阅读说明：本技术 一种具有双荧光发射的小分子荧光探针的应用 (Application of small-molecule fluorescent probe with double fluorescence emission ) 是由 罗亮 孟凡玲 何珍艳 高玉婷 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于分子检测技术领域,更具体地,涉及一种具有双荧光发射的小分子荧光探针的应用。该小分子荧光探针与双链DNA相互作用时,在350-550nm的激发波长激发条件下,出现双荧光发射,其最强荧光发射峰分别为640±5nm和540±5nm。该荧光探针分子由于其独特的分子结构,使得其与双链DNA相互作用时表现出独有的双荧光发射现象,利用这一现象将其应用于制备双链DNA的特异性识别试剂,由此解决现有技术检测dsDNA过程繁琐复杂的技术问题。该荧光探针具有如式(一)所示的结构：<Image he="609" wi="700" file="DDA0002226744840000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>其中,R为：<Image he="221" wi="251" file="DDA0002226744840000012.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>或者<Image he="266" wi="347" file="DDA0002226744840000013.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>n为1-12的整数。(The invention belongs to the technical field of molecular detection, and particularly relates to application of a small molecular fluorescent probe with double fluorescent emission. When the small molecular fluorescent probe interacts with double-stranded DNA, double fluorescence emission occurs under the excitation condition of excitation wavelength of 350-550nm, and the strongest fluorescence emission peaks are 640 +/-5 nm and 540 +/-5 nm respectively. Due to the unique molecular structure of the fluorescent probe molecule, the fluorescent probe molecule shows unique double-fluorescence emission phenomenon when interacting with double-stranded DNA, and is applied to the preparation of a specific recognition reagent of the double-stranded DNA by utilizing the phenomenon, so that the technical problem that the dsDNA detection process in the prior art is complicated is solved. The fluorescent probe has a structure as shown in formula (I): wherein R is: or n is an integer of 1 to 12.)

一种具有双荧光发射的小分子荧光探针的应用

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，更具体地，涉及一种具有双荧光发射的小分子荧光探针的应用。具体涉及一种具有聚集诱导发光(AIE)性能的三苯胺多吡啶盐荧光探针，由于其独有的双荧光发射现象，使得该荧光探针适用于特异性识别双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)，在此前提下还具有检测单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphisms，SNP)及dsDNA损伤的应用。

背景技术

DNA链是由两条序列互补配对的核苷酸构建的双螺旋结构，可携带生物所有遗传信息。近年来，由于其在遗传性疾病，临床诊断和分子生物学中的重要性，对DNA进行了大量研究分析。SNP是基因组中单个核苷酸变异诱导的核酸序列多态性，是生物体中最常见的序列变异形式。SNP的准确检测有助于将区分生物个体的基因组，并为疾病的特定遗传易感性提供临床诊断。

当前大多数SNP诊断方法基于DNA单碱基对突变杂交传感器，其由检测方法和信号转导器构成。用于特异性识别DNA的检测方法通常利用单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)和互补分子探针形成碱基对。为了检测DNA，荧光或电活性标签通常与探针或分析物偶联作为信号转导器以报告杂交情况，其中分子信标是最流行的实例。然而，通过这种杂交检测不仅需要对ssDNA进行复杂的修饰和聚合酶链反应(PCR)扩增，而且还需要变性和分析物杂交，过程繁琐复杂。

最近，阳离子聚噻吩衍生物可快速检测SNP，且不需探针或分析物的任何化学反应。然而，这些阳离子聚噻吩衍生物的精确表征是一个难题，并且需要优化检测灵敏度。此外，杂交是检测所必需的，因为在添加互补DNA链之前必须首先将单链DNA探针与聚噻吩混合。

商业DNA嵌入染料(溴化乙锭，碘化丙锭等)或沟槽结合染料(Hoechst33258等)，比较它们与ssDNA和dsDNA的结合时，光谱位置或振幅几乎没有差异。因此，一种便捷地检测方法是十分必要的，直接检测dsDNA可以使得DNA诊断更快速，灵敏和便捷。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种具有双荧光发射的荧光探针的应用，该荧光探针分子由于其独特的分子结构，使得其与双链DNA相互作用时表现出独有的双荧光发射现象，利用这一现象将其应用于制备双链DNA的特异性识别检测试剂，由此解决现有技术检测dsDNA过程繁琐复杂的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种具有双荧光发射的荧光探针在制备特异性识别双链DNA的检测试剂中的应用，该荧光探针具有如式(一)所示的结构：

其中，R为：

或者n为1-12的整数；

该荧光探针与双链DNA相互作用时，在350-550nm的激发波长激发条件下，出现双荧光发射，其最强荧光发射峰分别为640±5nm和540±5nm。

优选地，将该荧光探针分子溶解于水中，制备得到用于特异性识别双链DNA的检测试剂。

优选地，所述检测试剂中荧光探针的浓度不低于1μM。

按照本发明的另一个方面，提供了一种具有双荧光发射的荧光探针在制备检测单核苷酸碱基突变的双链DNA的检测试剂中的应用，该荧光探针具有如式(一)所示的结构：

其中，R为：

或者

n为1-12的整数；

该荧光探针与双链DNA相互作用时，在350-550nm的激发波长激发条件下，出现双荧光发射，其最强荧光发射峰分别为640±5nm和540±5nm；

该荧光探针与发生错配的双链DNA作用时，所述发生错配的双链DNA即为单核苷酸突变dsDNA，与完全配对的双链DNA相比，随着该错配的双链DNA浓度的增加，其在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度的增加速率有所减弱；且减弱的程度越大，说明该双链DNA相对于完全配对的双链DNA的错配程度越大。

优选地，将该荧光探针分子溶解于水中，制备得到用于检测单核苷酸碱基突变的双链DNA的检测试剂。

优选地，所述检测试剂中荧光探针的浓度不低于1μM。

按照本发明的另一个方面，提供了一种具有双荧光发射的荧光探针在制备检测受损的双链DNA的检测试剂中的应用，该荧光探针具有如式(一)所示的结构：

其中，R为：

或者

n为1-12的整数；

该荧光探针与双链DNA相互作用时，在350-550nm的激发波长激发条件下，出现双荧光发射，其最强荧光发射峰分别为640±5nm和540±5nm；

该荧光探针与受损的双链DNA作用时，与未受损的双链DNA相比，随着双链DNA浓度的增加，其在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度的增加速率有所减弱，该减弱的程度越大，说明该双链DNA相对于未受损的双链DNA的受损程度越大。

优选地，将该荧光探针分子溶解于水中，制备得到用于检测受损的双链DNA的检测试剂。

优选地，所述检测试剂中荧光探针的浓度不低于1μM。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

(1)本发明所述探针不需要对探针ssDNA进行复杂的修饰和PCR扩增，变性和分析物杂交等复杂操作，可以便捷、快速、准确、特异性地检测dsDNA，因此可以用以制备特异性识别双链DNA的检测试剂。

(2)本发明所述探针不仅能特异性地识别dsDNA，还可以检测有单核苷酸基突变的dsDNA。通过探针与单核苷酸突变dsDNA的作用减弱，荧光仪可以灵敏地检测到探针与单核苷酸突变DNA作用后的荧光强度明显下降，可以便捷地判断DNA发生核苷酸突变，可用于制备检测DNA发生核苷酸突变的检测试剂，该方法具有普适性。

(3)本发明所述探针不仅能特异性地识别dsDNA和检测单核苷酸突变DNA，还可以检测dsDNA受损情况，可用于制备检测受损双链DNA的检测试剂。紫外损伤后的dsDNA与所述探针TPBT结合作用减弱，可以通过荧光仪快速检测，且不同的dsDNA损伤程度在540nm处具有不同程度的荧光强度下降。因此该探针可以快速判断dsDNA损伤程度。本发明所述探针检测SNP具有便捷、灵敏、普适性.

附图说明

图1是本发明提供荧光探针TPBT特异性识别dsDNA的示意图。

图2是实施例1中，10μM的荧光探针TPBT的AIE性能。图2(a)是在TPBT在不同体积比的良溶剂(水)和不良溶剂(乙醇)下的荧光光谱图，乙醇的体积比依次为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。图2(b)是TPBT在逐渐加入聚阴离子肝素钠(一种抗凝血剂，Heparin)的荧光光谱图，Heparin的浓度依次为0、10、20、30、40、50μg·mL^-1。图2(c)是TPBT在逐渐加入聚阴离子聚丙烯酸(PAA，Mw＝450000)的荧光光谱图，PAA的浓度依次为0、10、20、40、60μg·mL^-1。图2(d)是TPBT在逐渐加入带负电荷的牛血清蛋白(BSA)的荧光光谱图，BSA的浓度依次为0、50、100、150、200、250μg·mL^-1。激发波长为450nm；其中横坐标为波长，纵坐标为荧光强度值。

图3是实施例2中，10μM的探针TPBT与dsDNA作用的荧光光谱图。图3是TPBT与ctDNA作用的荧光光谱图，ctDNA浓度为0-20μg·mL^-1。***图片是10μMTPBT分别与10μg·mL^-1和20μg·mL^-1ctDNA在紫外灯下照射的荧光照片。

图4是实施例3中探针TPBT与dsDNA特异性产生540nm荧光发射。图4(a)是TPBT与ctDNA在不同环境温度下作用的荧光光谱。环境温度分别为室温，加热至95℃和从95℃冷却至室温。图4(b)是TPBT与ssDNA(50个腺嘌呤构成，A₅₀)作用的荧光光谱，A₅₀浓度为0-1μM。图4(c)是TPBT与1μM A₅₀作用后再逐渐滴加T₅₀(50个胸腺嘌呤构成)的荧光光谱，T₅₀浓度为0-2μM。图4(d)是TPBT与dsDNA(A₅₀与T₅₀混合制得)作用后的荧光光谱。

图5是实施例4中，探针TPBT可检测ctDNA的检测限。图5(a)是探针TPBT与Heparin作用后，达到640nm荧光峰饱和，形成混合体系。在混合体系滴定ctDNA，所得荧光光谱。图5(b)是TPBT与ctDNA荧光滴定的540nm处荧光强度与ctDNA浓度的关系曲线。其中横坐标为ctDNA浓度，纵坐标为540nm处荧光强度。

图6是实施例5中，TPBT检测HIV单核苷酸突变实验。图6(a)是HIV DNA、单核苷酸突变DNA(mis-HIV-A表示碱基T被碱基A取代,mis-HIV-G表示碱基T被碱基G取代,mis-HIV-C表示碱基T被碱基C取代)和完全错配DNA(comp.mis-HIV)的碱基序列。图6(b)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定HIV DNA的荧光光谱，HIV DNA浓度：0-100nM。图6(c)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定mis-HIV-A的荧光光谱，mis-HIV-A浓度：0-100nM。图6(d)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定comp.mis-HIV的荧光光谱，comp.mis-HIV浓度：0-100nM。图6(e)是在TPBT与Heparin混合体系中分别滴加不同浓度的HIV DNA、3种单核苷酸突变DNA和comp.mis-HIV与其对应的540nm处荧光强度关系曲线，其中横坐标为所加DNA浓度，纵坐标为540nm处荧光强度。

图7是实施例6中，TPBT检测tau DNA单核苷酸突变实验。图7(a)是tau DNA、单碱基突变DNA(R406W tau DNA，表示碱基C被碱基A取代)和完全错配DNA(Non-match DNA)的碱基序列。图7(b)是在TPBT与Heparin混合体系滴定tau DNA的荧光光谱，tau DNA浓度：0-96nM。图7(c)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定R406W tau DNA的荧光光谱，R406W tau DNA浓度：0-96nM。图7(d)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定Non-match DNA的荧光光谱，Non-match DNA浓度：0-96nM。图7(e)是在TPBT和肝素钠体系中分别滴加不同浓度的tau DNA、R406W tau DNA和Non-match DNA及其对应的540nm处荧光强度关系曲线，其中横坐标为所加DNA浓度，纵坐标为540nm处荧光强度。

图8是实施例7中，TPBT检测dsDNA紫外损伤及损伤程度实验。图8(a)是TPBT的实验过程示意图，表示同一浓度的ctDNA接受不同时间的紫外光照。图8(b)是TPBT与接受不同时间紫外光照的ctDNA作用的在540nm处荧光强度与ctDNA浓度的关系曲线。图8(c)是接受不同时间紫外光照的ctDNA的圆二色谱图。

图9是实施例8中荧光探针与dsDNA产生540nm和640nm双荧光发射图。

图10是对比例1中的荧光探针与dsDNA产生640nm单荧光发射图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供了一种小分子荧光探针在制备特异性识别双链DNA的检测试剂中的应用，该小分子荧光探针具有如式(一)所示的结构：

其中，R为：

或者n为1-12的整数；优选n为1-6的整数。

该小分子荧光探针与双链DNA相互作用时，在激发波长350-550nm(最大吸收波长为450nm)的激发条件下，出现双荧光发射，其最强荧光发射峰分别为640±5nm和540±5nm。

将该小分子荧光探针溶于水中，制备得到用于特异性识别双链DNA的检测试剂，其中一些实施例中，该检测试剂中荧光探针分子的浓度不高于10μM。

本发明提供的荧光探针及其对应制备得到的检测试剂能够从溶剂、蛋白质、聚阴离子以及双链DNA的集合中识别出双链DNA；所述荧光探针与溶剂、蛋白质或聚阴离子、单链DNA(ssDNA)相互作用，在激发波长350-550nm条件下，仅出现单荧光发射，最强荧光发射峰为640±5nm。

应用于从溶剂、蛋白质、聚阴离子以及双链DNA中识别出双链DNA，一些实施例中，具体包括如下步骤：将含有溶剂、蛋白质、聚阴离子以及双链DNA的溶液样品分别滴加至所述荧光探针的水溶液中，得到所述荧光探针分别与溶剂、蛋白质、聚阴离子以及双链DNA的混合溶液样品。

在350-550nm的激发波长激发条件下，测试各混合溶液样品的荧光光谱图，与所述荧光探针的水溶液的初始荧光光谱进行比较，出现双荧光发射且其最强荧光发射峰分别为640±5nm和540±5nm的混合溶液样品，即为含有双链DNA的溶液样品。

一些实施例中，所述荧光探针的水溶液的初始浓度不低于1μM，将含有溶剂、蛋白质、聚阴离子以及双链DNA的溶液样品分别滴加至所述荧光探针的水溶液中，直至每一份溶液样品达到平衡状态，该平衡状态时各溶液样品在540±5nm范围内的最强荧光发射峰处的荧光强度增加速率随着其浓度的增加不再变化。

本发明所述的荧光探针为一种具有AIE性能的荧光探针，在本发明中将其缩写为TPBT。其在不同体积比的良溶剂和不良溶剂混合体系中，随着不良溶剂含量增加，唯一的640nm荧光发射强度明显增加。

该荧光探针与带负电荷的蛋白质或聚阴离子作用，由于静电作用会形成聚集状态，致使其唯一的640nm荧光发射明显增强。在荧光探针溶液中，逐渐增加ssDNA的含量，也会促使唯一的640nm荧光发射增强。

本发明提供的荧光探针分子，与双链DNA相互作用时，在激发波长450nm条件下，出现双荧光发射，荧光发射峰分别为640±5nm和540±5nm，可能的机理是：由于其较平面的结构与双螺旋结构的双链DNA的大沟槽发生沟槽结合作用，并限制分子转动和振动，使得该荧光探针分子出现了双荧光发射，从而使得该荧光探针分子能够特异性将双链DNA与其他物质，比如溶剂、蛋白质分子、聚阴离子(带负电荷的大分子)区分开来。

本发明的荧光探针与dsDNA作用，会导致双荧光发射，荧光发射峰分别为640nm和540nm。逐渐增加dsDNA的含量，540nm荧光发射明显增强。将荧光探针与dsDNA作用的混合体系加热至95℃，使dsDNA解螺旋，540nm荧光发射消失。再从95℃恢复至室温，540nm荧光发射再次出现。

本发明一些实施例中，通过如下方法验证所述荧光探针TPBT在特异性识别dsDNA中的应用。具体方法，含以下步骤：

(1)dsDNA的制备：将HPLC纯化后的ssDNA用超纯水溶解，将相同量的两条ssDNA混合，稀释，在37℃，225rad/min条件下均匀振荡5-10min备用，现用现配。根据实验内容，两条ssDNA序列包括以下情况：互补配对、单核苷酸突变、完全错配。

(2)TPBT水溶液的制备：将纯化后的TPBT溶于二甲亚砜，配制成10m mol·L^-1母液备用。取1μL TPBT母液加入至999μL超纯水中，配制成1 10μmol·L^-1TPBT水溶液。

(3)用荧光仪测步骤(2)的荧光强度，逐渐滴加dsDNA，测每次滴加dsDNA后的荧光光谱。

一些实施例中，选取小牛胸腺DNA(ctDNA)作dsDNA。换成其他的dsDNA，也具有类似的实验现象。

进一步地，实验发现本发明所述荧光探针能够用于制备检测具有单核苷酸碱基突变的dsDNA的检测试剂，即能够用于制备检测SNP的检测试剂。

具体来说，本发明的荧光探针分子与单核苷酸突变的dsDNA作用时，与未发生单核苷酸基突变的dsDNA相比，该荧光探针在540nm处荧光发射的荧光强度有所减弱。

与完全配对的双链DNA相比，该荧光探针与发生错配的双链DNA(即单核苷酸突变dsDNA，SNP)作用时，随着该错配的双链DNA浓度的增加，其在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度的增加速率有所减弱；且减弱的程度越大，说明该双链DNA相对于完全配对的双链DNA的错配程度越大。

一些实施例中，将该荧光探针分子溶解于水中，制备得到用于检测单核苷酸碱基突变的双链DNA的检测试剂。

一些实施例中，所述检测试剂中荧光探针的浓度不低于1μM。

一些实施例中，将该荧光探针用于制备检测具有单核苷酸基突变的dsDNA(即SNP)的检测试剂，即用于制备检测SNP的检测试剂，然后将该检测试剂用于SNP检测时，具体包括如下步骤：

(1)以若干条双链DNA作为待测样品，且每一条所述双链DNA的两条单链寡核苷酸具有不同程度的错配；

(2)将所述具有不同错配程度的双链DNA待测样品分别滴加至所述荧光探针的水溶液中，得到若干份荧光探针与所述错配的双链DNA的混合溶液样品；将完全配对的该双链DNA也滴加至所述荧光探针水溶液中，得到荧光探针与所述完全配对的双链DNA的混合溶液样品；

(3)以所述完全配对的双链DNA在滴加过程中随着其浓度的增加在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度的增加速率作为参照，测试滴加过程中，随着各混合溶液样品中双链DNA的浓度的增加，其在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度的增加速率；荧光强度增加速率越快，对应该双链DNA错配程度越小；与完全配对的双链DNA相比，该荧光探针与发生错配的双链DNA(单核苷酸突变dsDNA的)作用时，随着双链DNA浓度的增加，其在540nm荧光发射峰的荧光强度的增加速率有所减弱，该减弱的程度越大，说明该双链DNA相对于完全配对的双链DNA的错配程度越大。

一些实施例中，步骤(1)所述具有不同程度错配的双链DNA包括只有一个碱基错配的双链DNA以及碱基完全错配的双链DNA。

一些实施例中，所述混合样品中荧光探针的浓度不低于1μM，所述双链DNA的浓度范围不高于100nM，在该范围内，随着其浓度增加，其在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度线性增加。

一些实施例中，采用本发明的荧光探针对HIV DNA和tau DNA进行SNP检测，其具有普适性。该荧光探针与单核苷酸突变的HIV DNA作用后，540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度明显下降，为无突变dsDNA荧光强度的0.3-0.5倍。荧光探针与单核苷酸突变的tau DNA作用后，540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度明显下降，大约为无突变dsDNA荧光强度的0.5倍。

本发明具体实施例中，选取了具有疾病相关的dsDNA中的单核苷酸突变，如HIVDNA和tau DNA。特地选取了完全错配的两条ssDNA混合，其中一条为与疾病相关核苷酸序列，来验证本发明所述的荧光探针在检测SNP中的应用。

此外，本发明所述荧光探针还可以用于制备检测受损的dsDNA的检测试剂。

具体来说，本发明的荧光探针与受损的dsDNA的作用时，在540nm处荧光发射的荧光强度有所减弱。

与未受损的双链DNA相比，该荧光探针与受损的双链DNA作用时，随着双链DNA浓度的增加，其在540nm荧光发射峰的荧光强度的增加速率有所减弱，该减弱的程度越大，说明该双链DNA相对于未受损的双链DNA的受损程度越大。

一些实施例中，将该荧光探针分子溶解于水中，制备得到用于检测受损的双链DNA的检测试剂。

一些实施例中，所述检测试剂中荧光探针的浓度不低于1μM。

本发明的荧光探针与受损的dsDNA作用时，在540nm处荧光发射的荧光强度，为与未受损DNA作用后荧光强度的0.24-0.69倍。

将所述荧光探针用于制备鉴定dsDNA的损伤和/或检测dsDNA的受损程度的检测试剂，并将该试剂用于损伤的双链DNA的检测时，一些实施例中，具体包括如下步骤：

以不同受损程度的双链DNA作为待测样品，将不同受损程度的双链DNA分别滴加至所述荧光探针溶液中，得到不同受损程度的双链DNA与荧光探针溶液的混合溶液样品。

以未受损的双链DNA在滴加过程中随着其浓度的增加在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度的增加速率作为参照，测试滴加过程中随着各混合溶液样品中双链DNA随着其浓度的增加，其在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度的增加速率，荧光强度增加速率越快，对应该双链DNA受损程度越小。

与未受损的双链DNA相比，该荧光探针与受损的双链DNA作用时，随着双链DNA浓度的增加，其在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度的增加速率有所减弱，该减弱的程度越大，说明该双链DNA相对于未受损的双链DNA的受损程度越大。

一些实施例中，所述混合样品中荧光探针的浓度不低于1μM，所述双链DNA的浓度范围不高于4μg/mL，在该范围内，随着其浓度增加，其在540nm±5nm范围内的最强荧光发射峰的荧光强度线性增加。

本发明所述应用的荧光探针的激发波长为450nm，在荧光仪下直接测得荧光强度，其发射光谱为460nm-800nm。

本发明所述dsDNA的损伤为在紫外光照射、x射线照射或化学污染下造成的损伤。比如在紫外光照射不同时间比如0、30、120min后的损伤。

鉴于本发明所述荧光探针的特点，该荧光探针通过在540nm处荧光发射可以检测具有类双螺旋的DNA结构，如G-四联体和i-motif结构。

图1是本发明提供荧光探针TPBT特异性识别dsDNA的示意图。图中示意本发明所述的式(一)结构的荧光探针，其中R为

n＝1，其平面性较好，可能与双螺旋结构的DNA发生沟槽作用，影响分子振动，导致双荧光现象。

本发明所述的荧光探针分子TPBT其合成方法可参见专利CN108727256A。

本发明公开的一种具有聚集诱导发光(AIE)性能的荧光探针，通过该荧光探针对双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)独特的双荧光发射现象，可以用于制备特异性识别dsDNA及单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)检测的检测试剂等应用，属于分子检测技术领域。本发明提出了一种称为TPBT的带正电荷的小分子探针，TPBT在溶液中发光微弱，但与聚阴离子、蛋白质和单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)作用，640nm附近荧光发射增强。然而，当TPBT与dsDNA沟槽结合时，TPBT在540nm出现新的荧光发射峰，表现出对dsDNA的高度特异性识别。更重要的是，它还可以不经变性，复性或杂交等复杂过程，通过便捷的荧光检测方式检测出SNP及dsDNA损伤。本发明研究了这种特异性识别dsDNA并且可快速检测SNP以及dsDNA损伤的荧光探针，为无标记SNP和dsDNA损伤检测提供了一种灵敏、便捷、快速的方法，具有跟基因突变相关疾病监测应用潜力。

本发明提到的荧光发射峰640nm或540nm，随着混入溶液的种类的变化，其最强荧光发射峰的位置可能有所偏移，一般在640±5nm和540±5nm范围内。

以下为实施例：

实施例1：荧光探针TPBT的AIE性能

1)TPBT在良溶剂和不良溶剂体系中

测探针TPBT(浓度为10μM)在不同体积比的水(良溶剂)和乙醇(不良溶剂)下的荧光发射光谱，乙醇的体积比依次为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。图2是实施例1中，10μM的荧光探针TPBT的AIE性能。如图2(a)所示，随着乙醇的体积比率不断增加时，TPBT的以640nm为中心的红色荧光强度逐渐增加，当乙醇比例达到90％时，发射峰值强度增加了30倍。说明TPBT具有AIE性能，且在640nm有唯一的荧光发射峰。

2)TPBT与聚阴离子肝素钠作用

在浓度为10μM光敏剂TPBT的水溶液中逐渐滴加Heparin，累积的Heparin浓度依次为0、10、20、30、40、50μg·mL^-1。随着Heparin浓度的增加，荧光强度不断增强，如图2(b)所示。进一步证明TPBT具有AIE性能，且仅有640nm荧光发射峰。

3)TPBT与聚丙烯酸作用

在浓度为10μM光敏剂TPBT的水溶液中逐渐加入PAA，(Mw＝450000)，PAA的浓度依次为0、10、20、40、60μg·mL^-1。随着PAA浓度的增加，以640nm为中心的荧光逐渐增强，如图2(c)所示。进一步证明TPBT具有AIE性能，且仅有640nm荧光发射峰。

4)TPBT与牛血清蛋白作用

在浓度为10μmol·L^-1探针TPBT的水溶液中逐渐加入BSA，BSA的浓度依次为0、50、100、150、200、250μg·mL^-1。如图2(d)所示，随着BSA浓度增加，以640nm为中心的荧光逐渐增强，进一步证明TPBT具有AIE性能，且仅有640nm荧光发射峰。

实施例2：探针TPBT与dsDNA作用出现新的540nm荧光发射

在浓度为10μM探针TPBT的水溶液中逐渐滴加ctDNA，ctDNA浓度为0-20μg·mL^-1，激发波长为450nm，测得荧光光谱。如图3所示，在TPBT中滴加0-10μg·mL^-1ctDNA，TPBT的荧光发射峰在640nm附近；再继续滴加ctDNA至11μg·mL^-1，TPBT在540nm处出现全新的荧光发射峰，且640nm荧光发射峰仍然存在；再继续滴加ctDNA至20μg·mL^-1，540nm处的荧光发射峰明显逐渐增强。***的图片分别为TPBT与10μg·mL^-1和20μg·mL^-1ctDNA在紫外光照下的荧光图片，可以说明两种浓度ctDNA的荧光颜色和强度明显不同。

实施例3：探针TPBT与dsDNA作用特异性地出现540nm荧光发射

在浓度为10μM探针TPBT的水溶液中逐渐滴加ctDNA，ctDNA浓度为0-20μg·mL^-1，测得荧光光谱。将上述溶液体系加热至95℃，立即测其荧光光谱。再将其溶液回复至室温，测其荧光光谱。

图4是实施例3中探针TPBT与dsDNA特异性产生540nm荧光发射。如图4(a)所示，在10μM探针TPBT体系中滴定至20μg·mL^-1ctDNA，光谱出现540nm的强荧光发射峰；加热至95℃，双链解开，形成ssDNA，540nm荧光峰消失；恢复至室温，540nm荧光峰恢复。说明dsDNA才会导致TPBT出现540nm和640nm的双荧光发射峰。

如图4(b)所示，在10μM探针TPBT中逐渐滴加50个腺嘌呤组成的单链核苷酸(A₅₀)至1μM，640nm荧光发射峰达到平衡，无540nm荧光发射峰出现；开始滴加50个胸腺嘧啶组成的单链核苷酸(T₅₀)，TPBT开始出现在540nm处的荧光发射峰，而且640nm荧光峰仍存在。滴加T₅₀至2μM，540nm处的荧光强度增加。如图4(c)所示，将等量的A₅₀与T₅₀混合((A+T)₅₀)，用超纯水稀释，在37℃，225rad/min条件下均匀振荡5-10min。在10μM¹探针TPBT中逐渐滴加(A+T)₅₀至3μM，滴定至0.25Μm ctDNA时，TPBT溶液体系出现540nm处的荧光发射峰。如图4(d)所示，ssDNA(3μM A₅₀)、dsDNA((A+T)₅₀)、先加单链DNA与之配对的另一条DNA(A₅₀+T₅₀)的浓度与540nm处荧光强度的曲线关系说明探针TPBT可以与dsDNA具有独特的作用，特异性地出现新的540nm荧光发射峰。

实施例4：探针TPBT对dsDNA作用的检测限

在浓度为10μM探针TPBT的水溶液中滴加200μg·mL^-1Heparin，使其640nm荧光发射强度达到平衡后，形成TPBT与Heparin的混合体系，再逐渐滴加ctDNA至3.52μg·mL^-1。

图5是实施例4中，探针TPBT检测ctDNA的检测限实验测试。图5(a)所示是在TPBT与Heparin的混合体系中滴加ctDNA的荧光光谱。图5(b)是ctDNA的浓度与540nm处荧光强度关系曲线。在ctDNA浓度0-2.4μg·mL^-1内，TPBT在540nm处荧光强度呈线性关系，且该曲线的斜率为0.272(R²＝0.99)，通过3×σ/k公式计算的检测限为1.95μg·L^-1。从图5可以得出TPBT可以通过540nm荧光发射灵敏地检测ctDNA。

实施例5：探针TPBT对HIV DNA的SNP检测

图6是实施例5中，TPBT检测HIV单核苷酸突变实验。如图6(a)所示，HIV DNA、单核苷酸突变DNA和完全错配DNA的碱基序列。dsDNA的配制方法为：将HPLC纯化后的ssDNA用超纯水溶解，配制成0.5mM ss DNA母液，均取相同量的两条ssDNA混合，稀释至0.2μM，在37℃，225rad/min条件下均匀振荡5-10min备用，现用现配。HIV DNA是两条完全互补配对的ssDNA混合制得；单核苷酸突变DNA是在HIV DNA上突变了一个核苷酸(mis-HIV-A表示碱基T被碱基A取代，mis-HIV-G表示碱基T被碱基G取代,mis-HIV-C表示碱基T被碱基C取代)；完全错配DNA是关于HIV DNA的ssDNA与碱基完全错配ssDNA混合制得。探针TPBT与Heparin混合体系配制方法：取1μL TPBT的10mM母液至974μL超纯水中，再加入25μl Heparin水溶液，配成200μg·mL^-1即得TPBT与Heparin混合体系。

图6(b)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定HIV DNA的荧光光谱，检测限为7.2×10^-11M。图6(c)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定mis-HIV-A的荧光光谱，图6(d)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定comp.mis-HIV的荧光光谱。十分明显地，TPBT与Heparin混合体系与三种不同程度突变地DNA作用，在540nm处荧光强度是明显不同的。图6(e)是在TPBT与Heparin混合体系中分别滴加不同浓度的HIV DNA、3种单核苷酸突变DNA和comp.mis-HIV及其对应的540nm处荧光强度关系曲线，其中横坐标为所加DNA浓度，纵坐标为540nm处荧光强度。可以观察到TBPT与HIV DNA作用的540nm荧光强度为单核苷酸突变DNA的1.9-3.1倍，完全错配DNA未出现540nm荧光发射。此结果说明探针TPBT可以通过540nm处荧光强度检测单核苷酸突变的HIV DNA，并对dsDNA具有特异性出现540nm荧光发射的应用。

实施例6：探针TPBT对tau DNA的SNP检测

图7是实施例6，TPBT检测tau DNA单核苷酸突变实验。如图7(a)所示，tau DNA、单核苷酸突变DNA和完全错配DNA的碱基序列。dsDNA的配制方法为：将HPLC纯化后的ssDNA用超纯水溶解，配制成0.5mM ssDNA母液，均取相同量的两条ssDNA混合，稀释至0.2μM，在37℃，225rad/min条件下均匀振荡5-10min备用，现用现配。tau DNA是两条完全互补配对的ssDNA混合制得；单核苷酸突变DNA是在tau DNA上突变了一个碱基(表示碱基C被碱基A取代)；完全错配DNA是关于tau DNA与完全错配ssDNA混合制得(Non-match DNA)。

图7(b)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定tau DNA的荧光光谱，图7(c)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定R406W tau DNA的荧光光谱，图7(d)是在TPBT与Heparin混合体系中滴定Non-match DNA的荧光光谱。十分明显的，TPBT与Heparin混合体系与单核苷酸突变作用，TPBT在540nm处荧光强度明显下降。图7(e)是在TPBT与Heparin混合体系中分别滴加不同浓度的tau DNA、R406W tau DNA和Non-match DNA及其对应的540nm处荧光强度关系曲线，其中横坐标为所加DNA浓度，纵坐标为540nm处荧光强度。可以观察到TBPT与tau DNA作用的540nm荧光强度为R406W tau DNA的1.9倍，Non-match DNA未出现540nm荧光发射。此结果说明探针TPBT可以通过540nm处荧光强度可以很好的检测单核苷酸突变和野生型的tau DNA，也表明TPBT应用于SNP检测具有普适性。

实施例7：探针TPBT检测dsDNA损伤

图8是实施例7中，TPBT检测dsDNA紫外损伤及损伤程度实验。

TPBT检测dsDNA紫外损伤及损伤程度实验如图8(a)实验过程示意图所示，配制200μLctDNA，取150μL装于石英比色皿中，将用封口膜封住的比色皿在紫外灯下光照，同一浓度ctDNA在紫外条件下光照不同时间，分别是30min，120min。另50μL ctDNA用于0min紫外光照的滴定。图8(b)是TPBT与接受不同时间紫外光照的ctDNA作用的540nm处荧光强度曲线，TPBT与紫外光照0min的ctDNA滴定后出现明显的540nm荧光发射峰，随着紫外光照时间增加，540nm荧光强度下降，且比率为1:0.69:0.24，可以得到TPBT可用于判断紫外光照后导致的ctDNA损伤程度。图8(c)是经过不同时间的紫外光照的ctDNA的圆二色谱图，将100μg·mL^-1ctDNA在紫外下光照0min、30min、120min后测其圆二色性信号。276nm处正峰是DNA碱基堆叠的特征峰，结果可见紫外光照下ctDNA的276nm信号峰发生明显下降，表明紫外光照下，ctDNA发生了损伤，且紫外光照时间越长，ctDNA的损失越明显。进一步证实了TPBT是可以灵敏地检测受损的ctDNA。

本发明实施例1至实施例7中采用的TBPT，其分子结构式(一)中R为且n＝1。

实施例8

其他条件同实施例3，不同的是将本发明式(一)结构式中的n换成6，在水体系中不断提高双链DNA的含量，也会在540nm和640nm出现双荧光发射峰。图9是实施例8中，探针与dsDNA产生540nm和640nm双荧光发射。

对比例1

其他条件同实施例3，当将本发明式(一)结构式中的R换成基团或时，加入双链DNA，仅在640nm出现单荧光发射峰，不能在540nm处出现荧光发射峰，可能是由于R基团的平面性，影响了与双链DNA沟槽作用导致的。图10是对比例1中，探针与dsDNA产生640nm单荧光发射。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。