具体实施方式

在以下详细描述中，仅通过说明的方式示出和描述了本发明的某些示例性实施方案。如本领域技术人员将认识到的，本发明可以以多种不同的形式实施并且不应被解释为限于本文阐述的实施方案。

本发明的实施方案的方面涉及使用多核苷酸平台(例如，用于从多核苷酸生成明确定义的二维或三维形状的通用结构)到基底上创建的双稳态分子传感器。多核苷酸平台包括但不限于支架脱氧核糖核酸(DNA)折纸(Rothemund,Paul WK."Folding DNA tocreate nanoscale shapes and patterns",Nature 440.7082(2006):297)、支架核糖核酸(RNA)折纸(Torelli,Emanuela等,“Isothermal folding of a light-up bio-orthogonalRNA origami nanoribbon”,Scientific Reports8(2018):6989)、支架杂交DNA:RNA折纸(Wang,Pengfei,等“RNA–DNA hybrid origami:folding of a long RNA single strandinto complex nanostructures using short DNA helper strands”,ChemicalCommunications 49(2013)5462-5464)、无支架DNA单链片(DNA砖)系统(Wei,Bryan,等,“Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles”,Nature 485(2012):623–626和Ke,Yonggang,等,“Three-Dimensional Structures Self-Assembledfrom DNA Bricks”,Science 338(2012):1177-1183)、无支架多链DNA瓦片系统(Winfree,Erik,等,“Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals”,Nature 394(1998)539-44)或RNA瓦片系统(Chworos,Arkadiusz,等,“Building programmable jigsawpuzzles with RNA.”Science 306(2004):2068-72)、分子内折叠单链RNA(Geary,Cody,等,“A single-stranded architecture for cotranscriptional folding of RNAnanostructures”,Science 345(2014)799-804)或单链DNA折纸(Han,Dongran,等,“Single-stranded DNA and RNA origami”,Science 358(2017):eaao2648)，其全部均通过引用整体并入。为了清楚起见，本文将主要在支架DNA折纸作为“分子形状”的特定实例的上下文中描述本发明的实施方案的方面。然而，本发明的实施方案不限于支架DNA折纸。相反，本发明的实施方案包括使用其他多核苷酸平台制成的分子形状，例如上文所列的平台，下面更详细地描述了将本发明的实施方案应用于其他多核苷酸平台的一些实例。

本发明的一些实施方案有两部分：第一，双稳态多核苷酸传感器，其被设计成在施加外部刺激(例如分析物分子的溶液)时改变其状态，和第二，一组协议和方法，其使装置的状态变化能够被记录为DNA序列、光学信号或电子信号。

本文描述了可以在溶液中(图1A)或在表面上(图1B)起作用的双稳态多核苷酸传感器。为了引入双稳态多核苷酸传感器的目的，首先描述了溶液和表面形式的共同特征。在一个实施方案中，双稳态多核苷酸传感器由两个多核苷酸形状组成，通过一个或更多个柔性接头拴系在一起。为了清楚起见，图1中仅描绘了单个接头。

双稳态多核苷酸传感器代表用于检测分子事件的通用平台。为了清楚起见，如图1A-1B所描绘的传感器，其中这些传感器适于检测结合事件，一种通常用于测量分析物分子的浓度的能力。此外，图1A-1B描绘了此类传感器，特别适于以“夹心致动模式”与抗体对一起使用以检测蛋白质，一种通常用于夹心免疫测定(例如ELISA)的能力。随后，图3描绘了用于检测核酸的夹心致动模式。再随后，图4和5描绘了多个实施方案，其突出了可以使用该平台检测和定量的一些其他分子事件，以及关于所涉及的多种分子实体的细节。

因此，夹心致动机制的两个说明性实例(图1A，“溶液形式”和图1B“表面形式”)，每个多核苷酸形状携带“结合分子”(例如适体、抗体、或纳米抗体)，其结合分析物分子或颗粒的独特非重叠区域。在不存在靶标分析物的情况下，两个折纸通过柔性接头相对于彼此移动，称为“打开”的状态。然而，在捕获分析物后，两个折纸结合形成单个半刚性单元，称为“关闭”的状态。在一些实施方案中，折纸中的至少一个携带可用于检测从打开到关闭的状态变化的独特DNA条形码或发光或电子活性信号传导分子。为了清楚起见，在图1A中溶液形式的一个实施方案的描述中，已经省略了一个或两个多核苷酸形状携带发光分子的可能性；然而，在一些实施方案中，为了信号检测的目的，携带发光分子的溶液形式如下所述。

贯穿本公开内容，以下术语可互换使用：双稳态分子传感器、双稳态传感器、双稳态检测器、双稳态装置、双稳态多核苷酸纳米结构、双稳态多核苷酸装置、双稳态多核苷酸传感器、捕蝇器(flytrap)传感器、捕蝇器检测器或捕蝇器。

在本公开内容中，提及双稳态传感器的两个至少半刚性的多核苷酸形状作为“盖子”，并且可以参考图表中这些盖子的取向或相对于表面上双稳态传感器的取向，是指“顶盖”和“底盖”。当这些盖子可以使用如上所述的任何多核苷酸平台实施时，它们是“DNA折纸”。

在本公开内容中，盖子之间的柔性连接作为“接头”或“铰链”。在一些实施方案中，盖子之间可以有多于一个接头，并且在一些实施方案中，单个接头可以由单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、双链DNA螺旋束、双链RNA螺旋束、多核苷酸类似物或非多核苷酸聚合物(例如聚乙二醇(PEG))。根据实施方案，接头的长度可以从单个共价键(约2埃)到多至10,000个核苷酸的双链接头(约3.5微米)变化。使用基于溶液的检测(例如但不限于LRET或可PCR扩增的DNA信号)的实施方案通常使用较短的接头(1nm至10nm)，然而使用基于表面的光学检测或电子检测的实施方案通常使用较长的接头(10nm至4微米)。

虽然双稳态多核苷酸传感器的一些实施方案包含用独立合成的接头自组装的两个独立折叠的DNA折纸形状，但是另一些实施方案包含单个DNA折纸，其中多核苷酸形状和接头都通过单个长DNA支架链折叠。双稳态传感器的又另一些实施方案通过单链DNA瓦片、多链DNA瓦片、单链RNA或DNA折纸或任何其他合适的多核苷酸平台产生。

根据实施方案，由分子事件(例如分析物分子的结合)诱导的状态变化可以通过数种不同方法中的一种在溶液中或在表面上检测，包括但不限于：(1)如果测定在溶液中进行，则状态变化(打开相对于关闭)可以通过编码要定量的分析物身份的独特DNA条形码或通过发光共振能量转移来检测，或(2)如果测定是在表面上进行的，则状态变化可以被记录为光学或电信号的变化，其中双稳态折纸装置在表面上的空间位置编码了被记录的分子事件的性质(例如要定量的分析物的身份)。

对于通过DNA条形码信号的输出提供检测的一些“溶液形式”实施方案，装置的双稳定性允许我们优先除去未结合靶标分析物的装置(图2)。打开的装置具有可用的纯化标签(图2A，例如生物素)，其可以结合亲和柱(例如包含链霉亲和素珠)。剩余的关闭装置，具有结合的分析物，具有隐藏的亲和标签，并且因此它们应该通过具有结合亲和标签的珠的亲和柱(图2B)并且可以被收集用于分析。

一旦从亲和柱上洗脱，基于所附接的DNA条形码，关闭的结合分析物的装置可以通过标准PCR检测或通过定量PCR、液滴数字PCR或下一代DNA测序或深度DNA测序的各种方法进行检测。根据用于检测和定量DNA条形码的确切方法，该装置无需进一步处理和纯化而使用，或者DNA条形码可以从双稳态装置中释放并在读取之前进行纯化。在一些实施方案中，可以通过使用限制酶从双稳态传感器释放DNA条形码，限制酶将条形码分子从传感器上切割。在一些实施方案中，可以通过链置换反应从双稳态传感器释放DNA条形码，如Zhang等,“Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions”,NatureChemistry 3(2011):103-113中所述的，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，DNA条形码不从双稳态传感器释放，并且它被直接读取。

使用DNA条形码信号作为输出的一些基于溶液的实施方案的优点包括：(1)它们可以与现有试剂一起使用(用于标准夹心免疫测定的抗体可以双稳态装置偶联)，(2)除了DNA扩增(例如PCR)所需的仪器之外，它们可以在没有仪器的情况下使用，(3)它们使得能够实现高度多路，在基于荧光的qPCR的情况下至少有8个分析物，并且在下一代测序的情况下至少1000个分析物，以及(4)通过获取双稳态传感器的DNA条形码输出并将其用作液滴数字PCR(ddPCR)的输入，可以使它们高度定量。因此，核酸计数的标准技术(ddPCR)可用于通过使用双稳态传感器对蛋白质分子进行计数。

任何特定的基于溶液的实施方案的灵敏度、假阴性率和假阳性率将通过以下设定：(1)分析物对装置内结合分子的结合亲和力，以及结合的分析物完全关闭装置的程度，(2)纯化标签在结合状态下“隐藏”的程度，以及(3)“未隐藏”的纯化标签允许从溶液中完全去除未结合分析物的装置的程度。例如，如果关闭装置仍然允许小分子纯化标签(如生物素)从折纸表面的孔中略微突出，则一些分析物分子可能丢失在亲和柱上，导致假阴性或蛋白质浓度的低估。类似地，如果分析物与双稳态装置的结合相对较弱，并且该装置不持续关闭，并且它仍然动态地打开和关闭，则它可能丢失在色谱柱上。

因此，在一些实施方案中，另外的“弱锁定”，包含当分析物结合时激活的一对短互补单链DNA，可以减少假阴性。弱锁定倾向于将没有分析物的装置的平衡向关闭配置移动。如果此种装置在关闭配置中花费足够的时间，特别是装置通过柱所需的平均时间，则它可以避免结合该柱并且产生假阳性。

因此，在具有弱锁定的实施方案中，必须调整弱锁定的强度，使得没有分析物结合的双稳态装置的变动(在打开与接近关闭之间)为其结合亲和柱创造足够的机会，它这样做的概率很高。

没有分析物结合的装置必须与柱结合的机会越大，它通过并产生假阳性的机会越低。因此，在一些实施方案中，可以使用多个顺序亲和柱分离来减少假阳性。

关于图1A中弱锁定和亲和标签的外观，为了清楚起见，亲和标签被绘制为设置在单链弱锁定的末端。一些实施方案具有该弱锁定和亲和标签的配置。在另一些实施方案中，弱锁定和亲和标签位于双稳态传感器的内表面上的单独接头上。在另一些实施方案中，在双稳态传感器的内表面上的接头上没有弱锁定和亲和标签。

在弱分析物结合的情况下，其中具有结合分析物的双稳态装置经常变动成打开配置(其中分析物仍然与两个盖中的一个结合)，如果有另外的结合位点可用，则分析物的另外拷贝的结合可用于减少开放配置的频率。因此，在基于溶液的双稳态传感器的一些实施方案中，通过以类似于图4B中的表面上的DNA检测所示的方式(被标记为“协同夹心机制”)在传感器的顶盖和底盖上包含每个结合配偶体的多个拷贝，使用协同性，也可以减少假阴性。

在基于溶液的双稳态传感器的一些实施方案中，在能够测量长寿命发射体的时间分辨发光的商业读板器的广泛安装的基础下，时间分辨光学输出的使用使得能够使用双稳态传感器。在此类实施方案中，基于溶液的传感器不需要DNA条形码、亲和标签或弱锁定。读出基于短寿命(纳秒至微秒)发射体(例如有机荧光团或量子点)与长寿命发射体(毫秒)发光化合物(例如铕和铽螯合物)之间的发光共振能量转移。在此类实施方案中，双稳态传感器的一个盖子用有机荧光团标记。在一些实施方案中，一个盖子上的有机荧光团可以被有机猝灭剂替代。在此类实施方案中，双稳态传感器的第二盖子用长寿命发射体(例如铕和铽螯合物)标记。

根据用于短寿命和长寿命发射体的特定波长，能量转移(从供体到受体)可以从短寿命发射体到长寿命发射体，反之亦然。在任一种情况下，在短寿命发射体的衰变寿命结束后，使用脉冲激发光并进行时间分辨测量。通过这种方式，所有散射的激发光已经消散，唯一测量到的信号是在短寿命与长寿命发射体之间转移的信号，大大提高了信噪比并且因此提高了测定的灵敏度。此类测量背后的一般原理，发光共振能量转移(LRET)先前已经在Selvin等,“Luminescence Resonance Energy Transfer”Journal of the AmericanChemical Society,116(1994):6029-6030中被描述，其全部内容通过引用并入本文。

在另一方面，如果双稳态传感器固定在表面上(图1B)，则分析物的结合可以被识别为电子(图6)或光学(图7)测量的状态变化。用于检测双稳态装置状态变化的基于表面的方法的每个实施方案与解决方法相比具有一组不同的假阳性和假阴性误差机制，并且因此在一些实施方案中，检测可能比另一些中的更加定量。例如，如随后针对一些实施方案讨论的，在不存在分析物的情况下，当顶部折纸形状与表面非特异性地结合(图9A)时，可能发生假阳性。

像一些溶液实施方案一样，一些基于表面的实施方案实现了高灵敏度测量。一些基于表面的实施方案通过使用TIRF显微术实现高灵敏度(如Gietl等“DNA origami asbiocompatible surface to match single-molecule and ensemble experiments”Nucleic Acids Res.40(2012):e110和Tsukanov等,“Detailed study of DNA hairpindynamics using single-molecule fluorescence assisted by DNA origami”,Phys.Chem.B 117(2013):11932–11942中关于单个折纸所述的)或电化学检测(如Lai,“Chapter Eight:Folding-and Dynamics-Based Electrochemical DNA Sensors”,Methods in Enzymology,589(2017):221-252；Immoos等,“DNA-PEG-DNA triblockmacromolecules for reagentless DNA detection”,Journal of the AmericanChemical Society 126(2004):10814–10815；Wu等,“Development of a“signal-on”electrochemical DNA sensor with an oligo-thymine spacer for point mutationdetection”,Chemical Communications,49(2013):3422–3424；和Wu等,“Effects of DNAprobe and target flexibility on the performance of a“signal-on”electrochemical DNA sensor”Analytical Chemistry 86(2014)8888–8895中关于小核酸重配置所述的)，所有这些的全部内容通过引用并入本文，其中表面上分析物核酸与核酸的结合带来邻近表面的电化学活性官能团(二茂铁或亚甲蓝)，其中它可以被电学检测到。

在一些实施方案中，基于表面的光学和电子测量可以通过使用DNA折纸定位技术从模拟测量转换为数字测量。数字测量可以使用DNA折纸来实现，因为单个DNA折纸几乎可以确定性地(>95％的位点具有单个折纸)使用用于设置它们的光刻技术被隔开到表面上的网格中，如Kershner等,"Placement and orientation of individual DNA shapes onlithographically patterned surfaces",Nature Nanotechnology 4(2009):557–561；Hung等,"Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed bylithographically confined DNA origami",Nature Nanotechnology 5(2010):121-126；Gopinath等,"Optimized Assembly and Covalent Coupling of Single-Molecule DNAOrigami Nanoarrays",ACS Nano 8(2014):12030–12040；和Gopinath等,"Engineeringand mapping nanocavity emission via precision placement of DNA origami",Nature 535(2016):401-405，其全部内容通过引用并入本文。这种先前所述的“DNA折纸放置”技术使单个双稳态传感器能够以>95％的概率设置在单个光学或电子装置上，并且因此>95％的传感器可用于感测靶分子。这与依赖泊松统计来用单个分析物核酸占据液滴的液滴数字PCR形成对比，在不超过37％的液滴中实现单一核酸。因此，用于读出双稳态传感器的基于表面的方法的一些实施方案可以比依赖液滴数字PCR进行读出的一些基于溶液的方法给出更加定量的结果。

一些基于表面的实施方案通过使用广泛可用的技术来印刷对不同分析物具有特异性的表面固定装置的斑点，来实现高度多路。图10示出了每个斑点具有数千个具有相同结合分子对的装置，但是不同斑点具有不同的结合分子对。一些实施方案使用喷墨印刷实现这种空间多路，另一些实施方案使用微阵列点样实现多路。

类似于一些基于溶液的实施方案，一些基于表面的实施方案可以使用现有的夹心ELISA试剂用于结合靶分子，但是此类实施方案可能需要另外的材料(电子或光学芯片)和仪器(电子阅读器或TIRF/其他光学阅读器或显微镜)。

本发明的一些实施方案展示了具有以下特性中的一个或更多个的测定的第一实例：(1)基于隐藏纯化标签的原理，双稳态DNA纳米结构装置将分析物结合信号转换为独特且可放大的DNA信号(将装置的状态从打开改变为关闭)。(2)具有多种基于表面的方法的测定，用于灵敏地测量在结合单一分析物分子时将大且柔性的双稳态DNA装置转化为小且紧凑的刚性装置。(3)具有以下能力的测定：基于所述的双稳态DNA纳米结构装置，在溶液中通过PCR/测序或在表面上通过光学或电子信号的空间位置对多个分析物进行多路定量测量。(4)可以在与数字液滴PCR相同的规模下提供蛋白质分子的数字定量的测定。

本发明的一些实施方案提供了对现有电化学测定的显著改进。所述的基于折叠的测定(Lai,“Chapter Eight:Folding-and Dynamics-Based Electrochemical DNASensors”,Methods in Enzymology,589(2017):221-252；Immoos等,“DNA-PEG-DNAtriblock macromolecules for reagentless DNA detection”,Journal of theAmerican Chemical Society 126(2004):10814–10815；Wu等,“Development of a“signal-on”electrochemical DNA sensor with an oligo-thymine spacer for pointmutation detection”,Chemical Communications,49(2013):3422–3424；和Wu等,“Effects of DNA probe and target flexibility on the performance of a“signal-on”electrochemical DNA sensor”Analytical Chemistry 86(2014)8888–8895)已用于检测由于核酸通过电化学感测(使用二茂铁或亚甲蓝信号传导分子)与表面上的检测器结合而引起的构象变化。在这种环境下，当分析物核酸结合并且折叠整个结构使得信号传导分子靠近表面时，单个核酸使单个信号分子靠近表面。

本公开内容的实施方案在重要方面不同：(i)所公开的工作使蛋白质或任意分析物能够被检查，其中先前的工作限于DNA或RNA。(ii)先前的工作对每个结合事件使用单个信号分子。目前公开的使用DNA折纸或另一大的DNA纳米结构意味着目前公开的信号可能更强；至少200个信号分子可以并入一个折纸上，提供了使得本测定原则上更加灵敏200倍的放大。(iii)先前的工作仅将检测分子折叠了几纳米。这意味着信号分子从非活性(无分析物)状态到活性(分析物结合)状态不移动很远。反过来，这意味着非活动状态和活动状态没有它们应有的那么大的区别，并且该测定也没有它应有的潜在灵敏。在目前公开的工作中，栓链可以长达几微米长(完全可调降到几纳米)。这允许将携带信号传导分子的折纸设置在表面上方的最佳高度处，以使非活动状态的信号最小化，从而使对分析物结合状态的灵敏度最大化。在先前的工作中，短接头将检测方法限制在电化学感测上。在目前公开的工作中，因为接头可以足够长(例如200纳米)以将信号传导分子显著移出非活动状态下的TIRF基底的瞬逝场，因此TIRF显微术能够实现更高的灵敏度。

本发明的实施方案提供了对现有基于TIRF的测定的显著改进。TIRF先前已用于表面结合折纸，用以检测分子结合或构象变化(Gietl等“DNA origami as biocompatiblesurface to match single-molecule and ensemble experiments”Nucleic AcidsRes.40(2012):e110和Tsukanov等,“Detailed study of DNA hairpin dynamics usingsingle-molecule fluorescence assisted by DNA origami”,Phys.Chem.B 117(2013):11932–11942)。这些研究支持目前公开的方法可用于定量低体积/低浓度/单分子方案中的蛋白质。然而，这些先前的研究：(i)研究的是核酸而不是蛋白质，并且没有给出使用两个结合分子同时结合分析物的功能(如在夹心测定中)。(i)使用单个信号传导分子研究非常简单的发夹或霍利迪连接体的构象变化。目前公开的更大的装置具有超过200个信号传导分子，用于分子事件的更大放大和灵敏度。(ii)使用短接头/小构象变化。同样，目前公开的工作使用了非常大的构象变化，这使相同数量的信号传导分子具有更高的灵敏度。

双稳态折纸检测器具有优于其他潜在方法的几个优点。在免疫测定(其也应用于DNA和RNA检测，但是通常不用于核酸检测)的词语中，双稳态检测器可以用作“均相测定”的基础，其中可以简单地将要分析的样品添加到检测器中，而无需任何将检测系统的组分混合在一起的要求，并且重要的是无需洗掉额外的样品，或添加二次检测系统。这意味着检测实验可以直接且快速地进行。其次，因为折纸结构域通常非常大(几兆道尔顿)，故它们通常比要检测的分子(千道尔顿至数十千道尔顿)大100-1000X倍。这意味着折纸可以携带大量的信号传导分子，其无需使用二次放大系统，就可以给出200倍的放大。

在图1和图2中，描绘了使用抗体来检测蛋白质的采用夹心致动机制的实施方案。图3描绘了采用夹心致动来检测核酸的不同实施方案。图3A示出了表面上的捕蝇器装置的基本几何形状。它包含两个100纳米直径的DNA折纸盘或“盖子”，以及其间的10纳米至4,000纳米双链DNA接头。单链靶核酸序列XY的检测由一对探针X'和Y'介导，该探针X'和Y'各自与靶序列的一半互补并且分别与顶盖和底盖的内侧结合。

在不存在XY的情况下，捕蝇器的盖子独立地扩散，受栓链约束，在本公开内容中称为“打开”状态。当结构域X和Y都与捕蝇器上的互补探针结合(在本公开内容中称为“关闭”状态)时，装置的两个盖子共定位，其中距离由选择的特定探针-靶标/装置几何形状设定。例如，如果选择探针使得它们在探针-靶标双链体末端的位置栓系在盖子上，则盖子保持在大致等于单个探针-靶标双链体长度(一对10聚体探针约7nm，一对20聚体探针约14nm)的两倍的距离处。在另一方面，如果选择探针使得它们以使接头邻近探针-靶标双链体的中间的几何形状栓系在盖子上，则盖子可以保持在大致2-4纳米(至多两个DNA螺旋的宽度)的距离(与靶序列的长度无关)处。

图3C中描述的捕蝇器对于检测单链DNA、单链RNA或其他单链多核苷酸类似物是最有效的。对于特定的DNA双链体序列，即能够形成DNA三螺旋的那些序列，图3C中的捕蝇器可用于检测双链DNA，尽管DNA三螺旋形成的动力学很慢，并且靶标分析物被限制为多聚嘌呤:聚嘧啶三链体形成序列。

在另一方面，通过使用dCas9/CRISPR复合物，有可能产生能够通过两种不同方法有效检测双链DNA的捕蝇器。在CRISPR系统中，dCas9蛋白与gRNA复合，每个gRNA具有20-核苷酸的RNA“指导”序列。在dCas9的帮助下，指导序列可以链置换成合适的双链DNA，并且基本上不可逆地结合互补靶标。

因此，在一些实施方案(图3D)中，每个盖子具有所附接的gRNA，该gRNA具有两个不同的指导序列中的一个，被选择以使得它们结合目标DNA序列中相邻的20-核苷酸靶标对。在引入分析物DNA之前，dCas9蛋白被引入并且组装到gRNA上。因此，两个CRISPR/dCas9复合物与单个双链分析物DNA的同时结合关闭捕蝇器。

在此种实施方案中，事先声明的是，靶序列必须与具有特定共有序列(例如NGG)的所谓PAM位点相邻。因此，在天然DNA的情况下，使用常规dCas9的检测限于巧合地具有两个适当间隔的PAM位点(约50个核苷酸内)的DNA序列。最近分析的GFP构建体用作基于CRISPR的基因调控实验中的对照，并且发现几段DNA在适合于图3D中描绘的双靶标检测方案的距离处具有双重出现的PAM位点。此外，在一些实施方案中，来自除化脓链球菌(S.Pyogenes)之外的生物体的Cas蛋白(或任何合适的核酸内切酶)和对其PAM位点具有不同序列特异性的基因工程化核酸内切酶蛋白(例如，Cas9)使得能够检测更大范围的序列。在其中靶标分析物是用于条形码方案或DNA存储的人工DNA的情况下，当必要时添加PAM位点对并不困难。

具有此类双靶标方案的实施方案的优点在于它们使用标准gRNA序列。此外，原子力显微术(AFM)数据(图3F)表明，具有人工指导序列的dCas9容易结合折纸边缘的短人工靶标。因此，CRISPR/dCas9复合物与DNA折纸在期望位置很好地整合。双靶标方案需要CRISPR/dCas9的DNA结合部分是游离的，而不是与折纸结合，如图3F所示。因此，在一些实施方案中，gRNA的3'延伸用于将CRISPR/dCas9复合物固定到捕蝇器上。

此类双靶标方案的限制序列约束是它们需要DNA分析物具有两个靶标/PAM位点，以及至少46个核苷酸的长度。另一些实施方案能够检测具有较少序列约束的双链DNA。动态DNA和RNA纳米技术利用非平衡DNA反应来创建有序事件的级联(如Zhang等,“Dynamic DNAnanotechnology using strand-displacement reactions”,Nature Chemistry 3(2011):103-113中所述)。一个经典实例是所谓的发夹-链反应。这种类型的反应使序列能够通过形成发夹的另一保护序列保持“隐藏”，直到触发序列结合。

因此，隐藏序列以产生所谓的“变构”CRISPR/Cas9复合物的原理可用于实现双链DNA传感器(图3E)。设置捕蝇器底盖上的变构CRISPR/Cas9在与其靶双链序列X结合时，显示出与捕蝇器盖子上的序列hY'互补的新序列hY，导致捕蝇器关闭。为此，可以使用新序列延伸gRNA的5'末端，该序列与指导序列形成发夹。因此，指导序列用于隐藏和保护序列hY免受hY'的影响，直到目标双链DNA(X)结合变构CRISPR/Cas9。

在此术语变构的使用与文献中变构的标准使用一致，但是有些不寻常。根据定义，变构仅仅涉及一个分子(效应子A)将第二分子B(通常是蛋白质)的结合或活性改变为第三分子C的能力。在此给出的变构方案中，目标双链DNA起效应子A的作用，CRISPR/dCas9复合物起B的作用，并且捕蝇器盖子上的序列起C的作用。图3E中的方案不寻常，因为变构通常定义在蛋白质的“正常”活性上。在此，蛋白质的“正常”活性用作变构触发器以打开或关闭蛋白质的新功能——结合捕蝇器盖子。尽管已经描述了标准变构，其中小分子(4-羟基三苯氧胺)转变CRISPR/cas9的活性，但是不认为这类方案已经在CRISPR/cas9的文献中报道(Oakes等“Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch”,Nature Biotechnology 34(2016):646-651)。

图3E中用于检测双链DNA的变构方案的优点在于它仅需要单个20-核苷酸靶标加上其3-核苷酸PAM位点。注意的是，XRN-1 5'-to-3'核酸外切酶或其他活性显现了抑制向酵母和哺乳动物细胞中体内gRNA的5'末端中的有用添加功能序列(此类添加不受Cas9的蛋白质信封保护)。在此，因为正在进行体外DNA检测，故此类延伸不会降解。在一些实施方案中，可以使用小(<10nt茎)发夹来避免在指导的重要的前10个核苷酸(靠近PAM位点)处干扰CRISPR/Cas9 DNA复合物的起始，并且使传感器的灵敏度最大化。

在一些实施方案中，一些目标天然序列不可避免地缺少NGG，但是在这些情况下，使用具有不同PAM位点的不同天然或突变CRISPR系统(例如来自普雷沃菌(Prevotella)和弗朗西斯氏菌(Francisella bacteria)的Cas-蛋白Cpfl，具有其TTTN PAM位点)大大地增加找到可用靶序列的机会。此外，与dCas9相比，Cpf1具有完全不同的gRNA结构和3'末端指导序列，这可以证明与一些靶序列更相容。因此，在一些实施方案中，使用CRISPR/Cpf1代替CRISPR/dCas9。

在图1-3中，描述了使用夹心致动机制来检测和定量分子结合事件以对分析物(例如蛋白质和核酸)进行定量的实施方案。图4和图5描述了另外上下文中的双稳态分子传感器。基本的双稳态传感器设计具有数种“致动机制”，其中传感器顶盖和底盖的作用相对于分子事件的检测具有不同的作用，并且基于分子事件是否是结合事件、构象变化或其他分子事件，这些作用不同。如图4A、4C和4D所示，区分传感机制是夹心机制“”(图4A，对于结合事件)、“竞争机制”(图4C，对于结合事件)还是“功能机制”(图4D，对于由分子或物理环境、酶促或化学切割、或酶促或化学修饰引起的构象变化)。另外，被描述为以夹心、竞争或功能机制运作的传感器还可以描述为以非合作或合作机制运作(例如图4B)。

夹心致动机制(图4A)已经在“夹心”设计中被描述，其中靶标分析物的一对结合配偶体(抗体、RNA或DNA适体、天然结合蛋白等)分别设置在传感器的顶盖和底盖。夹心机制有利于检测分析物的存在或不存在或测量浓度。在抗体用作结合配偶体的情况下，夹心测定与夹心免疫测定(例如夹心ELISA)相当。

对于特定的目标分子分析物，如果可以找到一对合适的结合配偶体，则夹心机制(图4A)适合于其检测。对于较大的靶标分析物(例如蛋白质)，通常是该情况，对于其可以找到两个不同的表位，其中一个结合配偶体对每个表位具有亲和力。对于其中靶标分析物是单链DNA或单链RNA的情况，两个结合配偶体可以是单链的，其中每个结合配偶体自身是单链DNA或RNA，与靶标分析物的不同区域或子序列互补。在其中靶标分析物是双链DNA、RNA:DNA杂交或双链RNA的情况下，结合配偶体可以是(1)靶标分析物的两个不同区域或子序列处的单链DNA或RNA(在这种情况下，在形成三链体后传感器关闭)，或(2)结合配偶体可以是能够在两个位置特异性结合靶标的核酸/蛋白质复合物(例如CRISPR/dCas9)(如图3D所示)，(3)结合配偶体可以是变构CRISPR/dCas9复合物(如图3E所示)或(3)结合配偶体可以是能够在两个区域或子序列处序列特异性地结合靶标的锌指蛋白或肽分子，或(4)能够在两个不同区域序列特异性地结合靶标的任何一对分子。

竞争致动机制(图4C)针对以下情况进行描述：其中传感器的底盖保持靶标分析物的单个结合配偶体(抗体、RNA或DNA适体、天然结合蛋白等)，并且传感器的顶盖保持竞争分子，其可以以类似于靶标分析物的方式结合底盖上的结合配偶体。竞争机制有利于检测分析物的存在或不存在或测量浓度。在结合配偶体是抗体的情况下，竞争机制类似于竞争性免疫测定。在其中靶标分析物太小或表面太对称或化学上未分化而无法找到靶标的两个不同结合配偶体的情况下，竞争机制有用。对于小分子(例如典型的药物或许多激素)，通常是该情况。竞争致动机制仅需要针对特定靶标分析物的单个抗体或单个适体的事实使得竞争致动机制可用的潜在分析物数量远大于夹心致动机制可用的潜在分析物数量，这需要找到目标靶标的两种抗体或两种适体。

在竞争致动机制中，根据结合和竞争者非特异性结合与传感器邻近的基底表面的潜力(这通常导致假阴性信号)，顶盖和底盖的作用可以互换；通常选择对背景表面具有较低非特异性亲和力的分子以设置在盖子上。

竞争分子可以是以下实例：靶分子、可以结合结合配偶体的靶分子的相关分子、或可以在靶标通常结合的位点处结合结合配偶体的任何其他分子。这使得竞争者在结合结合配偶体时阻断或以其他方式抑制靶标的正常结合。类似地，靶标分析物具有结合结合配偶体和抑制结合竞争者的能力。在不存在靶标的情况下，竞争者经常结合结合配偶体，并且传感器的顶盖花费更多时间靠近底盖和表面，产生信号。在靶标的存在下，靶分子结合一些传感器底盖上的结合配偶体，并且减少竞争者与结合配偶体结合的时间量，并且因此改变信号。随着靶标浓度增加，靶标在结合配偶体上的占有率更高，传感器更常打开，并且顶盖花费更长时间离开表面，增强了信号变化。

分析物的存在增加打开状态的概率的事实不意味着竞争致动机制的所有实施方案都必须是“信号关闭”检测器。因此，根据用于产生和测量信号的特定感测模式，竞争致动机制中的信号变化可以是正的或负的。例如，竞争性测定可以与光学感测模式一起使用，其中盖子用第一荧光团标记。在底盖用第二荧光团标记的情况下，那么添加靶标导致第一荧光团与第二荧光团之间的FRET减少，减少来自第二荧光团的信号，从而执行“信号关闭”检测器。在底盖用荧光猝灭剂标记的情况下，那么添加靶标减少第一荧光团与猝灭剂之间的猝灭，从而执行“信号开启”检测器。因此，如对于其他致动机制，竞争机制可以根据需要导致传感器的信号开启和信号关闭。

功能致动机制(图4D)使得能够更一般地检测分子事件，包括一类分子而不是单个靶标分析物的结合、酶促或化学活性(包括切割或连接)、或酶促或化学修饰(例如磷酸化、甲基化或乙酰化)。在功能机制中，顶盖和底盖各自携带功能配偶体(分别为功能配偶体1和功能配偶体2)，其彼此结合或在外部刺激的存在下释放，外部刺激可以是小分子或蛋白质酶，但是也可以是物理条件，例如温度、光、pH或离子强度的变化。

通常，顶盖和底盖的作用可以互换，即功能配偶体1可以在顶盖上并且功能配偶体2可以在底盖上，反之亦然。因此，选择哪个功能配偶体放在顶盖上通常取决于哪个功能配偶体与背景基底的非特异性结合最低。然而，在一些实施方案中，例如当功能配偶体之一是跨膜蛋白时，当跨膜蛋白附接到顶盖并且另一个功能配偶体附接到底盖时，可以提高传感器的性能。在许多实施方案中，外部刺激导致功能配偶体1的构象变化，这改变其对功能配偶体2的亲和力。在此类实施方案中，功能配偶体2是针对功能配偶体1产生的抗体，使得它在特定的构象状态下结合功能配偶体1，而不是另一构象状态。在许多实施方案中，外部刺激导致功能配偶体1的化学修饰(例如磷酸化)，这改变其对功能配偶体2的亲和力。在此类实施方案中，功能配偶体2是针对功能配偶体1产生的抗体，使得它在特定修饰状态(例如磷酸化)下结合功能配偶体1，而不是另一构象状态(例如未磷酸化)。

因此，在功能致动机制的一个实施方案中(图4E)，能够检测丝裂原激活蛋白激酶(MAPK，例如P42或P44)被丝裂原激活蛋白激酶激酶(MAPKK)或任何其他磷酸化MAPK的试剂的磷酸化。在该实施方案中，功能配偶体1是MAPK(在底盖上)，并且功能配偶体2是仅与磷酸化形式的MAPK结合的抗体(抗磷酸化-MAPK)。当MAPK未磷酸化时传感器打开，当它被磷酸化时传感器关闭。类似的实施方案可以通过用任何可以修饰(通过甲基化、磷酸化或乙酰化)的蛋白质替代功能配偶体1并用仅结合修饰形式的配偶体1的结合配偶体替代功能配偶体2来构建。

因此，在功能致动机制的一个实施方案中，能够检测蛋白质受体(例如任何G-蛋白偶联受体(GPCR))的配体、激动剂或拮抗剂。在该实施方案中(图4F)，功能配偶体1是基于蛋白质的脂质纳米盘(如Bayburt等,"Membrane Protein Assembly into Nanodiscs"FEBSLetters 584(2010):1721–1727中所述)，或基于DNA的脂质纳米盘，如Zhao等,"DNA-Corralled Nanodiscs for the Structural and Functional Characterization ofMembrane Proteins and Viral Entry,Journal of the American Chemical Society,140(2018):10639–10643and Iric et al"DNA-Encircled Lipid Bilayers"Nanoscale(2018)DOI:10.1039/C8NR06505E中所述)，其中跨膜受体蛋白(例如μ-阿片受体(一种原型GPCR))负载到纳米盘的脂质部分，所有这些的全部内容通过引用并入本文。出于溶解膜蛋白的目的，基于蛋白质的脂质纳米盘得到了充分研究，并且它们可以与DNA链连接，如同上Zhao等中教导的，从而提供了将功能配偶体1附接到顶盖的方法。类似地，如同上Zhao等和Iric等中公开的，基于DNA的脂质纳米盘可以用膜蛋白负载，并且可以负载到传感器的顶盖，或可以直接用作传感器的顶盖。功能配偶体2是一种蛋白质，例如B-抑制蛋白，当受体蛋白结合配体时，其对跨膜蛋白的亲和力改变。在使用β-抑制蛋白作为功能配偶体2的特定情况下，顶盖中GPCR的配体结合和激活导致溶液中存在的G-蛋白偶联受体激酶(GRK)使GPCR磷酸化，这导致β-抑制蛋白结合GPCR并且关闭传感器。该实施方案提供了在体外无细胞环境中筛选用于GPCR的药物的一般方法。在这种环境下，传感器不简单地结合并感测特定的靶标分析物，而是对影响要研究的受体的正常生物学功能的任何分子做出反应。在这种情况下，功能传感器被称为“类检测器”。

上述检测器是用于检测GPCR的配体结合的天然β-抑制蛋白途径的最忠实模拟物。通过将β抑制蛋白的身份从β抑制蛋白1(又称为“抑制蛋白2”)变为β抑制蛋白2(又称为“抑制蛋白3”)，有可能检测和研究所谓的偏向激动的不同方面，其中不同的GPCR的配体具有略微不同的作用并且刺激不同的下游途径，并且有可能研究所谓的对β抑制蛋白1和β抑制蛋白2具有不同亲和力的A类与B类GPCR之间的差异，如Oakley等,"Differential Affinitiesof Visual Arrestin,Arrestin1,and Arrestin2 for G Protein-coupled ReceptorsDelineate Two Major Classes of Receptors"

The Journal of Biological Chemistry 275(2000)17201-17210中教导的，其全部内容通过引用并入本文。类似地，不同的GRK(GRK2到GRK6)与不同的GPCR具有不同的相互作用，因为它们根据GPCR类型和特定配体在不同残基上使GPCR磷酸化，如Yang等,"Phosphorylation of G Protein-Coupled Receptors:From the Barcode Hypothesis tothe Flute Model"Molecular Pharmacology 92(2017)201-210中教导的，其全部内容通过引用并入本文。因此，在一些实施方案中，将两种类型的β抑制蛋白和五种不同的GRK的不同组合组合。

在一些实施方案中，为了产生不需要在溶液中使用GRK的传感器，将期望的GRK类型与DNA缀合并且与β抑制蛋白一起放在捕蝇器的底盖上。以这种方式，信号传导途径的所有必要组分都被组合到单个双稳态检测器中，并且为了感测，只需要添加配体。在此类实施方案中，当配体被结合并且GPCR被激活时，捕蝇器的顶盖首先与底盖上的GRK瞬时相互作用并且GPCR被磷酸化并释放。然后，顶盖中的磷酸化GPCR通过与β抑制蛋白结合第二次与底盖相互作用，并且检测到持续信号。

本发明的另一些实施方案使用抗体来检测GPCR的配体结合，而不需要β抑制蛋白。在一个实施方案中，顶盖具有附接的GPCR(例如，μ-阿片，如上)，但是底盖没有β抑制蛋白。相反，它具有针对GPCR磷酸化状态产生的抗体，如Mouledous等,“GRK2 Protein-mediatedTransphosphorylation Contributes to Loss of Function of mu-Opioid ReceptorsInduced by Neuropeptide FF(NPFF2)Receptors”The Journal of BiologicalChemistry,287(2012)12736-12749和Just等"Differentiation of Opioid Drug Effectsby Hierarchical Multi-Site Phosphorylation"Molecular Pharmacology 83(2013)633-639中教导的，其全部内容通过引用并入本文。因此，当配体被结合并且GRK使受体磷酸化时，抗-磷酸化-抗体结合GPCR，关闭捕蝇器并且诱导信号。此类实施方案允许研究配体结合，而不需要β-抑制蛋白与GPCR相互作用的特定特征，并且针对不同磷酸化模式的抗体的使用使得能够研究GPCR的磷酸化密码(Yang等，同上)。

本发明的又另一些实施方案使用纳米抗体来检测GPCR的配体结合而不需要β抑制蛋白或GRK。在一个实施方案中，顶盖具有附接的GPCR(例如，μ-阿片，如上)，但是底盖没有β抑制蛋白，并且溶液中不存在GRK，它也不附接到底盖。相反，针对GPCR的活性配体结合状态产生的纳米抗体附接到底盖上。此类纳米抗体的产生在Huang等,“Structural insightsinto mu-opioid receptor activation”Nature 524(2015)315-321中教导，其全部内容通过引用并入本文。在配体的存在下，GPCR被激活，并且纳米抗体结合GPCR并关闭捕蝇器，并且诱导信号，与GPCR是磷酸化还是非磷酸化无关。在比上述β抑制蛋白途径的模拟物更简单的此类实施方案中，检测器对于长期储存和运输可以更加稳定，生产可以更便宜，并且因此在诊断环境中可以更有用。特别是对于具有μ-阿片受体的实施方案的情况，捕蝇器检测器可用于执法以检测阿片类药物是否存在于未知样品中，或存在于受污染的建筑物中。

因此，在功能致动机制的一个实施方案中，能够通过“核糖开关”的构象变化对小分子靶标进行检测和浓度测量。可以通过人工分子进化(SELEX)选择RNA和DNA适体以结合目标小分子靶标。但是(A)此类靶标通常太小而无法通过夹心致动机制检测，并且(B)根据靶标和适体的结合特性，可能难以构建灵敏的竞争致动机制。在此类情况下，使用具有核糖开关的功能性致动机制可以直接检测小分子而无需竞争。在此类实施方案中，适体被修饰成核糖开关，使得在结合小分子靶标时，它经历构象变化以暴露DNA或RNA序列(图5A)或RNA-蛋白质(图5B)或DNA-蛋白质结合结构域。因此，核糖开关可以用作一个功能配偶体，并且蛋白质、DNA或RNA分子可以用作第二功能配偶体。特别地，一些实施方案可以使用RNA核糖开关，其在结合靶小分子时暴露常用的MS2适体，其中MS2适体随后结合附接到另一盖子的MS2-病毒主要外壳蛋白(MCP)(图5B)。

因此，在功能致动机制的一个实施方案中，检测了两种蛋白质、两种核酸或其杂交体的化学或酶促连接(接合或偶联)(图5C)。在此种实施方案中，功能配偶体1和功能配偶体2是要测量其连接的两个分子。化学或酶促连接剂的引入导致功能配偶体1和2共价结合在一起，从而导致传感器关闭并且生成信号。在此类实施方案中，要测量的是连接剂的存在或不存在、活性强度或浓度。

在功能致动机制的一个相关实施方案中，检测了蛋白质或DNA的化学或酶促切割(切割(cutting))(图5D)。此类实施方案呈现与涉及连接的实施方案相反的情况。在此实施方案中，功能配偶体1和功能配偶体2以这样的状态制备，使得它们作为单个结合实体存在或在测量之前预连接。化学或酶促切割剂的引入将功能配偶体1和功能配偶体2彼此分开，从而导致传感器打开并且生成信号。在此类实施方案中，要测量的是切割剂的存在或不存在、活性强度或浓度。

本发明的一些实施方案可以通过使用协同性来增强。可以通过增加传感器顶盖和底盖上存在的结合配偶体、竞争者或功能配偶体的数量，来给夹心(图4D)、竞争或功能致动传感器增添协同性。

其中双稳态分子传感器固定在表面上的实施方案可以使用数种广为人知的检测方式之一电子或光学地读出。图6示出了三种不同的装置结构，其可用于电子读出双稳态分子传感器的表面上的实施方案。

在图6A中，双稳态分子传感器固定在标准平面半导体晶体管的栅极区域的顶部。在此，在“打开”或“关闭”状态下的传感器以可通过晶体管特征定量的方式影响晶体管栅极周围的局部离子环境。例如，晶体管可以被偏置，使得传感器处于“打开”或“关闭”状态直接导致晶体管被“开启”或“关闭”。

先前已经描述了由经典半导体材料构建的生物感测FET(Veigas等,“FieldEffect Sensors for Nucleic Acid Detection:Recent Advances and FuturePerspectives”Sensors 15(2015):10380-10398)。

在图6B中，双稳态分子传感器固定在场效应晶体管(FET)的沟道区域上，该沟道区域由低维材料(例如一维(1D)材料(碳纳米管或硅纳米线)或二维(2D)材料(石墨烯、二硫化钼[MoS₂]或氧化铟薄层))构建。在此，FET由一个沟道组成，该沟道由1D或2D材料制成，位于两个电极之间，带有栅极触点(在溶液中)以调节沟道的电子反应。在“打开”或“关闭”状态下的传感器影响晶体管栅极周围的局部离子环境，该环境可通过晶体管特征定量。例如，晶体管可以被偏置，使得传感器处于“打开”或“关闭”状态直接导致晶体管被“开启”或“关闭”。

先前已经描述了由低维材料构建的生物感测FET：碳纳米管(Allen等,“CarbonNanotube Field-Effect-Transistor-Based Biosensors”Advanced Materials 19(2007)1439-1451)；硅纳米线(Chen等,“Silicon nanowire field-effect transistor-basedbiosensors for biomedical diagnosis and cellular recording investigation”Nanotoday 6(2011)131-154)；石墨烯(Afsahi等,“Towards Novel Graphene-EnabledDiagnostic Assays with Improved Signal-to-Noise Ratio”MRS Advances 60(2017)3733-3739)；二硫化钼(Sarkar等,“MoS₂ Field-Effect Transistor for Next-Generation Label-Free Biosensors”,ACS Nano 8(2014)3992-4003)和氧化铟(Nakatsuka等,“Aptamer–field-effect transistors overcome Debye lengthlimitations for small-molecule sensing”,Science 6(2018)eaao6750)。

在图6C中，双稳态分子传感器固定在平面电极的顶部，该平面电极由具有适当导电性的材料(例如金属(例如金或铂)、石墨烯、氧化铟锡或氧化铟)组成。在此，双稳态分子传感器的盖子携带氧化还原活性分子，其与电极的邻近，在“打开”或“关闭”状态下导致可作为金属电极内的电流检测到的电子转移。双稳态传感器致动的电化学检测使用数种广为人知的方法之一进行，包括但不限于：方波伏安法、循环伏安法、电化学阻抗谱或计时电流法。

在一个实施方案中，在金电极上进行电化学检测，其中金表面已经通过电子束沉积或从超平模板(例如云母或硅片)上的模板剥离来制备，双稳态传感器的顶盖上的氧化还原活性分子是亚甲蓝报告分子，双稳态传感器的底盖通过硫醇修饰、对多核苷酸骨架的硫代磷酸酯修饰或聚腺苷延伸固定在金表面上，并且金电极被自组装的单层巯基己醇(或类似的烷硫醇)覆盖，这防止不期望的电化学反应掩盖亚甲基蓝分子的期望信号。在此种实施方案中，双稳态传感器的关闭导致从亚甲蓝到表面的电子转移速率增加，为系统产生“信号开启”行为。在一些实施方案中，电子转移速率的变化通过方波伏安法测量。

金电极、亚甲蓝氧化还原报告分子和烷硫醇钝化层的组合(通过方波伏安法读出)在文献中很常见，如先前所述(Ricci等,“Linear,redox modified DNA probes aselectrochemical DNA sensors”Chemical Communications 36(2007):3768-3770)。

图7示出了三种不同的装置结构，其可用于光学读出双稳态分子传感器的表面上的实施方案。

在图7A中，双稳态分子传感器固定在透明光学基底(玻璃、石英、二氧化硅)上，并且全内反射照明(TIRF照明，其中临界角以下的光被限制在基底内传播)用于在表面生成瞬逝场。在此类实施方案中，光学报告分子(例如发光体(例如有机荧光团或量子点)或光散射体(例如25-50纳米等离子体颗粒，或500nm至1微米介电颗粒))附接到顶盖。在打开状态下，光学报告分子离表面足够远，使得观察到小的荧光或散射信号。在一些实施方案中，等离子体纳米颗粒是金或银纳米颗粒。在一些实施方案中，介电颗粒是二氧化硅或聚苯乙烯纳米球。在关闭状态下，光学报告分子处于瞬逝场的强部分，使得观察到大的荧光或散射信号。瞬逝场的距离相关衰减与由发射体产生或由颗粒散射的光的波长λ相关，强信号的临界距离通常为λ/10。先前已经描述了使用单个折纸进行TIRF光学测量(Gietl等“DNA origamias biocompatible surface to match single-molecule and ensemble experiments”Nucleic Acids Res.40(2012):e110和Tsukanov等,“Detailed study of DNA hairpindynamics using single-molecule fluorescence assisted by DNA origami”,Phys.Chem.B 117(2013):11932–11942)。

在图7C中，双稳态传感器固定在基底(金或石墨烯)上，其强烈淬灭发光体的荧光，如关于金(Dulkeith等,"Gold Nanoparticles Quench Fluorescence by Phase InducedRadiative Rate Suppression"Nano Letters 5(2005):585–589)和石墨烯(Kasry等,"Highly Efficient Fluorescence Quenching with Graphene"J.Phys.Chem.C 116(2012):2858–2862)所述的。因此，在打开状态下，来自双稳态传感器顶盖的光信号大，并且在关闭状态下，来自双稳态传感器顶盖的光信号小得多。在此类实施方案中，当发射体在表面的几纳米内时观察到最强的猝灭效应，并且因此此类实施方案可以使用双稳态装置几何形状，其中顶盖上的信号分子被刚性地设置并且与表面紧密接触(小于几纳米)。在图7C中图示了一种此种潜在几何形状，特别是具有伸出底盖区域之外的刚性臂的顶盖。

在图7D中，使用广为人知的DNA折纸放置技术，将双稳态传感器固定在微制造的环形谐振器上(如Sarkaleh等,"Optical Ring Resonators:A Platform for BiologicalSensing Applications"J.Med.Signals.Sens.7(2017):185–191中所述)，其中微制造的环形谐振器与光波导强烈地偶联。在此类实施方案中，发光体或光散射体都是双稳态传感器状态变化的相容光学报告分子。输入到波导一端的激发光进入环形谐振器，并且可能作为荧光发射或通过双稳态装置盖子上的报告分子散射，或可能不这样。如果双稳态装置打开，则在环中循环的光简单地返回到波导，并且在输出端作为传输信号被观察到。另一方面，如果双稳态装置关闭，则在环形谐振器中循环的光转换为更长波长的发射光(在报告分子是发光体的情况下)或散射开(在报告分子是光散射体的情况下)。因此，当装置关闭时，从环返回到波导的光量减少，并且在波导输出处测量到信号传输减少。对于此类实施方案，在关闭状态下的盖子的位置可以离环形谐振器的表面多达50纳米。

对于实施方案，例如图7A中图示的那些实施方案，测量的光学信号在双稳态传感器关闭时增加，产生所谓的“信号开启”检测模式(图7B)。对于实施方案，例如图7C和7D中图示的那些实施方案，测量的光学信号在双稳态传感器关闭时减小，产生所谓的“信号关闭”检测(图7E)。

在光学表面读出的另一些实施方案中，使用广为人知的DNA折纸放置技术，将双稳态传感器固定在其他类型的微制造的光学装置上。在一些实施方案中，具有发光体的双稳态传感器设置在金属(例如金)光学领结天线的中心。已知此类蝴蝶结天线中心的强电场来增强发光体的荧光(如Kinkhabwala等"Large single-molecule fluorescenceenhancements produced by a bowtie nanoantenna",Nature Photonics 3(2009):654-657中所述)。因此，在此类实施方案中，双稳态传感器的关闭状态表现出增强的光发射，产生具有“信号开启”行为的系统。对于此类实施方案，为了最大光信号，在关闭状态下的盖子的位置必须在领结中心的几纳米内。

在光学表面读出的另一些实施方案中，使用广为人知的DNA折纸放置技术将双稳态传感器固定在光子晶体腔(PCC)内。如前所述已经说明的(Gopinath等,"Engineeringand mapping nanocavity emission via precision placement of DNA origami",Nature 535(2016):401-405)，DNA折纸上与PCC的相互作用发射体强烈依赖于相对于PCC谐振模式内的节点的纳米级设置。在一些位置，如可以通过有限差分时结构域(FDTD)分析准确预测的，发射体与腔之间的偶联可以很弱，并且在另一些位置它可以很强。对于在PCC光学谐振模式内适当放置在峰值处的双稳态装置，当双稳态装置关闭时，光学信号增强，产生具有“信号开启”行为的系统。

对于基于表面的光学检测的一些实施方案，双稳态传感器的读出通过在落射荧光显微镜中测量偏振来实现。对于此类实施方案，各向异性金棒用作折纸的顶盖上的光学报告分子。因此，当双稳态传感器关闭并且顶盖被结合时，金棒从自由旋转状态转换到固定在特定取向上。用落射荧光显微镜通过检查从棒散射的具有两种不同偏振的光并计算它们之间的比率，容易检测到金棒旋转扩散的该变化。比率接近1表示双稳态传感器处于打开状态，并且比率远离1表示双稳态传感器处于关闭状态。使用线性偏振的实施方案包括折纸的顶盖上的单个各向异性纳米棒。使用环形偏振的实施方案包括一对纳米棒，其中一个在折纸的顶盖上，一个在折纸的底盖上。已经描述了使用环形偏振的双纳米棒系统(Zhou等“Aplasmonic nanorod that walks on DNA origami”Nature Communications 6(2015):8102)。

在一些实施方案中，检测机制可以是潜在的无标记光学技术，例如表面等离子体共振(SPR)或反射干涉测量法(RI)。SPR的一般原理先前已在Tiang等,“Surface PlasmonResonance:An Introduction to a Surface Spectroscopy Technique”Journal ofChemicalfiled Education 87(2010)742–746中被描述，其全部内容通过引用并入本文。RI背后的一般原理先前已在Kussrow等,“Interferometric Methods for Label-FreeMolecular Interaction Studies”Analytical Chemistry 84(2012):779–792中被描述，其全部内容通过引用并入本文。

对于检测方法是SPR或RI的一些实施方案，双稳态检测器的顶盖是未标记的，并且它是检测器顶盖的物质的移动，从在打开状态下自由扩散，到在关闭状态下的表面结合，这导致表面附近的折射率发生变化。在此，通过双稳态检测器实现的每个结合事件的放大取决于要测量的分析物相对于多核苷酸盖子的分子量。对于分子量500的小分子分析物相对于5兆道尔顿盖子，放大系数高达10,000。对于50kD的蛋白质分析物或150kD的抗体，每个结合事件的放大系数范围为30至100倍。

在检测方法是SPR或RI的另一些实施方案中，光学活性颗粒(例如金颗粒或二氧化硅颗粒)可以附接到折纸的顶盖。在此类实施方案中，与完全由DNA构建的顶盖可以达到的相比，光学活性颗粒提供更大的折射率变化和更大的放大。

本发明的实施方案提供优于先前双稳态分子检测器的优点。目前公开的结构的一个优点是，如本文所公开的，该结构包括赋予基于表面的光学和电子检测方法增加的灵敏度的明确定义的形状。当致动检测方法是凝胶电泳并且在打开与关闭状态之间观察到大的凝胶位移时，完全柔性的双稳态检测器工作良好。然而，完全柔性的双稳态检测器不适用于本文所述的光学或电子检测方法，其中控制多核苷酸形状的几何形状的能力能够实现高信号放大，通常每个结合事件放大200倍。

对于电子检测方法，重要的是在致动时从溶液移动到表面的栓系形状具有使足够部分的形状质量(例如，高达5兆道尔顿)靠近表面(在无标记场效应生物感测)或使足够数量(例如，多达至少200个亚甲基蓝标记)的电活性分子(在电化学感测中)在仅几纳米的表面内的几何形状。目前公开的双稳态检测器不能将足够质量或足够数量的电活性分子限制在2nm表面层中。到达2nm表面层的能力通过多核苷酸形状的刚性和它们呈现特定几何形状的能力(这样以与如图8B中的固定形状中形成的窗、如图8C中的臂、或如图8D中的圆顶(其可以延伸超出固定形状的区域)对齐)来实现。这在用于检测的功能分子组合的高度超过2nm的情况下是必需的，例如，两个12纳米抗体加上蛋白质抗原(例如，直径为1至6纳米)的组合产生高度为24至30纳米的堆叠。

类似地，对于光学检测方法(例如TIRF、SPR或RI)，使用完全柔性的双稳态检测器不使技术临界距离内的荧光团数量或材料量最大化，以实现高的信号放大。对于依赖于荧光团或其他发射体(例如TIRF)的技术，本文所述的双稳态检测器可以将至少200个发射体标签带到距表面的临界距离中，其中完全柔性的检测器带来至多几个发射体。对于依赖于将大量未标记分子带到表面以产生折射率变化(SPR或反射干涉测量法)的光学技术，本文所述的双稳态检测器可以将至少5兆道尔顿带到表面，其中完全柔性的检测器可以将至多几百千道尔顿带到表面(例如抗体的分子量为150千道尔顿)。

双稳态传感器的基于表面的读出的实施方案可以产生模拟或数字信号。在一些实施方案中，在包括大量生物传感器的更大区域上进行光学或电子测量，并且因此此类测量提供大量传感器的信号的总和。在此类实施方案中，单个生物传感器行为被平均，并且读出实际上是模拟的。

然而，在一些实施方案中，双稳态传感器的离散性质和潜在地由大多核苷酸盖子和大量信号传导分子提供的信号放大使得能够测量离散的单分子事件。在一些实施方案中，此类单分子测量还通过使用DNA折纸放置将单个双稳态传感器设置到网格中的能力来实现。在此类实施方案中，读出实际上是数字的，如图7B、图7E和图10中的时间/信号迹线所描绘的。一些光学实施方案使得能够同时数字测量数千个双稳态传感器，例如在TIRF显微术的上下文中在整个显微镜场上，如单分子生物物理学中常用的。一些电子实施方案可以实现数字的单分子电子测量，例如在使用DNA折纸放置来将双稳态传感器设置在两个电极之间以利用单分子氧化还原循环的情况下(如Lemay,"Single-MoleculeElectrochemistry:Present Status and Outlook"Acc.Chem.Res.46(2013):369-377中所述)。

实现双稳态传感器的单分子数字测量的实施方案能够观察到双稳态传感器状态的变动，如早期在图7B、图7E和图10中的时间/信号迹线中所描绘的。在打开状态下的双稳态传感器在顶盖远离表面的情况与顶盖靠近表面的情况之间变动。根据接头的长度和顶盖的扩散常数，该变动具有特征时间常数T₁，它决定了信号迹线在“开启”与“关闭”状态之间的转换。在检测分子事件时，无论它是结合事件还是其他事件(例如修饰)，双稳态传感器的顶盖和底盖至少对彼此具有更大的亲和力，从而使双稳态传感器的变动具有不同的特征时间常数T₂，其中T₂大于T₁。

T₂和T₁之间的差异越大，分子事件可以越容易被检测到。在分子事件导致顶盖的脱离率可忽略不计(因为其对底盖的亲和力极高)的极限下，关闭状态是稳定且不可逆的。在该极限中，结合事件或其他分子导致单个分子测量的时间/信号迹线的持续变化，如稍后在图7B、图7E和图10中描绘的。为了清楚起见，对双稳态传感器的强结合和不可逆变化的该极限进行了图示，但是适用于许多实施方案。在许多实施方案中，传感器内靶分子的结合或功能分子的修饰不导致不可逆的变化，时间/信号迹线改变其变动率，并且分子事件的检测不得不从该率变化来推断。

双稳态传感器的不同实施方案采用具有不同形状的盖子(图8A-8D)，如由使特定基于表面的读出机制的性能最大化的要求以及所使用的功能分子(例如抗体、适体)的特征决定的。在许多可能的几何形状中，图8A中图示了四种：简单形式，其中底盖和顶盖的形状相同；(图8B)一种形式，其中底盖具有窗使得顶盖上的信号传导分子可以与表面接触，从而在形成稳定的“关闭”状态时确保最大信号；先前描述了具有此种窗的折纸(Rothemund,Paul WK."Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns",Nature440.7082(2006):297and patent application 161284/CIT-7845)；(图8C)一种形式，其中顶盖被设计成不对称的，具有确保顶盖及其携带的任何信号分子与基底紧密且稳定接触的刚性臂；(图8D)一种形式，其中顶盖被设计成3D半球或圆顶，其边缘的半径延伸超出底盖的半径，这既确保了顶盖和信号分子与表面的紧密接触，又进一步允许双稳态传感器容纳大尺寸的结合分子(例如具有大抗原的两个抗体对)。先前已经描述了具有此种半球或圆顶形状的DNA(Han等,“DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space”,Science 332(2011):342-346)。

作为双稳态装置几何形状的函数的性能取决于特定实施方案。图8A中图示的几何形状适用于利用TIRF显微术(图7A)的实施方案，对于这些实施方案，发光或散射信号分子不需要非常靠近表面以产生大信号。在此类实施方案中，对于λ/10的顶盖到表面距离可以观察到强信号，其中λ是使用的光的波长。因此，对于λ等于532nm的绿光，在表面的50nm内得到强信号，其中顶盖在瞬逝场的强部分内。对于λ/10的顶盖到表面距离，双稳态装置顶盖上的发光体与微制造光学腔(图7D)的偶联也很强。因此，使用微制造腔来通过散射或荧光增强光学检测的实施方案可以使用图8A中图示的简单几何图形实现高性能。

通常在表面的2纳米内观察到金属上的最大淬灭(图7C)、对栅极电容的最大干扰(图6A和图6B)以及电化学环境中的最大电子转移速率(图6C)。因此，使用基于猝灭的光学感测的实施方案(图7C)、以及使用场效应感测的实施方案(图6A和图6B)、以及使用电化学感测的实施方案(图6C)都可以受益于能够使顶盖及其可以携带的信号分子与表面更紧密接触的装置几何形状，例如图8B、图8C和图8D中图示的双稳态装置几何形状。

表面上捕蝇器的性能受制于溶液中不存在的许多潜在问题，在不同的实施方案中，这些问题通过调整基底的表面化学和双稳态传感器的不同组分来解决，如图9所示。

例如，捕蝇器的一个盖子必须固定在表面上(底盖)，并且另一个(顶盖)必须在溶液中自由漂浮。如果顶盖对表面的亲和力太高，则它粘在底盖旁边，并且可能出现捕蝇器结合并且检测到靶分子(假阳性)。此类问题出现在未图案化的表面，以及用DNA折纸结合位点图案化的表面(图9A)上。空位点、双结合和陷在关闭的传感器是可能由于双稳态传感器与表面的不当粘附而导致的所有问题。

控制折纸对表面的粘附的能力在氮化硅和二氧化硅基底上得到最好的发展(如Kershner等,"Placement and orientation of individual DNA shapes onlithographically patterned surfaces",Nature Nanotechnology 4(2009):557–561；Hung等,"Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed bylithographically confined DNA origami",Nature Nanotechnology 5(2010):121-126；Gopinath等,"Optimized Assembly and Covalent Coupling of Single-Molecule DNAOrigami Nanoarrays",ACS Nano 8(2014):12030–12040；和Gopinath等,"Engineeringand mapping nanocavity emission via precision placement of DNA origami",Nature 535(2016):401-405)，所有这些的全部内容并入本文。图9C图示了用于适当结合具有适当表面氧化物(例如二氧化硅、石英和氮化硅)的捕蝇器基底的一个实施方案。在侧视图中，捕蝇器有五个不同的区域，它们必须对表面具有适当的粘性或非粘性用以使捕蝇器正确取向：顶盖的两个表面不得粘附带负电荷的硅烷醇/羧基硅烷结合位点或周围的三甲基甲硅烷基背景(通过六甲基二硅氮烷[HMDS]气相沉积产生)，盖子之间的接头不得粘着到结合位点或背景，底盖的一个表面不得粘着，并且底部的一个表面盖子必须粘着到结合位点。在常用的实验条件(具有10mM Mg²⁺离子)下，平的圆盘形状的折纸强烈地粘着到结合位点，因为一层Mg²⁺离子在带负电荷的表面位点与带负电荷的折纸表面之间提供了桥梁。在另一方面，线性双链DNA(例如接头的一些实施方案)没有，如通过它们在原子力显微术下的移动通过实验所示的。其他工作(如专利申请161284/CIT-7845中所述)教导了如何通过添加一层20聚体聚T单链DNA毛发(single-stranded DNA hair)使DNA折纸的一侧对带负电荷的结合位点不具有粘性。该修饰对二氧化硅高度有效：当沉积具有一个平侧面和一个毛侧面的折纸时，超过98％的折纸与面向表面的平侧面结合。因此，在一些实施方案中，捕蝇器盘的三个面可以用DNA毛发功能化以提供适当的取向。

对于使用DNA折纸放置的一些实施方案，使用特定的表面处理和特定的溶液条件来将捕蝇器的底盖粘附到表面，如同上Gopinath等ACS Nano 8supra vida,and Gopinathet al Nature 535所教导的。对于石英、具有天然或热氧化物覆盖层的二氧化硅、氮化硅、氧化铟或任何可以通过氧等离子体处理将带负电荷的基团引入表面的表面，可以使用带正电荷的二价镁离子来在带负电的表面基团与捕蝇器检测器的带负电荷的底盖之间形成粘合桥。在负表面基团是离子化的硅烷醇的实施方案中，可以使用30至40毫摩尔镁的镁浓度。在一些实施方案中，通过引入带负电荷的羧酸的羧基硅烷处理使表面硅烷化。同样，可以使用镁离子来在带负电荷的表面基团与捕蝇器检测器带负电荷的底盖之间形成粘合桥。在负表面基团是羧酸的此类实施方案中，可以使用小于5毫摩尔的镁浓度。

在一些实施方案中，在不同的基底材料上，可能需要防止顶盖粘着到背景的问题的其他解决方案。底盖通过接头约束顶盖与表面永久相邻。这给予顶盖较高的局部浓度，这改变弱相互作用的平衡和/或可以使替代的结合机制有足够的时间发生。对于其中捕蝇器的顶盖粘着到表面的一些实施方案，可以通过改变其形状和减小其表面积(例如通过使它们实施为6-螺旋束，如图9B中的)来使顶盖的粘性降低。该方法对云母有明显的影响，其中6-螺旋束和其他3D折纸比具有更高表面积的平折纸更不易粘附到表面。对于其中使用电子感测的一些实施方案，该解决方案可能以降低灵敏度为代价，因为它减少折纸的质量和/或靠近传感器表面的信号传导分子的数量。

对于采用金电极的一些实施方案(图9D)，有可能密切模拟二氧化硅系统，其中可以通过Mg²⁺浓度调节粘附力。RMS粗糙度为3.6埃(与二氧化硅晶片相当)的超平模板剥离金可用作基底。为了产生类似于二氧化硅上可用的带负电荷的结合位点，使用羧化硫醇(例如11-巯基十一烷酸)来产生自组装单层。此类单层先前已用于在Mg²⁺离子的存在下将折纸粘附到金上，如前所述(Gerdon等,"Controlled Delivery of DNA Origami on PatternedSurfaces",Small 5(2009):1942-1946)。非粘附的背景可以使用选择的烷硫醇来实施，以得到具有类似于通过HMDS在二氧化硅上生成的接触角的自组装单层。

采用金电极的另一些实施方案在DNA折纸上使用聚腺苷(polyA)链延伸、硫醇标记或硫代磷酸酯骨架以提供捕蝇器底盖与金的粘附。先前已经描述了基于硫醇、硫代磷酸酯和聚腺苷链的DNA粘附(Zhou等,“Tandem phosphorothioate modifications for DNAadsorption strength and polarity control on gold nanoparticles.”ACS AppliedMaterials Interfaces 6(2014):14795-147800)。顶盖与背景表面之间的抗粘附可以通过使用对顶盖的聚乙二醇或葡聚糖修饰、以及对金基底上的背景的聚乙二醇-硫醇修饰来提供。

对于采用石墨烯FET表面的一些实施方案，可以模拟二氧化硅系统以通过使用与石墨烯强烈结合的芘-羧酸分子来提供Mg²⁺驱动的粘附(图9E)。对于一些此类实施方案，经羧酸修饰的石墨烯可以非特异性地结合DNA折纸，并且可以向非粘附的捕蝇器表面添加PEG。

然而，因为双链DNA不强烈粘着到石墨烯表面，并且单链DNA的暴露的疏水碱基确实强烈粘着到石墨烯上，故开放其他用于管理在石墨烯上的粘附的选择。因此，在一些实施方案中，可以使用未图案化的未经修饰的石墨烯。在此类实施方案中，可以将单链DNA(例如聚胸腺嘧啶[polyT])添加到底盖上的粘附捕蝇器表面(图9F)；在此类实施方案中，捕蝇器的其他表面对未经修饰的石墨烯的粘附力非常低。类似的单链接头策略已用于将碳纳米管附接到DNA折纸上(Maune等,"Self-assembly of carbon nanotubes into two-dimensional geometries using DNA origami templates"Nature Nanotechnology(2010)61-66)以形成场效应晶体管。

对于基于表面的实施方案，不同双稳态传感器的多路可以通过独立合成对不同靶分子具有特异性或对单个测试管中的不同功能具有灵敏度的传感器并将不同传感器空间定位成阵列到适用于光学或电学检测的表面上来实现。空间定位可以使用各种技术在微尺度上实现，包括喷墨打印和微阵列打印(如Barbulovic-Nad等"Bio-microarrayfabrication techniques--a review."Critical Reviews in Biotechnology.26(2006):237-59中所述)。因此，对于基于表面的实施方案，微尺度点样产生适用于总和双稳态装置行为的模拟测量的阵列，其中每个斑点包含多个随机排列的双稳态装置；在一些实施方案中，每个斑点包含至少10个双稳态装置。

对于基于表面的实施方案，适用于单分子光学或电子检测的单分子阵列可以使用DNA折纸放置技术光刻构建，如以上参考文献中所述。65,536个光学装置的构建(Gopinath等,"Engineering and mapping nanocavity emission via precision placement ofDNA origami",Nature 535(2016):401-405)，其中每个装置是5微米x5微米的区域，包含光子水晶腔，并且其中每个装置具有设置在其中的确定编号的单个DNA折纸，其中以编程方式从0到7排列的编号是特别相关的。因此，在一些实施方案中(图10)，微尺度点样可以与DNA折纸放置组合，以实现完美规则的单分子单双稳态传感器阵列，其中N阵列中的每一个对特定分析物具有特异性，并且在N阵列中的每一个内，有M个用于单个双稳态装置的结合位点，这些装置恰好填充了一个双稳态传感器，其中概率大于95％。基于已产生的单个结合位点的数量，一些实施方案具有包含斑点总数N乘以M(等于多达100,000)的阵列。一些实施方案具有多达1000个阵列，每个阵列具有至少10个用于双稳态装置的结合位点。

已经为超过4000个CMOS电化学传感器实现多路电学检测(如Sun等"A scalablehigh-density electrochemical biosensor array for parallelized point-of-carediagnostics",2015IEEE Biomedical Circuits and Systems Conference,IEEE Journalof Solid-State Circuits 53(2018)2054-2064中所述)。因此，一些实施方案将微阵列点样与电子装置组合以实现多达4000个不同类型的双稳态装置的多路阵列，其中每个斑点印刷在微型电子装置上，每个斑点包含多个随机排列的双稳态传感器，并且从每个微型电子装置的读出是多个双稳态传感器的总和反应；在一些实施方案中，每个斑点包含至少10个双稳态装置。