES1mRNA表达。

关于感觉刺激降低剂及CES1表达促进剂，可以是单独使用了萝卜硫素或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物的制剂，或者，也可以是与油分、色素、香料、防腐剂、螯合剂、颜料、抗氧化剂、维生素、矿物质、甜味剂、调味料、保存剂、结合剂、增量剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、被膜剂、载体、稀释剂等在医药品、化妆品、准药品、生活用品等各种制剂中所使用的添加剂或赋形剂等组合而成的组合物。另外，对于其形态也没有特别的限定，例如，可以制备为溶液、乳液、悬浮液、凝胶、固体、粉体、颗粒、气溶胶等任意的形态。

关于该组合物中的萝卜硫素或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物的混合量，以萝卜硫素计，为制剂总质量的0.0001质量％以上，优选为0.001质量％以上，更优选为0.01质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上，并且，为99质量％以下，优选为95质量％以下，更优选为90质量％以下，进一步优选为80质量％以下。另外，可列举0.001～99质量％，优选为0.01～95质量％，更优选为0.1～90质量％，进一步优选为1～80质量％。另外，在该组合物中含有“含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物”的情况下，关于其含量，以干燥固形物成分计，为制剂总质量的0.001质量％以上，优选为0.01质量％以上，更优选为0.1质量％以上，进一步优选为1质量％以上，并且，为99质量％以下，优选为95质量％以下，更优选为90质量％以下，进一步优选为80质量％以下。另外，可列举0.001～99质量％，优选为0.01～95质量％，更优选为0.1～90质量％，进一步优选为1～80质量％。

本发明的感觉刺激降低剂或CES1表达促进剂例如可通过混合在上述含有对羟基苯甲酸酯类的组合物(皮肤清洁剂、洗发剂、彩妆剂、沐浴剂、烫发剂、染发剂、肥皂类、厨房用洗涤剂、洗衣用洗涤剂、牙膏类等的化妆品、准药品、医药品、生活用品等)中而使用，或制备为与含有对羟基苯甲酸酯类的组合物不同的组合物，在使用上述组合物的同时、或在使用上述组合物的前后使用，从而能够降低由该对羟基苯甲酸酯类所引起的刺激感。即，关于本发明的感觉刺激降低剂或CES1表达促进剂的应用对象，优选为可列举：使用含有对羟基苯甲酸酯类的组合物、且要求降低由对羟基苯甲酸酯类所引起的刺激感的人类。

在将本发明的感觉刺激降低剂及CES1表达促进剂与含有对羟基苯甲酸酯类的组合物共同使用的情况下，关于感觉刺激降低剂及CES1表达促进剂的使用量，只要能够降低感觉刺激，则并没有特别的限定，例如，相对于对羟基苯甲酸酯类1质量份，将本发明的萝卜硫素或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物，以萝卜硫素计，设为如下的比率：优选为10^-7质量份以上，更优选为10^-6质量份以上，进一步优选为10^-5质量份以上，并且，优选为10质量份以下，更优选为1质量份以下，进一步优选为0.1质量份以下。另外，可设为如下的比率：优选为10^-7～10质量份，更优选为10^-6～1质量份，进一步优选为10^-5～0.1质量份。

关于上述实施方式，在本发明中进一步公开以下的方式。

<1>一种对降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂进行评价或选择方法，其包括以下的(1)～(3)的工序：

(1)使受试物质与可表达CES1的细胞接触的工序；

(2)测定该细胞中的CES1的表达的工序；及

(3)基于(2)中所测定的结果，将促进CES1的表达的受试物质评价为降低因对羟基苯甲酸酯类所致的感觉刺激的感觉刺激降低剂的工序。

<2>如<1>所述的方法，其中，对羟基苯甲酸酯类为选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯及对羟基苯甲酸苄酯中的一种以上。

<3>如<2>所述的方法，其中，对羟基苯甲酸酯类为对羟基苯甲酸甲酯。

<4>如<1>至<3>中任一项所述的方法，其中，可表达CES1的细胞为源自人类表皮组织的细胞，优选为正常人类培养表皮角化细胞。

<5>如<1>至<4>中任一项所述的方法，其中，对于CES1的表达，是以选自CES1蛋白质的表达、CES1蛋白质的活性、对该蛋白质进行编码的CES1mRNA的表达、及CES1基因的启动子的活性中的一种以上作为指标而进行测定，优选为以CES1mRNA的表达作为指标而进行测定。

<6>一种感觉刺激降低剂，其中，以萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物作为有效成分。

<7>一种CES1表达促进剂，其中，以萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物作为有效成分。

<8>萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物在用于制造感觉刺激降低剂中的用途。

<9>萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物在用于制造CES1表达促进剂中的用途。

<10>一种萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物，其是用于降低感觉刺激。

<11>一种萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物，其是用于促进CES1的表达。

<12>萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物在用于降低感觉刺激中的非治疗性用途。

<13>萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物在用于促进CES1表达中的非治疗性用途。

<14>一种降低感觉刺激的方法，其中，使用萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物。

<15>一种促进CES1表达的方法，其中，使用萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物。

<16>如<14>或<15>所述的方法，其中，对使用含有对羟基苯甲酸酯类的组合物的人类使用该方法。

<17>在上述<6>、<8>、<10>、<12>或<14>中，感觉刺激是由对羟基苯甲酸酯类所引起的刺激感。

<18>在上述<6>至<17>中，含有萝卜硫素或其糖苷的植物为发芽青花菜。

<19>在上述<6>至<18>中，将萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物混合于含有对羟基苯甲酸酯类的组合物中而使用，或者，制备为与该组合物不同的组合物，与上述组合物同时或在使用上述组合物的前后使用。

<20>在上述<19>中，将萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物以如下比率使用：相对于对羟基苯甲酸酯类1质量份，萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物的使用量为，以萝卜硫素计，优选为10^-7质量份以上，更优选为10^-6质量份以上，进一步优选为10^-5质量份以上，并且，优选为10质量份以下，更优选为1质量份以下，进一步优选为0.1质量份以下，或者，优选为10^-7～10质量份，更优选为10^-6～1质量份，进一步优选为10^-5～0.1质量份。

<21>在上述<6>至<9>中，组合物中的萝卜硫素、或含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物的混合量为如下：以萝卜硫素计，为制剂总质量的0.0001质量％以上，优选为0.001质量％以上，更优选为0.01质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上，并且，为99质量％以下，优选为95质量％以下，更优选为90质量％以下，进一步优选为80质量％以下，或者，为0.001～99质量％，优选为0.01～95质量％，更优选为0.1～90质量％，进一步优选为1～80质量％。

<22>在上述<6>至<9>中，组合物中的含有萝卜硫素或其糖苷的植物或其提取物的混合量为如下：以干燥固形物成分计，为制剂总质量的0.001质量％以上，优选为0.01质量％以上，更优选为0.1质量％以上，进一步优选为1质量％以上，并且，为99质量％以下，优选为95质量％以下，更优选为90质量％以下，进一步优选为80质量％以下，或者，为0.001～99质量％，优选为0.01～95质量％，更优选为0.1～90质量％，进一步优选为1～80质量％。

[实施例]

以下，基于实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。

参考例1：由对羟基苯甲酸酯类所引起的感觉刺激性的比较(针对三维培养表皮的评价)

使用LabCyte EPI-MODEL24(Japan Tissue Engineering株式会社)作为人类三维培养表皮模型。利用专用分析培养基500μL将培养杯预培养一晩(5％CO₂、37℃)后，将培养杯移到放入有新的分析培养基的24孔板中。在培养杯内的表皮组织中添加对羟基苯甲酸甲酯(MP)或对羟基苯甲酸(PHBA)的16.4mM水溶液50μL，培养6小时后，利用磷酸缓冲液将培养杯内清洗10次，将杯移到放入有新的分析培养基的24孔板，进一步追加培养18小时。追加培养后，使用Human IL-1alpha/IL-1F1 Quantikine ELISA Kit(R&D Systems)，按照附件操作说明，对培养基中的IL-1α量进行定量。将结果示于图1中。

根据图1可知，IL-1α(已知通过感觉刺激物质其产生发生亢进)的量在PHBA中与MP相比非常少，由此，认为：PHBA的感觉刺激性极弱。

参考例2：由对羟基苯甲酸酯类所引起的感觉刺激性的比较(人类评价)

将符合以下所述基准的全部基准的人选作敏感肌肤的被试验者。

1.年龄：20～55岁。

2.性别：女性。

3.自认为是敏感肌肤者。

4.相当于以下的a或b的1个以上者。

a.选择并使用认为是敏感肌肤对应化妆品的制品。

b.在过去1年以内，有过在使用洁面制品、护肤制品或粉底时感到刺痛感、针刺感这样的刺激的情况。

针对所选拔的被试验者，利用以下的方法实施感觉刺痛试验A。

通过使用卸妆剂与洁面制品进行洗面后，在温度23℃湿度50％环境下适应5分钟以上，使浸渗有对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸的16.4mM水溶液600μL的2cm×5cm的无纺布与脸颊部接触，针对从接触开始30秒后、1分钟后、2分钟后、3分钟后、5分钟后的被试验者认知到的感觉刺激(疼痛、感到刺痛、针刺感、抓痛感、温和、发热感)所报告的得分(0：未感觉到任何感觉、0.5：稍许感觉到或少许的不适感、1.0：较少的不适感、1.5：较少～稍微的不适感、2.0：稍微的不适感、2.5：稍微～非常的不适感、3.0：无法忍受或相当多的不适感)的30秒后～5分钟后的所有得分中的最大值减去利用蒸馏水实施同样的试验时的得分的最大值，将所得的值设为感觉刺激得分，并通过威尔科克森符号秩和检验(Wilcoxon'ssigned rank sum test)而进行统计分析。将结果示于图2中。

根据图2可知，PHBA的感觉刺激极弱，由此，认为：对感觉刺激几乎没有贡献。

参考例3：健康肌肤与敏感肌肤的CES1表达量及代谢活性的比较

(1)感觉刺痛试验B

通过使用卸妆剂与洁面制品进行洗面后，在温度23℃湿度50％环境下适应5分钟以上，使浸渗有对羟基苯甲酸甲酯的16.4mM水溶液600μL的10cm²的无纺布与右脸颊部接触，针对从接触开始30秒后、1分钟后、2分钟后、3分钟后的被试验者认知到的感觉刺激所报告的得分(0：未感觉到任何感觉、0.5：稍稍感觉到、1.0：稍许感觉到、2.0：明显地感觉到、3.0：非常强烈地感到，由于强烈的刺激而想要脱离无纺布)的30秒后～3分钟后的所有得分中的最大值设为脸颊部的感觉刺激得分。接着，利用70％异丙醇擦拭右颈部后，使浸渗有对羟基苯甲酸甲酯(MP)的16.4mM水溶液300μL的2cm×2.5cm的无纺布与擦拭部位接触，将针对从接触开始30秒后、1分钟后、2分钟后、3分钟后的被试验者认知的感觉刺激所报告的得分(0：无法感觉到、0.5：稍稍感觉到、1.0：稍许感觉到、2.0：明显地感觉到、3.0：非常强烈地感觉到，由于强烈的刺激而想要脱离无纺布)的30秒后～3分钟后的所有得分中的最大值设为颈部的感觉刺激得分。

(2)被试验者的选拔

从符合以下所述基准的全部基准的人中选拔3名作为健康肌肤者。

·年龄：20～55岁。

·性别：女性。

·自认为并不是敏感肌肤者。

·在感觉刺痛试验B中脸颊部、颈部的感觉刺激得分均为0(未感觉到任何感觉)的人。

从符合以下所述基准的全部基准的人中选拔3名作为敏感肌肤者。

·年龄：20～55岁。

·性别：女性。

·自认为是敏感肌肤者。

·在感觉刺痛试验B中脸颊部的感觉刺激得分为2(明显地感觉到)以上且颈部的感觉刺激得分为0.5(稍稍感觉到)以上的人。

(3)皮肤活组织检查

从健康肌肤者及敏感肌肤者中各选拔3名，从右颈部(实施感觉刺痛试验的部位)利用4mmφ的活组织检查局部取样器而采取皮肤，将采取的皮肤通过液态氮立即冷冻，在-80℃下保存直至解析。

(4)活组织检查皮肤中羧酸酯酶1的表达量及活性

将4mmφ的活组织检查皮肤用手术刀一分为二，将一片用于羧酸酯酶1的表达量解析，将剩余的一片用于羧酸酯酶1的活性解析。

将表达量解析用活组织检查皮肤组织用剪刀剪成碎片，将添加有蛋白酶抑制剂混料(和光纯药工业)的RIPA buffer(和光纯药工业)添加到加入有活组织检查皮肤组织的微型管内(组织重量(mg)×20)μL，利用均质机(Physcotron，MICROTEC NITION株式会社)进行均质化后，在冰上静置30分钟。30分钟后，在4℃下进行2分钟超声波处理，在10,000rpm、4℃下进行20分钟离心，获得其上清液作为皮肤提取液。使用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit，Thermo Scientific公司制)，以牛血清白蛋白(bovineserum albumin)作为标准蛋白质，对皮肤提取液的蛋白质的量进行定量。

以皮肤提取液作为试样以如下所述方式进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹分析。

将皮肤提取液通过SDS-PAGE进行分离后，转录至PVDF膜(BIO RAD)。将转录的PVDF膜浸渍于5％脱脂牛奶液中进行封闭后，使用以1：200进行稀释的抗羧酸酯酶1抗体(R&DSystems，Cat#MAB4920)进行一次抗体反应，使用以1：2000进行稀释的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记抗小鼠IgG抗体(R&D Systems，Cat#HAF007)而进行二次抗体反应。通过Clarity Western ECL Substrate(BIO RAD)进行发光，使用LAS-4000(FUJI FILM株式会社)检测抗体反应。从所拍摄的蛋白质印迹的图像，通过图像解析软件CSAnalyzer(ATTO株式会社)分别选择CES1与肌动蛋白(actin)的带而测定带强度，算出每肌动蛋白的CES1的强度。另外，关于聚丙烯酰胺凝胶上的试样的负载量是否均匀，通过对一次抗体使用抗β-肌动蛋白抗体的同样的实验而验证。

将活性解析用活组织检查皮肤组织用剪刀剪成碎片，添加(组织重量(mg)×20)μL的50mM HEPES/150mM KCl(pH值为7.4)溶液，利用均质机(Physcotron，MICROTEC NITION株式会社)进行均质化后，在10,000rpm、4℃下进行20分钟离心，取得其上清液作为皮肤提取液。使用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit，ThermoScientific公司制)对皮肤提取液的蛋白质的量进行定量。以各皮肤提取液的最终蛋白质浓度成为50μg/mL的方式进行制备，以羧酸酯酶1的基质即对羟基苯甲酸甲酯成为200μM的方式进行添加，在37℃下反应5小时。其后，添加与反应溶液同量的冷乙腈，停止反应，利用HPLC对作为代谢物的对羟基苯甲酸进行定量，将每单位蛋白质、每单位时间的对羟基苯甲酸生成量设为CES1代谢活性。以下显示用于HPLC的机器、色谱柱、测定条件。

机器：Alliance 2695分离组件(Separation Module)、2996光电二极管阵列检测器()Photodiode Array Detector)(沃特世(Waters))

色谱柱：L-column ODS(4.6×150mm、5μm、化学物质评价研究机构)

柱温：40℃

流动相：45％甲醇/0.1％甲酸

流：1.0mL/min

试样注入量：50μL

检测波长：254nm

将结果示于图3及图4中。

根据图3及图4确认到：与健康者的皮肤相比，敏感肌肤者的皮肤的CES1表达量、CES1代谢活性较低。

实施例1：基于CES1表达的发芽青花菜提取物的评价

将正常人类表皮角化细胞(Life Technologies Japan)以各孔成为1×10⁵的方式播种于6-孔板中，利用HuMedia-KG2(Kurabo)培养一晩后，将发芽青花菜提取物(青花菜胚芽提取物；ORYZA油化株式会社，化妆品用)以固形物成分浓度成为0.0001w/v％或0.001w/v％的方式添加到培养基中，培养48小时。利用D-PBS(-)对培养后的细胞进行清洗，使用RNeasy Mini Kits(Qiagen公司)，根据附件指南提取RNA。使用NanoDrop1000(ThermoFisher scientific公司)算出RNA浓度。使用高容量RNA-cDNA试剂盒(High-Capacity RNA-to-cDNA Kit，Life Technologies Japan公司)进行所提取的总RNA(Total RNA)的逆转录反应后，使用7500快速实时PCR系统(7500 Fast Real-Time PCR System，LifeTechnologies Japan公司)实施实时PCR。实时PCR是使用上述中所逆转录的cDNA与CES1或作为内置对照(internal control)的RPLP0的Taqman引物(Life Technologies Japan，CES1：Hs00275627-m1、RPLP0：HS00420895_gH)、Taqman基因表达主混合物(Taqman GeneExpression Master Mix，Life Technologies Japan)，通过ΔΔCT法而对CES1mRNA表达量进行比较。将结果示于图5中。

根据图5确认到：通过发芽青花菜提取物增加了CES1mRNA表达量。

实施例2：发芽青花菜提取物的人类有效性试验

选拔自认为是敏感肌且对于对羟基苯甲酸甲酯(MP)感到感觉刺激的男性作为被试验者，将含有固形物成分浓度0.01％的发芽青花菜提取物(青花菜胚芽提取物；ORYZA油化株式会社，化妆品用)的10％乙醇溶液以1天2次、1次500日元大小的量、历时1周涂抹于被试验者的全脸，对于根据涂抹前后的感觉刺痛试验C的感觉刺激得分进行比较。感觉刺痛试验C是利用以下的方法而实施的。

通过使用卸妆剂与洁面制品进行洗面后，在温度23℃湿度50％环境下适应5分钟以上，使浸渗有对羟基苯甲酸甲酯的16.4mM水溶液600μL的10cm²的无纺布与脸颊部接触，针对从接触开始30秒～3分钟后的被试验者认知到的感觉刺激所报告的得分(0：无法感觉到、0.5：稍稍感觉到、1.0：稍许感觉到、2.0：明显地感觉到、3.0：非常强烈地感觉到，由于强烈的刺激而想要脱离无纺布)中的最大值减去利用蒸馏水实施同样的试验时的得分的最大值，将所得的值设为感觉刺激得分，并通过威尔科克森符号秩和检验(Wilcoxon's signedrank sum test)而进行统计分析。将结果示于图7中。

根据图6确认到：通过发芽青花菜提取物降低了对羟基苯甲酸甲酯的感觉刺激。

实施例3：萝卜硫素的CES1表达促进作用

将正常人类表皮角化细胞(Life Technologies Japan)以各孔成为1×10⁵的方式播种于6-孔板中，利用HuMedia-KG2(Kurabo)培养一晩后，将萝卜硫素(Sigma-Aldrich公司)以最终浓度成为0.1μM、1μM、10μM的方式暴露于细胞中，培养48小时。将培养后的细胞利用磷酸缓冲液(D-PBS(-))进行清洗，使用RNeasy Mini Kits(Qiagen公司)，按照附件指南提取RNA。使用NanoDrop1000(Thermo Fisher scientific)算出RNA浓度。使用高容量RNA-cDNA试剂盒(High-Capacity RNA-to-cDNA Kit，Life Technologies Japan公司)进行所提取的总RNA(Total RNA)的逆转录反应后，使用7500快速实时PCR系统(7500 Fast Real-Time PCR System，Life Technologies Japan公司)实施实时PCR。实时PCR是使用上述中经逆转录的cDNA与羧酸酯酶1或作为内置对照(internal control)的RPLP0的Taqman引物(Life Technologies Japan公司，CES1：Hs00275627-m1、RPLP0：HS00420895_gH)、Taqman基因表达主混合物(Taqman Gene Expression Master Mix，Life Technologies Japan公司)，并通过ΔΔCT法而对基因表达量进行比较。将结果示于表1中。

[表1]

根据表1确认到：通过萝卜硫素增加了CES1mRNA表达量。