阅读说明：本技术 经由抑制性tRNAs和脱氨酶对突变进行RNA靶向 (RNA targeting of mutations via inhibitory tRNAs and deaminases ) 是由 普拉尚特·马利 德拉瓦·卡特埃卡 于 2018-03-02 设计创作，主要内容包括：本公开的方面涉及一种利用修饰的tRNA的用于由终止密码子中的突变引起的疾病、病症或状况的基因治疗方法。包括肌营养不良症(例如杜兴氏肌营养不良症)、一些癌症、β型地中海贫血、赫尔勒氏综合征和囊性纤维化在内的所有遗传性疾病中的至少10％-15％落入该类别内。不受理论所束缚,认为这种方法比CRISPR方法更安全,这是因为其具有最小的脱靶效应并且缺乏基因组水平变化。(Aspects of the disclosure relate to a method of gene therapy for a disease, disorder, or condition caused by a mutation in a stop codon using a modified tRNA. At least 10% -15% of all genetic diseases including muscular dystrophy (e.g., duchenne muscular dystrophy), some cancers, beta thalassemia, heller's syndrome, and cystic fibrosis fall within this category. Without being bound by theory, this approach is believed to be safer than the CRISPR approach because it has minimal off-target effects and lacks genomic level variation.)

经由抑制性tRNAs和脱氨酶对突变进行RNA靶向

对相关申请的交叉引用

本申请依照美国法典第35篇第119条(e)款要求2017年3月3日提交的美国序列号62/466,961和2017年8月29日提交的美国序列号62/551,732的优先权，这些美国申请的全部内容以引用的方式并入本文。

关于政府支持的声明

本发明是在政府支持下根据国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号R01HG009285作出的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

本公开的方面涉及一种使用修饰的tRNA的用于由终止密码子中的突变引起的疾病、病症或状况的基因治疗方法。包括肌营养不良症(例如杜兴氏肌营养不良症(Duchenemuscular dystrophy))、一些癌症、β型地中海贫血、赫尔勒氏综合征(Hurler syndrome)和囊性纤维化在内的所有遗传性疾病中的至少10％-15％落入该类别内。不受理论所束缚，认为这种方法比CRISPR方法或TALEN方法更安全，这是因为其具有最小的脱靶效应并且缺乏基因组水平变化。

发明内容

本公开的方面涉及一种用于在有需要的受试者中恢复蛋白质表达的方法，所述蛋白质在编码所述蛋白质的RNA序列中包含点突变，所述方法包括以下步骤，或可选地基本上由以下步骤组成，或还进一步由以下步骤组成：向所述受试者施用编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的一种或多种tRNA的载体，任选地其中所述点突变产生提前终止密码子，任选地其中所述点突变产生提前终止密码子。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列TAA和RNA序列UAA的无义突变。在一些实施方案中，所述tRNA是具有识别包含所述点突变的密码子的修饰的反密码子茎的内源性tRNA。在另外的实施方案中，所述tRNA带有丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在另外的实施方案中，所述载体还包含相应的tRNA合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在涉及正交tRNA的一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在另外的实施方案中，通过引入所述受试者的饮食中向所述受试者施用吡咯赖氨酸。在一些实施方案中，所述载体编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的两种tRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在另一个方面，所述受试者是人类并且任选地是儿科患者。

另外的方法方面涉及在有需要的受试者中治疗疾病、病症或状况，其特征在于在编码与所述疾病、病症或状况相关的蛋白质的RNA序列中存在点突变，所述方法包括以下步骤，或可选地基本上由以下步骤组成，或还进一步由以下步骤组成：向所述受试者施用编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的一种或多种tRNA的载体，任选地其中所述点突变产生提前终止密码子。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列TAA和RNA序列UAA的无义突变。在一些实施方案中，所述tRNA是具有识别包含所述点突变的密码子的修饰的反密码子茎的内源性tRNA。在另外的实施方案中，所述tRNA带有丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在另外的实施方案中，所述载体还包含相应的tRNA合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在涉及正交tRNA的一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在另外的实施方案中，将吡咯赖氨酸引入所述受试者的饮食中。在一些实施方案中，所述载体编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的两种tRNA。在一些实施方案中，所述疾病、病症或状况选自由表1中所列的疾病、病症和状况组成的组，任选地特征在于无义突变和/或提前终止密码子的存在。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在另外的实施方案中，所述疾病、病症或状况是肌营养不良症。在又另外的实施方案中，所述疾病、病症或状况是杜兴氏肌营养不良症。在一些实施方案中，所述受试者是人类并且任选地是儿科患者。

本文公开的又另外的方面涉及一种载体，其编码具有识别编码蛋白质的RNA序列中包含点突变的密码子的反密码子序列的一种或多种tRNA，任选地其中所述点突变产生提前终止密码子。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列TAA和RNA序列UAA的无义突变。在一些实施方案中，所述tRNA是具有识别包含所述点突变的密码子的修饰的反密码子茎的内源性tRNA。在另外的实施方案中，所述tRNA带有丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在另外的实施方案中，所述载体还包含相应的tRNA合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在涉及正交tRNA的一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在一些实施方案中，所述载体编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的两种tRNA。在一些实施方案中，所述载体是AAV载体，任选地是AAV8载体。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在另一个方面，所述受试者是人类并且任选地是儿科患者。

在另一个方面，本公开涉及一种用于在有需要的受试者中恢复蛋白质表达的方法，所述蛋白质在编码所述蛋白质的RNA序列中包含点突变，所述方法包括向所述受试者施用编码基于ADAR的RNA编辑系统的一种或多种载体，所述基于ADAR的RNA编辑系统包含一种或多种用于ADAR的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR的RNA编辑系统特异性地编辑所述点突变。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列TAA和RNA序列UAA的无义突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UIA，并且任选地，进一步将UIA转化成UII。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UAI。在一些实施方案中，任选地在涉及无义或错义突变的实施方案中，所靶向的RNA是mRNA。在另外的实施方案中，所述一种或多种载体还编码靶向琥珀型密码子的tRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列CAG和RNA序列CAG的剪接位点或错义突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将CAG转化成CIG。在一些实施方案中，任选地在涉及剪接位点突变的实施方案中，所靶向的RNA是前体mRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是鸟氨酸转氨甲酰酶。在一些实施方案中，所述基于ADAR的编辑系统还包含ADAR1、ADAR2、其各自的E488Q突变体和E100Q突变体、包含ADAR的催化结构域和与RNA发夹基序相关的结构域的融合蛋白、包含ADAR的催化结构域和无活性Cas9的融合蛋白或包含ADAR的双链结合结构域和APOBEC的融合蛋白。在另外的实施方案中，与RNA发夹基序相关的结构域选自MS2噬菌体衣壳蛋白(MCP)和N22肽的组。在一些实施方案中，所述方法还包括施用有效量的干扰素以增强内源性ADAR1表达。在又另外的实施方案中，所述干扰素是干扰素α。在一些实施方案中，所述adRNA包含一个或多个RNA发夹基序。在一些实施方案中，所述一个或多个RNA发夹基序选自MS2茎环和BoxB环的组和/或通过用G-C置换A-U来稳定。在一些实施方案中，所述adRNA经由在所述adRNA的任何一个末端或两个末端处掺入2'-O-甲基、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯或2'-O-甲基3'硫代PACE中的一个或多个来稳定。在另一个方面，所述受试者是人类并且任选地是儿科患者。

另外的方法方面涉及一种在有需要的受试者中治疗疾病、病症或状况的方法，其特征在于在编码与所述疾病、病症或状况相关的蛋白质的RNA序列中存在点突变，所述方法包括以下步骤，或可选地基本上由以下步骤组成，或还进一步由以下步骤组成：向所述受试者施用编码基于ADAR的RNA编辑系统的一种或多种载体，所述基于ADAR的RNA编辑系统包含一种或多种用于ADAR的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR的RNA编辑系统特异性地编辑所述点突变。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列TAA和RNA序列UAA的无义突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UIA，并且任选地，进一步将UIA转化成UII。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UAI。在一些实施方案中，任选地在涉及无义或错义突变的实施方案中，所靶向的RNA是mRNA。在另外的实施方案中，所述一种或多种载体还编码靶向琥珀型密码子的tRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列CAG和RNA序列CAG的剪接位点或错义突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将CAG转化成CIG。在一些实施方案中，任选地在涉及剪接位点突变的实施方案中，所靶向的RNA是前体mRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是鸟氨酸转氨甲酰酶。在一些实施方案中，所述基于ADAR的编辑系统还包含ADAR1、ADAR2、其各自的E488Q突变体和E100Q突变体、包含ADAR的催化结构域和与RNA发夹基序相关的结构域的融合蛋白、包含ADAR的催化结构域和无活性Cas9的融合蛋白或包含ADAR的双链结合结构域和APOBEC的融合蛋白。在另外的实施方案中，与RNA发夹基序相关的结构域选自MS2噬菌体衣壳蛋白(MCP)和N22肽的组。在一些实施方案中，所述方法还包括施用有效量的干扰素以增强内源性ADAR1表达。在又另外的实施方案中，所述干扰素是干扰素α。在一些实施方案中，所述adRNA包含一个或多个RNA发夹基序。在一些实施方案中，所述一个或多个RNA发夹基序选自MS2茎环和BoxB环的组和/或通过用G-C置换A-U来稳定。在一些实施方案中，所述adRNA经由在所述adRNA的任何一个末端或两个末端处掺入2'-O-甲基、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯或2'-O-甲基3'硫代PACE中的一个或多个来稳定。在一些实施方案中，所述疾病、病症或状况选自由表1中所列的疾病、病症和状况组成的组。在另外的实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白并且所述疾病、病症或状况是肌营养不良症。在又另外的实施方案中，所述疾病、病症或状况是杜兴氏肌营养不良症。在一些实施方案中，所述受试者是人类并且任选地是儿科患者。

另外的方面涉及一种重组表达系统，其包含针对受试者编码基于ADAR的RNA编辑系统的一种或多种载体，所述基于ADAR的RNA编辑系统包含一种或多种用于ADAR的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR的RNA编辑系统特异性地编辑编码蛋白质的RNA序列中的点突变。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列TAA和RNA序列UAA的无义突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UIA，并且任选地，进一步将UIA转化成UII。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UAI。在一些实施方案中，任选地在涉及无义或错义突变的实施方案中，所靶向的RNA是mRNA。在另外的实施方案中，所述一种或多种载体还编码靶向琥珀型密码子的tRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列CAG和RNA序列CAG的剪接位点或错义突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将CAG转化成CIG。在一些实施方案中，任选地在涉及剪接位点突变的实施方案中，所靶向的RNA是前体mRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是鸟氨酸转氨甲酰酶。在一些实施方案中，所述基于ADAR的编辑系统还包含ADAR1、ADAR2、其各自的E488Q突变体和E100Q突变体、包含ADAR的催化结构域和与RNA发夹基序相关的结构域的融合蛋白、包含ADAR的催化结构域和无活性Cas9的融合蛋白或包含ADAR的双链结合结构域和APOBEC的融合蛋白。在另外的实施方案中，与RNA发夹基序相关的结构域选自MS2噬菌体衣壳蛋白(MCP)和N22肽的组。在一些实施方案中，所述adRNA包含一个或多个RNA发夹基序。在一些实施方案中，所述一个或多个RNA发夹基序选自MS2茎环和BoxB环的组和/或通过用G-C置换A-U来稳定。在一些实施方案中，所述adRNA经由在所述adRNA的任何一个末端或两个末端处掺入2'-O-甲基、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯或2'-O-甲基3'硫代PACE中的一个或多个来稳定。在另一个方面，所述受试者是人类并且任选地是儿科患者。

又另外的方面涉及一种组合物，其包含本文公开的载体中的任何一种或多种和任选的一种或多种载剂，如药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，所述组合物还包含有效量的干扰素以增强内源性ADAR1表达。在又另外的实施方案中，所述干扰素是干扰素α。

本文公开的一些方面涉及用于在有需要的受试者中恢复蛋白质表达的方法，所述方法包括以下步骤，或可选地基本上由以下步骤组成，或还进一步由以下步骤组成：向所述受试者施用具有识别编码所述蛋白质的RNA序列中的突变的反密码子序列的tRNA或向所述受试者施用编码所述tRNA中的一种或多种的载体。在一些实施方案中，所述突变是无义突变，任选地是提前终止密码子。在一些实施方案中，所述无义突变是DNA中的TAA和RNA中的UAA。在一些实施方案中，所述tRNA是带有规范氨基酸的修饰的内源性tRNA。在一些实施方案中，所述规范氨基酸是丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在一些实施方案中，所述正交tRNA具有相应的合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在一些实施方案中，向受试者引入或施用非规范氨基酸(例如经由食物)，从而允许诱导正交tRNA活性。在一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA靶向琥珀型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向赭石型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向蛋白石型密码子。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在另一个方面，所述受试者是人类并且任选地是儿科患者。

本文公开的另外的方面涉及在有需要的受试者中治疗特征在于蛋白质缺乏的疾病、病症或状况的方法，所述方法包括以下步骤，或可选地基本上由以下步骤组成，或还进一步由以下步骤组成：向所述受试者施用具有识别编码所述蛋白质的RNA序列中的突变的反密码子序列的tRNA或编码所述tRNA中的一种或多种的载体。在一些实施方案中，所述突变是无义突变，任选地是提前终止密码子。在一些实施方案中，所述无义突变是DNA中的TAA和RNA中的UAA。在一些实施方案中，所述tRNA是带有规范氨基酸的修饰的内源性tRNA。在一些实施方案中，所述规范氨基酸是丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在一些实施方案中，所述正交tRNA具有相应的合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在一些实施方案中，向所述受试者施用或引入非规范氨基酸(例如经由食物)，从而允许诱导正交tRNA活性。在一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA靶向琥珀型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向赭石型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向蛋白石型密码子。在一些实施方案中，所述蛋白质缺乏是抗肌萎缩蛋白缺乏。在一些实施方案中，所述疾病、病症或状况是肌营养不良症。在一些实施方案中，所述肌营养不良症是杜兴氏肌营养不良症。在另一个方面，所述受试者是人类并且任选地是儿科患者。

其它方面涉及一种载体，其编码具有识别编码所述蛋白质的RNA序列中的突变的反密码子序列的一种或多种tRNA。在一些实施方案中，所述突变是无义突变，任选地是提前终止密码子。在一些实施方案中，所述无义突变是DNA中的TAA和RNA中的UAA。在一些实施方案中，所述tRNA是带有规范氨基酸的修饰的内源性tRNA。在一些实施方案中，所述规范氨基酸是丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在一些实施方案中，所述正交tRNA具有相应的合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在一些实施方案中，所述载体还包含相应的合成酶。在一些实施方案中，向受试者引入或施用非规范氨基酸(例如经由食物)，从而允许诱导正交tRNA活性。在一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA靶向琥珀型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向赭石型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向蛋白石型密码子。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在一些实施方案中，所述突变是无义突变，任选地是提前终止密码子。在一些实施方案中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV8载体。

本公开的另外的方面涉及治疗性蛋白质的按需体内产生，诸如但不限于(i)胰岛素；(ii)针对病毒(例如HIV、HCV、HPV、流感)和细菌(例如金黄色葡萄球菌；药物抗性菌株)的中和抗体。这些方法方面包括向受试者施用编码在序列中具有突变的治疗性蛋白质的载体和具有识别编码所述治疗性蛋白质的RNA序列中的突变的反密码子序列的tRNA或编码所述tRNA中的一种或多种的载体。因此，上文公开的涉及具有识别编码蛋白质的RNA序列中的突变的反密码子序列的tRNA或编码所述tRNA中的一种或多种的载体的方法和载体中的任一种也可以应用于该方面。

本文公开的一些方面涉及用于在有需要的受试者中恢复蛋白质表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于ADAR2的RNA编辑系统，所述基于ADAR2的RNA编辑系统包含ADAR2、一种或多种用于ADAR2的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR2的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR2的RNA编辑系统特异性地编辑编码所述蛋白质的RNA序列中的突变；或编码所述ADAR2、adRNA、radRNA的一种或多种载体。在一些实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统将腺苷(A)变成肌苷(I)，其在翻译期间被阅读成鸟苷(G)。在一些实施方案中，所述突变是无义突变。在一些实施方案中，所述无义突变是DNA中的TAA和RNA中的UAA。在一些实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统在无义突变中一个或多个腺苷(A)处引起点突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统将UAA转化成UIA(被阅读成UGA)。在另外的实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统将UIA(被阅读成UGA)转化成UII(被阅读成UGG)。在一些实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统将UAA转化成UAI(被阅读成UAG)。在一些实施方案中，所述方法还包括施用tRNA，如上文公开的tRNA，所述tRNA识别由ADAR2编辑的序列编码的密码子。在一些实施方案中，所述tRNA是带有规范氨基酸的修饰的内源性tRNA。在一些实施方案中，所述规范氨基酸是丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在一些实施方案中，所述正交tRNA具有相应的合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在一些实施方案中，向受试者引入非规范氨基酸(例如经由食物)，从而允许诱导正交tRNA活性。在一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA靶向琥珀型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向赭石型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向蛋白石型密码子。在一些实施方案中，所述蛋白质缺乏是抗肌萎缩蛋白缺乏。在一些实施方案中，所述疾病、病症或状况是肌营养不良症。在一些实施方案中，所述肌营养不良症是杜兴氏肌营养不良症。

本文公开的另外的方面涉及在有需要的受试者中治疗特征在于蛋白质缺乏的疾病、病症或状况的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于ADAR2的RNA编辑系统，所述基于ADAR2的RNA编辑系统包含ADAR2、一种或多种用于ADAR2的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR2的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR2的RNA编辑系统特异性地编辑编码所述蛋白质的RNA序列中的突变或编码所述ADAR2、adRNA、radRNA的一种或多种载体。在一些实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统将腺苷(A)变成肌苷(I)，其在翻译期间被阅读成鸟苷(G)。在一些实施方案中，所述突变是无义突变。在一些实施方案中，所述无义突变是TAA。在一些实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统在无义突变中一个或多个腺苷(A)处引起点突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统将UAA转化成UIA(被阅读成UGA)。在另外的实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统将UIA(被阅读成UGA)转化成UII(被阅读成UGG)。在一些实施方案中，所述基于ADAR2的RNA编辑系统将UAA转化成UAI(被阅读成UAG)。在一些实施方案中，所述方法还包括施用tRNA，如上文公开的tRNA，所述tRNA识别由ADAR2编辑的序列编码的密码子。在一些实施方案中，所述tRNA是带有规范氨基酸的修饰的内源性tRNA。在一些实施方案中，所述规范氨基酸是丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在一些实施方案中，所述正交tRNA具有相应的合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在一些实施方案中，向受试者引入非规范氨基酸(例如经由食物)，从而允许诱导正交tRNA活性。在一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA靶向琥珀型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向赭石型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向蛋白石型密码子。在一些实施方案中，所述蛋白质缺乏是抗肌萎缩蛋白缺乏。在一些实施方案中，所述疾病、病症或状况是肌营养不良症。在一些实施方案中，所述肌营养不良症是杜兴氏肌营养不良症。

其它方面涉及一种重组表达系统，其包含编码基于ADAR2的RNA编辑系统的一种或多种载体，所述基于ADAR2的RNA编辑系统包含一种或多种ADAR2、一种或多种用于ADAR2的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR2的相应反向指导RNA(“radRNA”)中的一种或多种，其中所述基于ADAR2的RNA编辑系统特异性地编辑编码蛋白质的RNA序列中的突变。在一些实施方案中，ADAR2将腺苷(A)变成肌苷(I)，其在翻译期间被阅读成鸟苷(G)。在一些实施方案中，一个adRNA/radRNA对指导UAA向UIA(被阅读成UGA)的转化。在另外的实施方案中，第二adRNA/radRNA对指导UIA(被阅读成UGA)向UII(被阅读成UGG)的转化。在一些实施方案中，一个adRNA/radRNA对指导UAA向UAI(被阅读成UAG)的转化。在一些实施方案中，一种或多种载体或另外的载体还编码tRNA，如上文公开的tRNA，所述tRNA识别由ADAR2编辑的序列编码的密码子。在一些实施方案中，所述tRNA是带有规范氨基酸的修饰的内源性tRNA。在一些实施方案中，所述规范氨基酸是丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在一些实施方案中，所述正交tRNA具有相应的合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在一些实施方案中，向受试者引入非规范氨基酸(例如经由食物)，从而允许诱导正交tRNA活性。在一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA靶向琥珀型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向赭石型密码子。在一些实施方案中，所述tRNA靶向蛋白石型密码子。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在一些实施方案中，所述突变是无义突变。在一些实施方案中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV8载体。

本公开的另外的方面涉及治疗性蛋白质的按需体内产生，诸如但不限于(i)胰岛素；(ii)针对病毒(例如HIV、HCV、HPV、流感)和细菌(例如金黄色葡萄球菌；药物抗性菌株)的中和抗体。这些方法方面包括向受试者施用编码在序列中具有突变的治疗性蛋白质的载体和基于ADAR2的RNA编辑系统，所述基于ADAR2的RNA编辑系统包含ADAR2、一种或多种用于ADAR2的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR2的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR2的RNA编辑系统特异性地编辑编码所述蛋白质的RNA序列中的突变或编辑编码所述ADAR2、adRNA、radRNA的一种或多种载体。因此，上文公开的涉及基于ADAR2的RNA编辑系统的方法和载体中的任一种特异性地编辑编码所述蛋白质的RNA序列中的突变，或编辑一种或多种编码所述ADAR2、adRNA、radRNA的载体的载体。

部分序列表

mU6，tRNA(U25C)琥珀型

tcccggggtttccgccaTTTTTTGGTACTGAGtCGCCCaGTCTCAGATAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGTTTGggaaacctgatcatgtagatcgaaCggactCTAaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgccaTTTTTTCCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG

mU6，tRNA(U25C)赭石型

tcccggggtttccgccaTTTTTTGGTACTGAGtCGCCCaGTCTCAGATAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGTTTGggaaacctgatcatgtagatcgaaCggactTTAaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgccaTTTTTTCCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG

mU6，tRNA(U25C)蛋白石型

tcccggggtttccgccaTTTTTTGGTACTGAGtCGCCCaGTCTCAGATAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGTTTGggaaacctgatcatgtagatcgaaCggactTCAaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgccaTTTTTTCCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG

MmPylRS(AfIII)

CAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCGAACCCTTAAGgccaccATGGATAAGAAACCTTTGAACACTCTCATTAGTGCGACAGGGCTCTGGATGTCCCGAACGGGGACTATACACAAGATAAAACACCATGAGGTCTCAAGGAGCAAAATCTATATCGAGATGGCATGCGGCGACCATCTTGTGGTAAATAATAGTAGGTCCTCCAGGACGGCAAGAGCACTCCGACATCACAAGTACAGAAAAACCTGCAAACGGTGTAGGGTATCCGACGAAGACTTGAACAAATTTTTGACTAAGGCCAACGAGGATCAAACTTCTGTCAAAGTGAAAGTGGTTTCTGCTCCTACCCGAACTAAGAAGGCCATGCCCAAGTCCGTGGCAAGGGCACCCAAGCCACTCGAAAATACTGAGGCCGCTCAGGCCCAACCATCCGGTAGTAAGTTCAGTCCAGCCATACCCGTAAGTACCCAAGAATCTGTCAGTGTGCCGGCCTCAGTTTCCACATCTATAAGTTCAATTTCTACAGGAGCGACGGCCTCCGCCCTCGTCAAGGGTAACACAAACCCGATAACTTCTATGAGTGCCCCCGTACAGGCATCCGCACCAGCACTGACGAAGTCTCAAACTGATAGGCTGGAAGTGCTCTTGAATCCGAAGGACGAGATATCTCTTAACTCCGGTAAACCTTTCCGGGAGCTGGAAAGTGAACTTCTCAGCCGGCGAAAAAAAGACCTCCAGCAAATTTACGCAGAGGAAAGGGAGAACTATCTGGGGAAGTTGGAACGAGAGATCACCCGATTCTTTGTCGATCGCGGATTTTTGGAGATTAAAAGCCCAATTCTCATCCCCCTTGAATATATCGAACGAATGGGAATCGACAATGATACGGAGTTGTCCAAGCAGATTTTCCGCGTAGACAAGAACTTTTGTCTTCGACCCATGCTCGCTCCGAACCTCTACAATTACTTGAGAAAGTTGGACAGAGCGCTCCCGGACCCGATCAAGATATTTGAGATCGGTCCTTGTTATAGAAAGGAGAGTGATGGAAAAGAACACCTCGAAGAGTTCACGATGCTGAACTTCTGCCAAATGGGTTCTGGCTGCACACGGGAGAATCTCGAAAGCATCATTACAGATTTCCTTAACCATCTGGGGATAGACTTTAAAATAGTGGGTGACAGCTGTATGGTATACGGAGATACCTTGGACGTAATGCACGGGGATCTTGAGCTTTCCTCCGCCGTGGTTGGACCTATACCGTTGGACCGGGAGTGGGGAATCGACAAACCGTGGATAGGCGCCGGTTTCGGCCTTGAAAGACTCCTCAAAGTCAAGCATGATTTCAAAAACATAAAACGGGCTGCTCGCTCCGAATCTTATTACAACGGTATAAGTACGAACCTGTGATAATAGCTTAAGGGTTCGATCCCTACtGGTTAGTAATGAGTTTA

tRNAs

琥珀型抑制：

ggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcca

琥珀型抑制(2)：

ggggggtggatcgaatagatcacacggactctaaattcgtgcaggcgggtgaaactcccgtactccccgcca

赭石型抑制：

ggaaacctgatcatgtagatcgaatggactttaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcca蛋白石型抑制：

ggaaacctgatcatgtagatcgaatggacttcaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcca

合成酶：

ATGGATAAAAAACCATTAGATGTTTTAATATCTGCGACCGGGCTCTGGATGTCCAGGACTGGCACGCTCCACAAAATCAAGCACCATGAGGTCTCAAGAAGTAAAATATACATTGAAATGGCGTGTGGAGACCATCTTGTTGTGAATAATTCCAGGAGTTGTAGAACAGCCAGAGCATTCAGACATCATAAGTACAGAAAAACCTGCAAACGATGTAGGGTTTCGGACGAGGATATCAATAATTTTCTCACAAGATCAACCGAAAGCAAAAACAGTGTGAAAGTTAGGGTAGTTTCTGCTCCAAAGGTCAAAAAAGCTATGCCGAAATCAGTTTCAAGGGCTCCGAAGCCTCTGGAAAATTCTGTTTCTGCAAAGGCATCAACGAACACATCCAGATCTGTACCTTCGCCTGCAAAATCAACTCCAAATTCGTCTGTTCCCGCATCGGCTCCTGCTCCTTCACTTACAAGAAGCCAGCTTGATAGGGTTGAGGCTCTCTTAAGTCCAGAGGATAAAATTTCTCTAAATATGGCAAAGCCTTTCAGGGAACTTGAGCCTGAACTTGTGACAAGAAGAAAAAACGATTTTCAGCGGCTCTATACCAATGATAGAGAAGACTACCTCGGTAAACTCGAACGTGATATTACGAAATTTTTCGTAGACCGGGGTTTTCTGGAGATAAAGTCTCCTATCCTTATTCCGGCGGAATACGTGGAGAGAATGGGTATTAATAATGATACTGAACTTTCAAAACAGATCTTCCGGGTGGATAAAAATCTCTGCTTGAGGCCAATGCTTGCCCCGACTCTTTACAACTATCTGCGAAAACTCGATAGGATTTTACCAGGCCCAATAAAAATTTTCGAAGTCGGACCTTGTTACCGGAAAGAGTCTGACGGCAAAGAGCACCTGGAAGAATTTACTATGGTGAACTTCTGTCAGATGGGTTCGGGATGTACTCGGGAAAATCTTGAAGCTCTCATCAAAGAGTTTCTGGACTATCTGGAAATCGACTTCGAAATCGTAGGAGATTCCTGTATGGTCTTTGGGGATACTCTTGATATAATGCACGGGGACCTGGAGCTTTCTTCGGCAGTCGTCGGGCCAGTTTCTCTTGATAGAGAATGGGGTATTGACAAACCATGGATAGGTGCAGGTTTTGGTCTTGAACGCTTGCTCAAGGTTATGCACGGCTTTAAAAACATTAAGAGGGCATCAAGGTCCGAATCTTACTATAATGGGATTTCAACCAATCTGTAA

EGFP：

EGFP琥珀型：

EGFP赭石型：

EGFP蛋白石型：

MbPylRS

MmPylRS(uniprot)

PylT*(琥珀型)

ggaaacctgatcatgtagatcgaaCggactCTAaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgccaTTTTTT

PylT*(赭石型)

ggaaacctgatcatgtagatcgaaCggactTTAaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgccaTTTTTT

PylT*(蛋白石型)

ggaaacctgatcatgtagatcgaaCggactTCAaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgccaTTTTTT

小鼠U6引物

tcccggggtttccgccaTTTTTTGGTACTGAGtCGCCCaGTCTCAGAT

CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGGGATAT

tRNA(U25C)琥珀型_F：

通用反向：

PylT

ggaaacctgatcatgtagatcgaatggactCTAaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcca

PylT*(U25C)

ggaaacctgatcatgtagatcgaaCggactCTAaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcca

1.Arg tRNA(蛋白石型)(E-钙粘蛋白论文)

2.Arg tRNA(蛋白石型)(干皮病论文)

3.丝氨酸tRNA(琥珀型)

4.亮氨酸tRNA(琥珀型)

正向：

反向：

tRNA_Leu_Am_F(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Leu_Oc_F(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Leu_Op_F(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Leu_R(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Ser_Am_F(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Ser_Oc_F(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Ser_Op_(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Ser_R(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Arg_Am_F(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Arg_Oc_F(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Arg_Op_F(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

tRNA_Arg_R(与载体的重叠区，粗体；反密码子序列，粗体加下划线)：

mU6_tRNA_ser_oc：GTACTGAGtCGCCCaGTCTCAGATAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGTTTGGTAGTCGTGGCCGAGTGGTTAAGGCGATGGACTTTAAATCCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCCGACTACGTTTTTT

mU6_tRNA_ser_oc_Nhe1_***_F：

AATCCTGCCGACTACGTTTTTTGTACTGAGtCGCCCAGTCT

adRNA(提前终止密码子靶，粗体；编辑的碱基，粗体加下划线)：

顺序编辑：

双重编辑：

radRNA(提前终止密码子靶，粗体；编辑的碱基，粗体加下划线)：

顺序编辑：

双重编辑：

OTC靶(编辑的碱基，粗体)：

adRNA的长度和编辑区距ADAR2募集结构域的距离的优化(adRNA的长度-编辑区距ADAR2募集结构域的距离)：

16-5：atgccaccTGGggcaa

16-6：tgccaccTGGggcaag

16-7：gccaccTGGggcaagc

18-6：gatgccaccTGGggcaag

20-6：gcgatgccaccTGGggcaag

ADAR2募集区v1：

GGGTGGAATAGTATAACAATATGCTAAATGTTGTTATAGTATCCCACCT

ADAR2募集区v2：

GTGGAATAGTATAACAATATGCTAAATGTTGTTATAGTATCCCAC

发夹(3')(图8)：GGGCCCTCTTCAGGGCCCTCTAGA

发夹(3')(图10)：atcgccctgaaaag

支点(5')：gccaccTGGgg

抑制性tRNA序列的列表：

NNN：反密码子

在内源性tRNA中，通过在上文指出的NNN位置处包括互补序列，将tRNA修饰成识别包含点突变的密码子。如下文更详细地阐明，琥珀型、赭石型和蛋白石型tRNA中的NNN序列如下：琥珀型：NNN＝CTA；赭石型：NNN＝TCA；蛋白石型：NNN＝TTA。

用于下一代测序(NGS)分析的引物列表。

名称	序列(5'到3')
		NGS_DMD_F1	GTGTTACTGAATATGAAATAATGGAGGA
NGS_DMD_R1	ATTTCTGGCATATTTCTGAAGGTG
		NGS_DMD_F2	CTCTCTGTACCTTATCTTAGTGTTACTGA
NGS_DMD_R2	CTCTTCAAATTCTGACAGATATTTCTGGC
		NGS_OTC_F	ACCCTTCCTTTCTTACCACACA
NGS_OTC_R	CAGGGTGTCCAGATCTGATTGTT
		NGS_OTC_R2	CTTCTCTTTTAAACTAACCCATCAGAGTT

用于体内RNA编辑研究的adRNA反义序列和相应的ADAR2募集支架的列表。在一些实施方案中，第[0083]段中公开的募集支架v2与这些序列一起使用。

名称	adRNA反义序列(3'到5')
		OTC	TGTCTGTGGCGAG<u>C</u>CAAACA
DMD	ACTTTCTCGTTA<u>CC</u>TTACCG

MCP-接头-ADAR1-NLS(任选序列在括号中)

MCP-接头-ADAR2(任选序列在括号中)

N22p-接头-ADAR1-NLS(任选序列在括号中)

核定位序列-接头-N22p-接头-ADAR2(任选序列在括号中)

MCP-接头-ADAR1(E1008Q)-NLS(任选序列在括号中)

核定位序列-接头-MCP-接头-ADAR2(E488Q)(任选序列在括号中)

N22p-接头-ADAR1(E1008Q)(任选序列在括号中)

核定位序列-接头-N22p-接头-ADAR2(E488Q)

核定位序列-接头-MCP-接头-hAPOPEC1

核定位序列-接头-MCP-接头-rAPOBEC1

dsRBD-接头-rAPOBEC1

dsRBD-接头-hAPOBEC1

MCP-接头-ADAR1-NES

MCP-接头-ADAR2-NLS

MCP-接头-ADAR2-NES

MCP-接头-rAPOBEC1-NLS

MCP-接头-rAPOBEC1-NES

MCP-接头-hAPOBEC1-NLS

MCP-接头-hAPOBEC1-NES

替代的间隔区(可以代替GGSGGSGGS使用)：

SGSETPGTSESATPES

N22p-hAPOBEC1

3XNLS-4xlN-hAPOBEC1

C末端ADAR2(残基1-138缺失)

MLRSFVQFPNASEAHLAMGRTLSVNTDFTSDQADFPDTLFNGFETPDKAEPPFYVGSNGDDSFSSSGDLSLSASPVPASLAQPPLPVLPPFPPPSGKNPVMILNELRPGLKYDFLSESGESHAKSFVMSVVVDGQFFEGSGRNKKLAKARAAQSALAAIFNLHLDQTPSRQPIPSEGLQLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP*

MS2-RNA：

单：

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNggccAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGggcc

双：

aACATGAGGATCACCCATGTcNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNaACATGAGGATCACCCATGTc

BoxB RNA：

单：

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgggccctgaagaagggccc

双：

ggGCCCTGAAGAAGGGCccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNggGCCCTGAAGAAGGGCcc

PP7-RNA：

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNccggagcagacgatatggcgtcgctccgg

双发夹RNA：

TGGAATAGTATAACAATATGCTAAATGTTGTTATAGTATCCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTGGAATAGTATAACAATATGCTAAATGTTGTTATAGTATCCCAC

adRNA中的A-U到G-C取代

v1：

v2：

v3：

v4：

v5：

v6：

v7：

v8：

v9：

v10：

v11：

v12：

v13：

dCas9Cj-NES-接头-cdADAR2(E488Q)

单ADAR2募集结构域和双ADAR2募集结构域：单：

双1：

双2：

双3：

双4：

双5：

附图说明

图1是被开发用于递送修饰的内源性或正交tRNA的载体构建体的示意图。

图2A-B示出了tRNA构建体的抑制效率：(图2A)衍生自精氨酸、丝氨酸和亮氨酸的抑制性tRNA对琥珀型、赭石型和蛋白石型终止密码子的相对效率；示出了在Ser tRNA琥珀型存在下GFP表达的恢复的代表性图像；(图2B)在2mM UAA存在下单或双吡咯赖氨酰tRNA对琥珀型、赭石型和蛋白石型终止密码子的抑制效率的比较；示出了在2mM UAA存在下使用单和双吡咯赖氨酰tRNA琥珀型的相对GFP恢复的代表性图像。

图3示出了使用各种tRNA和氨基酸针对抗肌萎缩蛋白的GFP报告基因结果。

图4示出了在mdx小鼠中进行的抗肌萎缩蛋白恢复实验的结果。

图5示出了用于产生ADAR2构建体的序列。

图6示出了可以由ADAR2对密码子进行的RNA水平点突变的非限制性实例。

图7示出了可以用于基于ADAR2的RNA编辑系统中的构建体的示例性示意图。

图8示出了adRNA的长度和编辑区距ADAR2募集结构域的距离的优化结果。Y轴上每一个类别的简写形式中的第一个数字是adRNA的长度并且第二个数字(在短划线后面)是编辑区距ADAR2募集结构域的距离。具有ADAR2募集区v2的20-6给了我们最好的结果。

图9示出了使用本文所述的编辑系统在体外恢复GFP表达。

图10示出了具有错配的发夹的优化结果。Y轴上每一个类别的简写形式中的第一个数字是错配数并且第二个数字是它距靶标的碱基数。例如，13是1个错配，距靶标3个碱基。

图11示出了不同长度的与靶标无错配的支点指导RNA序列的结果。

图12A-C示出了(图12A)免疫染色、(图12B)蛋白质印迹和(图12C)体外OTC mRNA编辑测定的结果。

图13是蛋白质印迹，其示出了与基于Cas9的方法相比，使用抑制性tRNA恢复了抗肌萎缩蛋白的表达。

图14示出了归一化的抗肌萎缩蛋白mRNA水平。

图15示出了免疫染色的结果。

图16A-D示出了GFP报告基因mRNA中的终止密码子的体外抑制和编辑：(图16A)靶向琥珀型、赭石型和蛋白石型终止密码子的精氨酸、丝氨酸和亮氨酸抑制性tRNA的活性(n＝3个独立的平行测定)。(图16B)在经由AAV载体递送的一个或两个拷贝的吡咯赖氨酰tRNA存在下和在1mM Nε-Boc-L-赖氨酸存在下，基于正交tRNA/aaRS(MbPylRS)的对琥珀型、赭石型和蛋白石型终止密码子的抑制(n＝3个独立的平行测定)(p值分别是0.022、0.002、0.027)。(图16C)以一步、两步或与抑制性tRNA组合，对琥珀型和赭石型终止密码子的基于ADAR2的RNA编辑效率(n＝3个独立的平行测定)。(图16D)在经由AAV载体递送的一个或两个拷贝的adRNA存在下，对琥珀型和赭石型终止密码子的基于ADAR2的RNA编辑效率(n＝3个或6个独立的平行测定)(p值分别是0.0003、0.0001、0.0015)。

图17A-E示出了在人类疾病的小鼠模型中的体内RNA靶向：(图17A)在mdx小鼠中恢复抗肌萎缩蛋白表达的DNA和RNA靶向方法的示意图：(i)引起外显子23的框内切除的基于双gRNA-CRISPR的方法；(ii)对赭石型密码子的tRNA抑制；和(iii)对赭石型密码子的基于ADAR2的编辑。(图17B)对照和处理样品中抗肌萎缩蛋白和nNOS的免疫荧光染色(比例尺：250μm)。(图17C)在相应处理的成年mdx小鼠中的体内TAA→TGG/TAG/TGA RNA编辑效率(n＝3只或4只小鼠)。(图17D)在供体剪接位点处具有G→A点突变或在外显子4的最后一个核苷酸中具有错义的spf^ash小鼠中的OTC基因座和经由ADAR2介导的RNA编辑校正突变型OTCmRNA的方法的示意图。(图17E)在相应处理的成年spf^ash小鼠中的体内A→G RNA编辑效率(n＝3只或4只小鼠)。

图18A-B示出了体外tRNA抑制的评价和优化：(图18A)修饰的丝氨酸抑制性tRNA对赭石型和蛋白石型终止密码子的特异性(n＝3个独立的平行测定)。(图18B)利用三种不同的aaRS：MbPylRS、MmPylRS和AcKRS以及两个或四个拷贝的吡咯赖氨酰tRNA或丝氨酸抑制性tRNA的赭石型终止密码子抑制效率，全部均使用AAV载体递送。MbPylRS、MmPylRS：1mM Nε-Boc-L-赖氨酸；AcKRS：1mM或10mM Nε-乙酰基-L-赖氨酸(n＝3个独立的平行测定)。

图19A-C示出了体外ADAR2介导的位点特异性RNA编辑的评价和优化：(图19A)当adRNA/radRNA具有对应于赭石型终止密码子中的两个腺苷的两个错配时，恢复了GFP表达。单个错配的存在引起琥珀型或蛋白石型终止密码子的形成(n＝3个独立的平行测定)。(图19B)使用的一组adRNA设计。(图19C)使用adRNA设计1的adRNA反义区的优化：系统地改变长度和距ADAR2募集区的距离，并且编辑效率被计算为桑格峰高G/(A+G)的比率(n＝3个独立的平行测定)。

图20A-C示出了经由抑制性tRNA在体内靶向抗肌萎缩蛋白mRNA：(图20A)在用AAV8-双-丝氨酸-赭石型-tRNA处理的mdx小鼠中随时间推移，抗肌萎缩蛋白表达的恢复逐渐增加。(图20B)在用AAV8-双-吡咯赖氨酸-赭石型-tRNA-MbPylRS处理的mdx小鼠中的UAA诱导型nNOS定位。(图20C)抗肌萎缩蛋白的蛋白质印迹显示在用丝氨酸tRNA赭石型、吡咯赖氨酰tRNA赭石型处理并且接受UAA施用的mdx小鼠中以及在Cas9/gRNA处理的样品中抗肌萎缩蛋白表达的部分恢复。

图21A-D示出了抗肌萎缩蛋白和OTC mRNA的体外和体内编辑：(图21A)代表性桑格测序图，显示了在HEK 293T细胞中表达的mdx抗肌萎缩蛋白mRNA的片段中赭石型终止密码子(TAA→TGG)的12.7％编辑(使用NGS定量)。(图21B)经过处理的mdx小鼠的体内RNA编辑分析的代表性实例(使用NGS定量)。(图21C)代表性桑格测序图，显示了在HEK 293T细胞中表达的spf^ash OTC mRNA的片段中点突变的29.7％校正(使用NGS定量)。(图21D)经过处理的spf^ash小鼠的体内RNA编辑分析的代表性实例(使用NGS定量)。

图22A-B示出了ADAR2-E488Q的体外编辑效率。在以下各项的体外编辑中，ADAR2-E488Q使得效率高于ADAR2：(图22A)在HEK293T细胞中表达的spf^ash OTC mRNA的片段(n＝3个独立的平行测定)(p值：0.037)，和(图22B)在HEK293T细胞中表达的mdx抗肌萎缩蛋白mRNA的片段(n＝3个独立的平行测定)(p值分别是0.048、0.012)。效率被计算为桑格峰高G/(A+G)的比率。

图23A-D示出了(图23A)MCP或N22与ADAR1或ADAR2的融合体的示意图；(图23B)adRNA募集APOBEC的示意图；(图23C)更一般的adRNA构造的示意图；和(图23D)在折叠后v2adRNA支架的结构的示意图。

图24A-B示出了任选实施方案的示意图，其中(图24A)可以在本文公开的方法中在具有高内源性ADAR2的组织，例如脑、肺和脾脏中使用内源性ADAR2；和(图24B)可以在具有低水平的内源性ADAR1和ADAR2的组织中增加ADAR1和/或ADAR2水平。从左顺时针方向，(1)adRNA和ADAR2的递送将引起高水平的RNA编辑；(2)单独递送adRNA由于内源性ADAR1和ADAR2的水平低而可能几乎不引起编辑或不引起编辑；(3)用IFN处理细胞将引起ADAR1(p150)水平的增加，但是在不存在adRNA的情况下，不可能引起对RNA靶的任何编辑；(4)在添加adRNA的情况下用IFN处理细胞将引起ADAR1(p150)的水平升高，并且在adRNA存在下，可能引起高水平的靶RNA编辑；(5)在添加adRNA和ADAR2的情况下用IFN处理细胞将引起ADAR1表达的水平升高和高水平的RNA编辑。

图25示出了UAA向UAG的转化率。经由基于ADAR2的编辑，将UAA转化成UAG，并且添加靶向UAG终止密码子的抑制性tRNA引起GFP表达的部分恢复。

图26示出了在肌营养不良症的mdx小鼠模型中体内RNA编辑的结果。

图27示出了由使用混杂C末端ADAR2而产生的所得编辑序列。

图28示出了稳定支架的编辑效率。

图29示出了在使用单ADAR2募集结构域或双ADAR2募集结构域的情况下编辑的mRNA的分数以及相应的序列。

图30示出了在使用各种MCP-ADAR支架的情况下编辑的mRNA的分数。

图31示出了OTC的选择性剪接变体并且取自Hodges,P.E.和Rosenberg,L.E.Thespfash mouse:a missense mutation in the ornithine transcarbamylase gene alsocauses aberrant mRNA splicing(spfash小鼠：鸟氨酸转氨甲酰酶基因中的错义突变也会引起异常的mRNA剪接),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,4142-4146(1989)。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。本文提供的所有核苷酸序列都是以5'到3'方向呈现的。尽管在实施或测试本发明时可以使用与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法、装置和材料。本文引用的所有技术和专利出版物都以引用的方式整体并入本文。本文中的任何内容都不被理解为承认本发明无权凭借在先发明而提早所述公开。

除非另外指明，否则本技术的实施将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见例如Sambrook和Russell编著(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》),第3版；丛书Ausubel等编著(2007),Current Protocols in MolecularBiology(《最新分子生物学方案》)；丛书Methods in Enzymology(《酶学方法》)(纽约州的学术出版社公司(Academic Press,Inc.,N.Y.))；MacPherson等(1991)PCR 1:A PracticalApproach(《PCR 1：实用方法》)(牛津大学出版社(Oxford University Press)的IRL出版社(IRL Press))；MacPherson等(1995)PCR 2:A Practical Approach(《PCR 2：实用方法》)；Harlow和Lane编著(1999)Antibodies,A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique(《动物细胞培养：基本技术手册》),第5版；Gait编著(1984)Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编著(1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)；Hames和Higgins编著(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(《转录和翻译；固定化的细胞和酶》)(IRL出版社(1986))；Perbal(1984)A PracticalGuide to Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》)；Miller和Calos编著(1987)GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》)(冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory))；Makrides编著(2003)Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells(《哺乳动物细胞中的基因转移和表达》)；Mayer和Walker编著(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(《细胞和分子生物学的免疫化学方法》)(伦敦的学术出版社(Academic Press,London))；和Herzenberg等编著(1996)Weir's Handbook of Experimental Immunology(《威尔的实验免疫学手册》)。

本文的描述中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不意图限制本发明。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以引用的方式整体并入本文。

所有数字指示，例如pH值、温度、时间、浓度和分子量(包括范围)是以1.0或0.1的增量变化(+)或(-)的近似值，适当地或可选地+/-15％的变化，或可选地10％，或可选地5％，或可选地2％的变化。应当了解的是，尽管并非总是明确说明，但是在所有数字指示之前都有术语“约”。还应当了解的是，尽管并非总是明确说明，但是本文所述的试剂仅仅是示例性的并且这些试剂的等同物是本领域已知的。

除非上下文另外指出，否则特别意图是本文所述的本发明的各种特征可以任何组合使用。此外，本公开还考虑，在一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。为了说明，如果说明书指出复合物包含组分A、B和C，那么特别意图是A、B或C中的任一个或其组合可以单独或以任何组合形式省略和放弃。

除非另外明确指出，否则所有指定的实施方案、特征和术语都意图包括所述的实施方案、特征或术语和其生物学等同物。

定义

除非上下文另外明确规定，否则如说明书和权利要求中所用的单数形式“a/an(一)”和“所述”包括复数指代对象。例如，术语“一种多肽”包括多种多肽，包括其混合物。

如本文所用的术语“约”在涉及诸如量或浓度等可测量值时意指涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。

如本文所用的术语“包含”意图意指所述组合物和方法包括所叙述的要素，但是并不排除其它要素。“基本上由……组成”在用于限定组合物和方法时应当意指排除对用于预期用途的组合具有任何实质意义的其它要素。因此，基本上由如本文所限定的要素组成的组合物将不会排除来自分离方法和纯化方法的痕量染污物和药学上可接受的载剂，如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由……组成”应当意指排除超过痕量的其它成分要素和用于施用本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个所限定的实施方案落入本发明的范围内。

诊断或治疗的“受试者”是细胞或动物，如哺乳动物或人类。接受诊断或治疗的非人类动物是受到感染或动物模型的动物，例如猿猴；鼠类，如大鼠、小鼠、栗鼠；犬类，如狗；兔类，如兔；家畜、运动动物和宠物。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用并且在它们的最广泛的意义上指的是两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。所述亚基可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，所述亚基可以通过其它键，例如酯、醚等来连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸并且可以构成蛋白质的序列或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所用的术语“氨基酸”指的是天然氨基酸和/或非天然氨基酸或合成氨基酸，包括甘氨酸以及D型光学异构体和L型光学异构体这两者、氨基酸类似物和拟肽。如本文所用的术语“融合蛋白”指的是包含来自多于一种天然存在或重组产生的蛋白质的结构域的蛋白质，其中一般，每一个结构域发挥不同的功能。在这方面，术语“接头”指的是用于将这些结构域连接在一起的蛋白质片段，其任选地保持融合蛋白结构域的构象和/或防止融合蛋白结构域之间可能损害它们对应的功能的不利相互作用。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用并且指的是任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在多核苷酸组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后被进一步修饰，如通过与标记组分缀合。所述术语还指的是双链分子和单链分子。除非另有说明或要求，否则作为多核苷酸的本发明的任何实施方案涵盖双链形式和已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。

多核苷酸由四种核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；和当多核苷酸是RNA时代替胸腺嘧啶的尿嘧啶(U)。在一些实施方案中，多核苷酸可以包含一个或多个其它核苷酸碱基，如肌苷(I)，即当次黄嘌呤经由β-N9-糖苷键与呋喃核糖连接时形成的核苷，从而产生以下化学结构：

肌苷被翻译机器阅读成鸟嘌呤(G)。术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中并且用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性搜索。

如本文所用的“表达”指的是多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自于基因组DNA，那么表达可以包括在真核细胞中mRNA的剪接。

术语“等效”或“生物等效”在涉及特定分子、生物或细胞材料时可互换使用并且意指具有最小同源性而仍维持所期望的结构或功能的那些。

术语“编码”在应用于多核苷酸时指的是如下的多核苷酸，如果所述多核苷酸处于它的天然状态，那么所述多核苷酸被说成“编码”多肽，或当通过本领域技术人员公知的方法操纵时，它可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这样的核酸的互补序列，并且可以由此推导出编码序列。

如本文所用的术语“功能性”可以用于修饰任何分子、生物或细胞材料以意指它实现特定的指定作用。

如本文所用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等在本文用于意指获得所期望的药理作用和/或生理作用。所述作用就完全或部分预防疾病、病症或状况或其体征或症状而言可以是预防性的和/或就部分或完全治愈病症和/或可归因于所述病症的不利影响而言可以是治疗性的。

“施用”可以在整个治疗过程中以一次剂量、连续地或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的、所治疗的靶细胞以及所治疗的受试者而变。可以使用由治疗医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。施用所述药剂的合适的剂量制剂和方法是本领域已知的。也可以确定施用途径并且确定最有效的施用途径的方法是本领域技术人员已知的并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的、所治疗的受试者的健康状况或疾病阶段和靶细胞或组织而变。施用途径的非限制性实例包括口服施用、经鼻施用、注射和局部施用。

术语“有效量”指的是足以实现所期望的作用的量。在治疗或预防应用的背景下，有效量将取决于所讨论的状况的类型和严重程度以及单个受试者的特征，如一般健康情况、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。在免疫原性组合物的背景下，在一些实施方案中，有效量是足以引起针对病原体的保护性响应的量。在其它实施方案中，免疫原性组合物的有效量是足以引起针对抗原的抗体产生的量。在一些实施方案中，有效量是赋予有需要的受试者被动免疫所需的量。关于免疫原性组合物，在一些实施方案中，除了上述因素之外，有效量还将取决于预期用途、特定抗原性化合物的免疫原性程度和受试者的免疫系统的健康情况/响应性。本领域技术人员将能够根据这些因素和其它因素确定适当的量。

在体外应用的背景下，在一些实施方案中，有效量将取决于所考虑的应用的大小和性质。它还将取决于体外靶标的性质和敏感性以及所使用的方法。本领域技术人员将能够基于这些和其它考虑因素来确定有效量。根据实施方案，有效量可以包括组合物的一次或多次施用。

术语“Cas9”指的是由该名称所指代的CRISPR相关核酸内切酶(例如UniProtKBG3ECR1(CAS9_STRTR))以及缺乏核酸内切酶活性的无活性Cas9或dCas9(例如在RuvC结构域和HNH结构域中都具有突变)。术语“Cas9”可以进一步指所参考的Cas9的等同物，所述等同物与其具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性，包括但不限于其它大型Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas9源自于空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)或具有1000个氨基酸或更短的长度的另一种Cas9直系同源物。

术语“载体”指的是用于将外来遗传物质人工地携带到另外的细胞中的多核苷酸(通常是DNA)，在所述细胞中，它可以被复制或表达。非限制性示例性载体包括质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。这样的载体可以源自于多种来源，包括细菌和病毒来源。质粒的非限制性示例性病毒来源是腺相关病毒。

如本文所用的术语“重组表达系统”指的是一种或多种遗传构建体，其用于表达通过重组形成的某些遗传物质；在这方面，术语“构建体”可与如本文所定义的术语“载体”互换。

如本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”指的是与该名称相关并且属于细小病毒科(Parvoviridae)依赖细小病毒属(dependoparvovirus)的一类病毒的成员。已知这种病毒的多种血清型适用于基因递送；所有已知的血清型都可以感染来自各种组织类型的细胞。在现有技术中公开了顺序编号的至少11种。可用于本文公开的目的的非限制性示例性血清型包括11种血清型中的任一种，例如AAV2和AAV8。

如本文所用的术语“慢病毒”指的是与该名称相关并且属于逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(lentivirus)的一类病毒的成员。虽然已知一些慢病毒会引起疾病，但是已知其它慢病毒适用于基因递送。参见例如Tomás等(2013)Biochemistry,Genetics and Molecular Biology(生物化学、遗传学和分子生物学)：“Gene Therapy-Tools and Potential Applications(基因治疗——工具和潜在应用)”,ISBN 978-953-51-1014-9,DOI:10.5772/52534。

如本文所用的关于蛋白质表达的术语“恢复”指的是建立全长蛋白表达的能力，其中先前蛋白质表达由于突变而被截短。

如本文所用的术语“突变”指的是编码蛋白质的核酸序列相对于所述蛋白质的共有序列的改变。“错义”突变引起一个密码子取代另一个密码子；“无义”突变使密码子从编码特定氨基酸的密码子变为终止密码子。无义突变常常引起蛋白质的翻译被截短。“沉默”突变是对所得蛋白质没有影响的突变。如本文所用的术语“点突变”指的是仅影响基因序列中的一个核苷酸的突变。“剪接位点突变”是在前体mRNA(在加工以去除内含子之前)中存在的那些突变，其由于剪接位点的不正确划定而引起蛋白质的错译并且常常引起蛋白质的截短。

“信使RNA”或“mRNA”是从DNA转录而来，然后被加工以去除被称为内含子的非编码部分的核酸分子。所得的mRNA从核(或其中存在DNA的另外的位置)输出并且被翻译成蛋白质。术语“前体mRNA”指的是在加工以去除非编码部分之前的链。

“转移核糖核酸”或“tRNA”是有助于将mRNA翻译成蛋白质的核酸分子。tRNA具有独特的折叠结构，包含三个发夹环；这些环中的一个包含编码反密码子的“茎”部分。反密码子识别mRNA上的相应密码子。每一个tRNA都“带有”对应于mRNA密码子的氨基酸；这种“携带”是通过酶tRNA合成酶实现的。当tRNA识别对应于它的反密码子的密码子时，tRNA将它所携带的氨基酸转移到生长的氨基酸链上以形成多肽或蛋白质。内源性tRNA可以通过内源性tRNA合成酶来进行携带。因此，内源性tRNA通常带有规范氨基酸。源自于外部来源的正交tRNA需要相应的正交tRNA合成酶。这样的正交tRNA可以带有规范氨基酸和非规范氨基酸。在一些实施方案中，tRNA所携带的氨基酸可以被可检测地标记以使得能够在体内进行检测。用于标记的技术是本领域已知的并且包括但不限于点击化学，其中通过正交tRNA/合成酶对添加含有叠氮化物/炔烃的非天然氨基酸，并且因此，可以使用包含炔烃/叠氮化物的荧光团或其它这样的分子进行检测。

术语“终止密码子”意指信使RNA内的三核苷酸连续序列，其发送翻译终止信号。非限制性实例包括RNA中的UAG、UAA、UGA和DNA中的TAG、TAA或TGA。除非另作说明，否则所述术语还包括DNA或RNA内的无义突变，其引入提前终止密码子，从而导致任何所得蛋白质被异常缩短。对应于各种终止密码子的tRNA以特定名称已知：琥珀型(UAG)、赭石型(UAA)和蛋白石型(UGA)。

“规范氨基酸”指的是在人体中天然存在的那20种氨基酸，这些氨基酸以它们各自的三字母缩写、单字母缩写、结构和相应密码子示于下表中：非极性脂族残基

芳族残基

极性不带电荷的残基

带正电荷的残基

带负电荷的残基

术语“非规范氨基酸”指的是属于该组之外的那些合成或以其它方式修饰的氨基酸，通常通过规范氨基酸的化学合成或修饰而产生(例如氨基酸类似物)。本公开在本文公开的一些方法和载体中使用蛋白质非规范氨基酸。非限制性示例性非规范氨基酸是吡咯赖氨酸(Pyl或O)，其化学结构提供于下文中：

肌苷(I)是另一种示例性非规范氨基酸，其通常在tRNA中发现并且对于根据“摆动碱基配对”进行正确翻译来说是必要的。肌苷的结构提供于上文中。

如本文所用的术语“ADAR”指的是可以在RNA序列中将腺苷(A)转化成肌苷(I)的腺苷脱氨酶。ADAR1和ADAR2是参与体内mRNA编辑的两种示例性ADAR。ADAR1的非限制性示例性序列可以见于以下参考号下：HGNC：225；Entrez Gene：103；Ensembl：ENSG 00000160710；OMIM：146920；UniProtKB：P55265；和GeneCards：GC01M154554以及其生物等效物。ADAR2的非限制性示例性序列可以见于以下参考号下：HGNC：226；Entrez Gene：104；Ensembl：ENSG00000197381；OMIM：601218；UniProtKB：P78563；和GeneCards：GC21P045073以及其生物等效物。催化结构域的另外的非限制性示例性序列提供于上文中。用于引导位点特异性ADAR编辑的正向RNA和反向RNA分别被称为“adRNA”和“radRNA”。ADAR1和ADAR2的催化结构域包含在下文提供的序列中。

ADAR1催化结构域：

KAERMGFTEVTPVTGASLRRTMLLLSRSPEAQPKTLPLTGSTFHDQIAMLSHRCFNTLTNSFQPSLLGRKILAAIIMKKDSEDMGVVVSLGTGNRCVKGDSLSLKGETVNDCHAEIISRRGFIRFLYSELMKYNSQTAKDSIFEPAKGGEKLQIKKTVSFHLYISTAPCGDGALFDKSCSDRAMESTESRHYPVFENPKQGKLRTKVENGEGTIPVESSDIVPTWDGIRLGERLRTMSCSDKILRWNVLGLQGALLTHFLQPIYLKSVTLGYLFSQGHLTRAICCRVTRDGSAFEDGLRHPFIVNHPKVGRVSIYDSKRQSGKTKETSVNWCLADGYDLEILDGTRGTVDGPRNELSRVSKKNIFLLFKKLCSFRYRRDLLRLSYGEAKKAARDYETAKNYFKKGLKDMGYGNWISKPQEEKNFYLCPV

ADAR2催化结构域：

QLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLT

ADAR的双链RNA结合结构域(dsRBD)包含在下文提供的序列中。

ADAR dsRBD：

MDIEDEENMSSSSTDVKENRNLDNVSPKDGSTPGPGEGSQLSNGGGGGPGRKRPLEEGSNGHSKYRLKKRRKTPGPVLPKNALMQLNEIKPGLQYTLLSQTGPVHAPLFVMSVEVNGQVFEGSGPTKKKAKLHAAEKALRSFVQFPNASEAHLAMGRTLSVNTDFTSDQADFPDTLFNGFETPDKAEPPFYVGSNGDDSFSSSGDLSLSASPVPASLAQPPLPVLPPFPPPSGKNPVMILNELRPGLKYDFLSESGESHAKSFVMSVVVDGQFFEGSGRNKKLAKARAAQSALAAIFN

应当了解的是，可以对ADAR和/或它的各种结构域的序列进行另外的突变。例如，本发明的申请人已经产生了ADAR1和ADAR2的E488Q突变体和E1008Q突变体以及ADAR2的“混杂”变体(由C末端缺失产生)。这种“混杂”变体之所以被这样称呼是因为它在接近靶序列的具有若干个A的编辑读段中表现出混杂性，显示出A向G的转化(在2个不同的基因座上得到验证)。该变体的序列提供于下文中。

“混杂”ADAR2变体：

MLRSFVQFPNASEAHLAMGRTLSVNTDFTSDQADFPDTLFNGFETPDKAEPPFYVGSNGDDSFSSSGDLSLSASPVPASLAQPPLPVLPPFPPPSGKNPVMILNELRPGLKYDFLSESGESHAKSFVMSVVVDGQFFEGSGRNKKLAKARAAQSALAAIFNLHLDQTPSRQPIPSEGLQLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP*

不受理论所束缚，ADAR1中的C末端缺失可能产生相同的或相似的效果。

如本文所用的术语“缺乏”指的是特定剂低于正常水平(生理学上可接受的水平)。在蛋白质的背景下，缺乏指的是全长蛋白低于正常水平。

如本文所用的术语“抗肌萎缩蛋白”指的是与该名称相对应并且由基因Dmd编码的蛋白质；其非限制性实例见于UniProt参考号P11532(对于人类)和P11531(对于小鼠)下。

如本文所用的术语“鸟氨酸转氨甲酰酶”或“OTC”指的是与该名称相对应并且由基因Otc编码的蛋白质；其非限制性实例见于UniProt参考号P00480(对于人类)和P11725(对于小鼠)下。OTC缺乏是一种X连锁遗传病，会导致血液中的氨浓度高。在一些情况下，OTC缺乏是由外显子4的供体剪接位点中的G→A剪接位点突变所引起的，所述突变导致前体mRNA的错剪接。这种突变引起延长的或带有点突变的蛋白质的形成。OTC蛋白质水平降低到1/15-1/20。图31(取自Hodges,P.E.和Rosenberg,L.E.The spfash mouse:a missensemutation in the ornithine transcarbamylase gene also causes aberrant mRNAsplicing(spfash小鼠：鸟氨酸转氨甲酰酶基因中的错义突变也会引起异常的mRNA剪接),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,4142-4146(1989))示出了所产生的替代形式。其序列提供于下文中：

OTC前体mRNA(野生型)：

OTC前体mRNA(突变型)：

OTC mRNA(错误剪接，突变型)：

OTC mRNA(正确剪接，突变型)：

OTC mRNA(正确剪接，野生型)：

如上所示，当存在突变时，可产生正确的剪接变体；然而，这样的产生会导致错义突变，这也能导致OTC缺乏。

单独使用或与“基序”组合使用的术语“发夹”、“发夹环”、“茎环”和/或“环”在寡核苷酸的背景下用于指的是当在相反方向上阅读时单链内互补的序列进行碱基配对以形成构象类似于发夹或环的区域时在单链寡核苷酸中形成的结构。

如本文所用的术语“结构域”指的是蛋白质或多肽的特定区域并且与特定功能相关。例如，“与RNA发夹基序相关的结构域”指的是蛋白质的结合一个或多个RNA发夹的结构域。这种结合可以任选地对特定发夹具有特异性。例如，M2噬菌体衣壳蛋白(MCP)能够特异性结合特定的茎环结构，包括但不限于MS2茎环。参见例如Peabody,D.S.,“The RNAbindingsite of bacteriophage MS2 coat protein(噬菌体MS2衣壳蛋白的RNA结合位点)”,EMBOJ.12(2):595-600(1993)；Corrigan和Chubb,“Biophysical Methods in Cell Biology(细胞生物学中的生物物理方法)”,Methods in Cell Biology(2015)。类似地，λN22在本文被称为“N22肽”，能够特异性地结合特定茎环结构，包括但不限于BoxB茎环。参见例如Cilley和Williamson,“Analysis of bacteriophage N protein and peptide binding to boxBRNAusing polyacrylamide gell coelectrophoresis(PACE)(使用聚丙烯酰胺凝胶共电泳(PACE)分析噬菌体N蛋白和肽与boxB RNA的结合)”,RNA 3(1):57-67(1997)。MCP和MS2茎环以及N22肽和BoxB环的序列分别在与ADAR的融合蛋白(MCP、N22肽)和用于adRNA中(MS2茎环、BoxB环)的背景下提供于上文中。

如本文所用的术语“APOBEC”指的是落入参与mRNA编辑(催化C向U的转化)的进化上保守的胞苷脱氨酶家族内的任何蛋白质和其等效物。在一些方面，术语APOBEC指的是APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4或其各自的等效物中的任一种。本文提供了包含一个或多个APOBEC结构域的融合蛋白的非限制性示例性序列，其与ADAR结构域融合或与替代结构域融合以使得它们适用于RNA编辑系统中。为此，APOBEC可以被认为是ADAR的等效物，其催化编辑，尽管通过不同的转化而实现。因此，不受理论所束缚，本发明的申请人认为本文考虑与基于ADAR的编辑系统一起使用的所有实施方案都可以适于在基于APOBEC的RNA编辑系统中使用。

如本文所用的术语“干扰素”指的是已知与免疫应答相关的一组信号传导蛋白。在本申请的上下文中，所关注的干扰素是引起ADAR表达增强的干扰素。干扰素α与ADAR1之间的相关性是公知的，并且因此，本公开考虑使用干扰素α作为增加内源性ADAR1表达的手段。分离的或重组干扰素α的商业来源包括但不限于西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)、R&D系统公司(R&D Sytems)、艾博抗公司(Abcam)和赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)。可选地，可以使用已知的载体和给定的蛋白质序列，例如Q6QNB6(人类IFNA)来产生干扰素α。

在没有明确叙述的情况下推断出并且除非另有意图，否则当本公开涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，其等效物或生物等效物意图落入本公开的范围内。如本文所用的术语“其生物等效物”在涉及参考蛋白、抗体、多肽或核酸时意图与“其等效物”同义，意指具有最小同源性而仍维持所期望的结构或功能的那些。除非本文具体叙述，否则考虑本文提到的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等效物。例如，等效物意指与参考蛋白、多肽或核酸具有至少约70％的同源性或同一性，或至少80％的同源性或同一性，并且可选地，或至少约85％，或可选地至少约90％，或可选地至少约95％，或可选地98％的同源性或同一性百分比并且表现出与参考蛋白、多肽或核酸基本上等同的生物活性。可选地，当提到多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参考多核苷酸或它的互补序列杂交的多核苷酸。

本发明的申请人已经在本文提供了用于下文所述的基因和蛋白质转移以及表达技术的多肽和/或多核苷酸序列。应当了解的是，尽管并非总是明确指出，但是本文提供的序列可以用于提供表达产物以及产生具有相同的生物学特性的蛋白质的基本上相同的序列。这些“生物等效”或“生物活性”多肽是由如本文所述的等效多核苷酸编码的。当使用在默认条件下运行的序列同一性方法进行比较时，它们可以具有与参考多肽至少60％，或可选地至少65％，或可选地至少70％，或可选地至少75％，或可选地至少80％，或可选地至少85％，或可选地至少90％，或可选地至少95％，或可选地至少98％同一的一级氨基酸序列。提供了特定的多肽序列作为具体实施方案的实例。将氨基酸用具有相似电荷的替代氨基酸取代来对序列进行修饰。此外，等效多核苷酸是在严格条件下与参考多核苷酸或它的互补序列杂交的多核苷酸，或关于多肽，是由在严格条件下与参考编码多核苷酸杂交的多核苷酸或它的互补链编码的多肽。可选地，等效多肽或蛋白质是由等效多核苷酸表达的多肽或蛋白质。

“杂交”指的是其中一种或多种多核苷酸发生反应以形成经由核苷酸残基的碱基之间的氢键键合而稳定的复合物的反应。所述氢键键合可以通过沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)、霍格斯坦结合(Hoogstein binding)或以任何其它序列特异性方式发生。所述复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单条自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的步骤，如引发PC反应或通过核糖酶对多核苷酸进行酶促切割。

严格杂交条件的实例包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6×SSC至约10×SSC的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；和约4×SSC至约8×SSC的洗涤溶液。中等杂交条件的实例包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9×SSC至约2×SSC的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；和约5×SSC至约2×SSC的洗涤溶液。高严格条件的实例包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1×SSC至约0.1×SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；和约1×SSC、0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。一般来说，杂交孵育时间是5分钟至24小时，使用1个、2个或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间是约1分钟、2分钟或15分钟。SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。应当了解的是，可以采用使用其它缓冲系统的SSC的等效物。

“同源性”或“同一性”或“相似性”指的是两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较可以为了比较的目的而被比对的每一个序列中的位置来确定。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度是由序列共有的匹配或同源位置数的函数。“无关”或“非同源”序列与本发明的序列之一共有少于40％的同一性，或可选地少于25％的同一性。

本公开的实施方式

点突变是许多遗传性疾病的基础。在这方面，虽然可编程DNA核酸酶已经用于修复突变，但是它们用于基因治疗的用途带来了许多挑战：一是同源重组效率在细胞中通常较低；二是活性核酸酶存在引入永久脱靶突变的风险；以及三是普遍的可编程核酸酶通常包含非人类来源的元件，从而提高了体内免疫原性的可能。鉴于这些，改为直接靶向RNA的方法和使用宿主原生的分子机器将是非常理想的。为此，本发明的申请人已经基于在密码子抑制中使用tRNA和在RNA编辑中使用腺苷脱氨酶，工程化并且优化了两种互补方法，在此一起被称为tRiAD。具体地，通过经由腺相关病毒递送修饰的内源性tRNA或RNA编辑酶ADAR和相关的指导RNA(adRNA)，本发明的申请人使得能够在抗肌萎缩蛋白基因中携带无义突变的肌营养不良症的mdx小鼠模型中实现提前终止密码子通读和校正。此外，本发明的申请人工程化了ADAR2介导的在鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏的spf^ash小鼠模型的肝脏RNA中的点突变的校正。综上所述，本文公开的结果确立了抑制性tRNA和ADAR2用于体内RNA靶向的用途，并且这种整合的tRiAD方法是稳健的、基因组上无痕的和潜在非免疫原性的，这是因为它利用了效应RNA和人类蛋白。

本公开的方面涉及一种基于tRNA的蛋白质编辑系统，其任选地单独或与基于ADAR的RNA编辑系统组合用于受试者，所述基于ADAR的RNA编辑系统包含一种或多种用于ADAR的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR的RNA编辑系统特异性地编辑编码基因的RNA序列中的点突变。

基于tRNA的蛋白质编辑系统可以包含内源性修饰的tRNA和/或正交tRNA以防止蛋白质的脱靶编辑。在这方面，用于控制这些tRNA的系统公开于下文中。

用于基于ADAR的RNA编辑系统中的adRNA构造是相对简单的，包含与靶标互补的RNA靶向结构域和任选的一个或两个募集结构域(也被称为适体)，所述募集结构域募集各种蛋白质的RNA结合结构域。任选的募集结构域位于RNA靶向结构域的5'末端和/或3'末端处。与它的mRNA靶结合的adRNA的示意图提供于图23C中。在一些实施方案中，adRNA具有A-C错配，其促进ADAR的编辑功能。类似的框架可以用于通过调整支架以靶向核中存在的前体mRNA而在内含子加工之前靶向前体mRNA。这种方法在涉及OTC缺乏(涉及剪接位点突变)的非限制性示例性方法中采用，而mRNA编辑方法在涉及抗肌萎缩蛋白缺乏(涉及无义突变)的非限制性示例性方法中采用。

本发明的申请人测试了图19C中所示的一系列支架以募集ADAR的RNA结合结构域。图中提供的序列表示募集结构域并且斜体N表示与靶标互补的核苷酸。C是促进编辑功能的错配。可以测试具有不同长度和错配位置的序列以确定对于所期望的靶标最佳的adRNA。例如，由本发明的申请人产生的adRNA的募集结构域中的残基被如下修饰(5'-3')：

v1：

v2：

v3：

v4：

v5：

v6：

v7：

v8：

v9：

v10：

v11：

v12：

v13：

在折叠之后V2的结构如图23D所提供。并且相应的radRNA产生如下：

所得的adRNA和radRNA与靶mRNA配对的示意图示于图16C中。

本发明的申请人还应用了替代支架框架，在靶向结构域的任一侧上使用两个ADAR募集结构域(黑色字体)，同时改变了靶向结构域(斜体N)中C错配的位置。

这些非限制性示例性支架为针对特定靶标工程化adRNA和radRNA提供了模板并且可以基于根据本文公开的示例性方法进行的比较功效研究进行优化。

在一些实施方案中，所述基于ADAR的编辑系统还包含ADAR1、ADAR2、其各自的E488Q突变体和E100Q突变体、包含ADAR的催化结构域和与RNA发夹基序相关的结构域的融合蛋白、包含ADAR的催化结构域和无活性Cas9的融合蛋白或包含ADAR的双链结合结构域和APOBEC的融合蛋白。在另外的实施方案中，与RNA发夹基序相关的结构域选自MS2噬菌体衣壳蛋白(MCP)和N22肽的组。在一些实施方案中，所述adRNA包含一个或多个RNA发夹基序。在一些实施方案中，一个或多个RNA发夹基序选自MS2茎环和BoxB环的组。

不受理论所束缚，本发明的申请人认为来自ADAR的双链RNA结合基序可以与几个双链RNA序列结合并且因此可能具有可能的脱靶效应。为了避免这样的效应，本发明的申请人考虑使用外源性蛋白质结构域来识别adRNA中的RNA发夹基序。ADAR1和ADAR2这两者都由RNA结合结构域和催化结构域组成，所示催化结构域催化腺苷转化成肌苷。催化结构域可以与RNA结合结构域解偶联。我们的目标是实现对靶向的腺苷的高编辑效率，同时降低脱靶效应，并且因此正在研究替代的RNA结合结构域。本发明的申请人已经将ADAR1或ADAR2的催化结构域与不同的RNA结合结构域融合，如MCP、N22或无活性的CjCas9(或其它RNA靶向CRISPR，如来自SaCas9、CRISPR-Cas13等)。在添加适当的指导RNA(adRNA)后，所述融合蛋白被募集到靶标，进一步催化腺苷向肌苷的变化。在这种情况下，无活性的CjCas9(和推而广之的其它CRISPR)基本上用作RNA结合结构域，其进而可以拴系到效应子上。

所述结构域与ADAR催化结构域融合以产生特异性靶向包含RNA发夹基序的特定adRNA的ADAR。例如，本发明的申请人已经使用MS2噬菌体衣壳蛋白(MCP)与ADAR1或ADAR2和它们对应的突变体E488Q和E1008Q的催化结构域融合，同时在RNA上使用MS2茎环以募集所述融合蛋白(图23A)。类似于这种系统，本发明的申请人还已经利用N22肽与ADAR1或ADAR2(和它们的突变体)的催化结构域融合，同时利用boxB适体来募集所述融合蛋白。因此，基于添加单发夹或双发夹(MS2/BoxB环)，可以募集一个或两个拷贝的ADAR(图23A)。PP7发夹也被考虑以相同的方式使用。

下文提供了用于募集基于MCP的融合蛋白的非限制性框架序列，其中C错配在靶向结构域内可以变化(小写字母表示有助于使加下划线的发夹稳定的那些接头)：

单个募集结构域(加下划线)：

两个募集结构域(加下划线)：

为基于N22的融合蛋白提供类似的非限制性框架序列：

单个募集结构域(加下划线)：

两个募集结构域(加下划线)：

另一种方法是使adRNA中的募集结构域与Cas9缔合并且使无活性的Cas9与ADAR催化结构域偶联，从而提供相同的特异性募集作用。为基于Cas9的融合蛋白提供用于募集的非限制性框架序列：

Psp dCas13a募集(错配位置可以变化)

CAACATTATCGGGGAGTTTTGACCTCCAAGGTGTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

Cj dCas9募集(错配位置可以变化)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagtccctgaaaagggactaaaataaagagtttgcgggactctgcggggttacaatcccctaaaaccgcttttttt

APOBEC也具有RNA编辑功能(图23B)。因此，替代基于ADAR的编辑系统或除了基于ADAR的编辑系统之外，可以使用它们。例如，本发明的申请人已经形成了MCP/N22肽与APOBEC的融合体以工程化靶向C→T RNA编辑。此外，本发明的申请人已经将ADAR2的双链RNA结合结构域(dsRBD)与APOBEC融合，因此APOBEC可以被adRNA募集。

在本文公开的实施方案中的任一个中，将核定位信号(NLS)添加到融合蛋白中可以有助于靶向核RNA(即前体mRNA)，而将核输出信号(NES)添加到融合蛋白中可以有助于靶向细胞质RNA。这种方法在对剪接位点突变进行编辑时是有用的，这会引起对前体mRNA中的内含子的不正确加工，并且因此，产生不正确的用于翻译的mRNA。OTC缺乏是其中使用adRNA支架靶向前体mRNA可能有用的实例，这是因为大多数异常的OTC表达来自剪接位点突变，从而产生截短的OTC蛋白。将RNA定位标签进一步添加到adRNA中将使得能够靶向特定细胞区室中的RNA。

在其中adRNA包含一个或多个RNA发夹基序的另外的实施方案中，所述一个或多个RNA发夹基序通过用G-C置换A-U来稳定。在一些实施方案中，所述adRNA经由在所述adRNA的任何一个末端或两个末端处掺入2'-O-甲基、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯或2'-O-甲基3'硫代PACE中的一个或多个来稳定。

更一般来说，可以了解的是，adRNA的RNA靶向结构域被设计成使得它们与靶mRNA互补，而在靶腺苷的位置处含有C错配。adRNA的募集结构域是恒定的。作为非限制性实例：

示例性靶标：OTC mRNA(突变加下划线)

adRNA v2(靶向结构域长度：20bp，错配位置在6个碱基之后)：

adRNA v2(靶向结构域长度：21bp，错配位置在6个碱基之后)：

radRNA v2(靶向结构域长度：20bp，错配位置在6个碱基之后)：

adRNA双(靶向结构域长度：20bp，错配位置在5个碱基、14个碱基之后)：

adRNA MS2(靶向结构域长度：20bp，错配位置在14个碱基之后)：

adRNA MS2双(靶向结构域长度：20bp，错配位置在5个碱基、14个碱基之后)：

adRNA BoxB(靶向结构域长度：20bp，错配位置在14个碱基之后)：

adRNA BoxB双(靶向结构域长度：20bp，错配位置在5个碱基、14个碱基之后)：

防止脱靶效应的协调或替代方法是利用内源性ADAR。ADAR2在诸如脑、肺和脾脏的组织中高表达，而ADAR1以高于ADAR1的一般表达水平普遍表达。因此，本发明的申请人提出了两种途径以通过内源性ADAR工程化RNA编辑。第一，可以通过诸如干扰素，例如干扰素α的分子刺激ADAR1表达。第二，可以特定地工程化支架以用于募集ADAR1并且使用v1-v13支架以及上文公开的一些化学修饰的支架进行实验。利用内源性ADAR，而不是过表达可以有助于限制脱靶效应。

重组表达系统和载体

本公开的方面涉及载体和重组表达系统。

例如，一些方面涉及一种载体，其编码具有识别编码蛋白质的RNA序列中包含点突变的密码子的反密码子序列的一种或多种tRNA，任选地其中所述点突变产生提前终止密码子。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列TAA和RNA序列UAA的无义突变。在一些实施方案中，所述tRNA是具有识别包含所述点突变的密码子的修饰的反密码子茎的内源性tRNA。在另外的实施方案中，所述tRNA带有丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在另外的实施方案中，所述载体还包含相应的tRNA合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在涉及正交tRNA的一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在一些实施方案中，所述载体编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的两种tRNA。在一些实施方案中，所述载体是AAV载体，任选地是AAV8载体。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。

另外的方面涉及一种重组表达系统，其包含针对受试者编码基于ADAR的RNA编辑系统的一种或多种载体，所述基于ADAR的RNA编辑系统包含一种或多种用于ADAR的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR的RNA编辑系统特异性地编辑编码蛋白质的RNA序列中的点突变。在一些实施方案中，所述点突变产生无义突变，任选地产生提前终止密码子，其具有DNA序列TAA和RNA序列UAA。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UIA，并且任选地，进一步将UIA转化成UII。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UAI。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列CAG和RNA序列CAG的剪接位点或错义突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将CAG转化成CIG。在另外的实施方案中，所述一种或多种载体还编码靶向琥珀型密码子的tRNA。在一些实施方案中，所述基于ADAR的编辑系统还包含ADAR1、ADAR2、其各自的E488Q突变体和E100Q突变体、包含ADAR的催化结构域和与RNA发夹基序相关的结构域的融合蛋白、包含ADAR的催化结构域和无活性Cas9的融合蛋白或包含ADAR的双链结合结构域和APOBEC的融合蛋白。在另外的实施方案中，与RNA发夹基序相关的结构域选自MS2噬菌体衣壳蛋白(MCP)和N22肽的组。在一些实施方案中，所述adRNA包含一个或多个RNA发夹基序。在一些实施方案中，所述一个或多个RNA发夹基序选自MS2茎环和BoxB环的组和/或通过用G-C置换A-U来稳定。在一些实施方案中，所述adRNA经由在所述adRNA的任何一个末端或两个末端处掺入2'-O-甲基、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯或2'-O-甲基3'硫代PACE中的一个或多个来稳定。

一般来说，将诸如RNA的遗传物质包装到一种或多种载体中的方法是本领域公知的。例如，可以使用包装载体和细胞系包装遗传物质并且经由传统的重组方法引入。

在一些实施方案中，包装载体可以包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体(任选地是AAV8)。包装载体含有促进遗传物质递送到细胞中的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是包装质粒，其包含至少一个逆转录病毒辅助DNA序列，所述逆转录病毒辅助DNA序列源自于反式编码包装非复制型逆转录病毒载体所需的所有病毒粒子蛋白质的非复制型逆转录病毒基因组，并且用于以高滴度产生能够包装非复制型逆转录病毒载体的病毒粒子蛋白质，而不会产生复制型辅助病毒。逆转录病毒DNA序列缺少编码病毒的病毒5'LTR的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3'LTR，但是编码外来多聚腺苷酸化位点，例如SV40多聚腺苷酸化位点和在其中需要产生病毒的细胞类型中引导有效转录的外来增强子和/或启动子。逆转录病毒是白血病病毒，如莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。外来增强子和启动子可以是人类巨细胞病毒(HCMV)立即早期(IE)增强子和启动子、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MMSV)的增强子和启动子(U3区)、劳斯肉瘤病毒(RSV)的U3区、脾病灶形成病毒(SFFV)的U3区或与天然莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)启动子连接的HCMVIE增强子。

逆转录病毒包装质粒可以由基于质粒的表达载体编码的两个逆转录病毒辅助DNA序列组成，例如其中第一辅助序列含有编码亲嗜性MMLV或GALV的gag和pol蛋白的cDNA并且第二辅助序列含有编码env蛋白的cDNA。决定宿主范围的Env基因可以衍生自编码异嗜性、双嗜性、亲嗜性、多嗜性(貂病灶形成)或10A1鼠类白血病病毒env蛋白或长臂猿白血病病毒(GALV)env蛋白、人类免疫缺陷病毒env(gp160)蛋白、水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白、I类和II型人类T细胞白血病(HTLV)env基因产物的基因、衍生自上述env基因中的一种或多种的组合的嵌合包膜基因或编码上述env基因产物的细胞质和跨膜区以及针对所期望的靶细胞上的特定表面分子的单克隆抗体的嵌合包膜基因。类似的基于载体的系统可以采用其它载体，如睡美人(sleeping beauty)载体或转座子元件。

然后可以经由适当的施用途径引入所得的包装表达系统，这在本文公开的方法方面详细论述。

组合物

另外的方面涉及一种组合物，其包含本文公开的载体中的任何一种或多种。在一些实施方案中，所述组合物还包含有效量的干扰素以增强内源性ADAR1表达。在又另外的实施方案中，所述干扰素是干扰素α。

简单地说，包括但不限于要求保护的组合物中的任一种的本公开的药物组合物可以包含如本文所述的靶细胞群体与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的组合。

公知的载剂的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本公开的目的，载剂的性质可以是可溶的或不溶的。本领域技术人员将知晓用于结合抗体的其它合适的载剂，或将能够使用常规的实验确定这样的载剂。

这样的组合物还可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本公开的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外施用。在某些实施方案中，本公开的组合物被配制用于静脉内施用。

组合物的施用可以在整个治疗过程中以一次剂量、连续地或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的和所治疗的受试者而变。可以使用由治疗医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。施用所述药剂的合适的剂量制剂和方法是本领域已知的。在另一个方面，本公开的细胞和组合物可以与其它治疗组合施用。

使用本领域已知的方法向宿主施用载体、重组表达系统和/或组合物。可以进行本公开的组合物的这种施用以产生用于实验和筛选测定的所期望的疾病、病症或状况的动物模型。

简单地说，包括但不限于要求保护的组合物中的任一种的本公开的药物组合物可以包含如本文所述的一种或多种载体或重组表达系统与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的组合。这样的组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本公开的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外施用。在某些实施方案中，本公开的组合物被配制用于静脉内施用。

本公开的药物组合物可以适合于待治疗或预防的疾病、病症或状况的方式施用。施用的量和频率将根据诸如患者的状况和患者的疾病的类型和严重程度的因素来确定，尽管可以通过临床试验确定适当的剂量。

恢复蛋白质表达的方法

本公开的方面涉及恢复蛋白质表达的方法。

例如，本公开的一些方面涉及一种在有需要的受试者中恢复蛋白质表达的方法，所述蛋白质在编码所述蛋白质的RNA序列中包含点突变，所述方法包括向所述受试者施用编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的一种或多种tRNA的载体，任选地其中所述点突变产生提前终止密码子。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列TAA和RNA序列UAA的无义突变。在一些实施方案中，所述tRNA是具有识别包含所述点突变的密码子的修饰的反密码子茎的内源性tRNA。在另外的实施方案中，所述tRNA带有丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在另外的实施方案中，所述载体还包含相应的tRNA合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在涉及正交tRNA的一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在另外的实施方案中，将吡咯赖氨酸引入所述受试者的饮食中。在一些实施方案中，所述载体编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的两种tRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。

其它方面涉及一种重组表达系统，其包含针对受试者编码基于ADAR的RNA编辑系统的一种或多种载体，所述基于ADAR的RNA编辑系统包含一种或多种用于ADAR的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR的RNA编辑系统特异性地编辑编码蛋白质的RNA序列中的点突变。在一些实施方案中，所述点突变产生无义突变，任选地产生提前终止密码子，其具有DNA序列TAA和RNA序列UAA。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UIA，并且任选地，进一步将UIA转化成UII。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UAI。在一些实施方案中，任选地在涉及无义或错义突变的实施方案中，所靶向的RNA是mRNA。在另外的实施方案中，所述一种或多种载体还编码靶向琥珀型密码子的tRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列CAG和RNA序列CAG的剪接位点或错义突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将CAG转化成CIG。在一些实施方案中，任选地在涉及剪接位点突变的实施方案中，所靶向的RNA是前体mRNA。在一些实施方案中，所述基于ADAR的编辑系统还包含ADAR1、ADAR2、其各自的E488Q突变体和E100Q突变体、包含ADAR的催化结构域和与RNA发夹基序相关的结构域的融合蛋白、包含ADAR的催化结构域和无活性Cas9的融合蛋白或包含ADAR的双链结合结构域和APOBEC的融合蛋白。在另外的实施方案中，与RNA发夹基序相关的结构域选自MS2噬菌体衣壳蛋白(MCP)和N22肽的组。在一些实施方案中，所述adRNA包含一个或多个RNA发夹基序。在一些实施方案中，所述一个或多个RNA发夹基序选自MS2茎环和BoxB环的组和/或通过用G-C置换A-U来稳定。在一些实施方案中，所述adRNA经由在所述adRNA的任何一个末端或两个末端处掺入2'-O-甲基、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯或2'-O-甲基3'硫代PACE中的一个或多个来稳定。

在任一种情况下，评估蛋白质表达是否“恢复”是通过任何蛋白质定量手段在与基线相比时实现的。基线可以任选地基于受试者的先前水平或作为群体中的正常水平计算，针对受试者的年龄、种族和其它相关的人口统计学信息进行调整。定量蛋白质表达的技术是本领域公知的并且可以任选地利用对照或阈值以用于与基线值进行比较。用于这些研究的本领域已知的方法包括但不限于qRTPCR、ELISA、蛋白质印迹法、蛋白质免疫染色、基于光谱学和/或光谱测定法的方法以及通常进行以确定来自受试者的样品中蛋白质表达的量的其它测定。可选地，“恢复”作用可以基于临床结果来确定。例如，异常的抗肌萎缩蛋白水平与肌营养不良症的症状相关。因此，可以基于临床信号，如这些症状的减轻或逆转外在地确定表达的恢复。对于抗肌萎缩蛋白，肌肉力量的改善可以是一个这样的指标。因此，医师可以进行力量测量以确定结果。另一个实例是鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；异常的OTC水平是罕见的X连锁遗传性病症的结果，所述病症导致氨在血液中的过度积累(由于氮积累)。因此，相关的临床结果将是诸如血液或尿液的生物样品中氨的减少。类似地，与所关注的蛋白质下游的蛋白质相关的临床信号和所述蛋白质的表达可以是“恢复”的相关指标，其中所述所关注的蛋白质参与特定途径。

治疗方法

点突变牵涉到许多疾病、病症和状况。非限制性实例提供于下表1中。

表1

另外的非限制性实例包括鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏、努加雷特夜盲症(Nougaretnight blindness)、尤塞氏综合征、心房纤颤、杜兴氏肌营养不良症、威尔逊氏病、遗传性酪氨酸血症和在诸如B-连环蛋白的基因中携带A→G突变的一些癌症。

因此，本公开的方面涉及某些涉及点突变的疾病、病症和状况的治疗。

例如，一些方法方面涉及在有需要的受试者中治疗疾病、病症或状况，其特征在于在编码与所述疾病、病症或状况相关的蛋白质的RNA序列中存在点突变，所述治疗包括向所述受试者施用编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的一种或多种tRNA的载体，任选地其中所述点突变产生提前终止密码子。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列TAA和RNA序列UAA的无义突变。在一些实施方案中，所述tRNA是具有识别包含所述点突变的密码子的修饰的反密码子茎的内源性tRNA。在另外的实施方案中，所述tRNA带有丝氨酸。在一些实施方案中，所述tRNA是带有非规范氨基酸的正交tRNA。在另外的实施方案中，所述载体还包含相应的tRNA合成酶。在一些实施方案中，所述相应的合成酶是大肠杆菌谷氨酰胺酰-tRNA合成酶。在涉及正交tRNA的一些实施方案中，所述非规范氨基酸是吡咯赖氨酸。在另外的实施方案中，将吡咯赖氨酸引入所述受试者的饮食中。在一些实施方案中，所述载体编码具有识别包含所述点突变的密码子的反密码子序列的两种tRNA。在一些实施方案中，所述疾病、病症或状况选自由表1中所列的疾病、病症和状况组成的组，任选地特征在于无义突变和/或提前终止密码子的存在。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在另外的实施方案中，所述疾病、病症或状况是肌营养不良症。在又另外的实施方案中，所述疾病、病症或状况是杜兴氏肌营养不良症。

另外的方法方面涉及一种在有需要的受试者中治疗疾病、病症或状况的方法，所述疾病、病症或状况的特征在于在编码与所述疾病、病症或状况相关的蛋白质的RNA序列中存在点突变，所述方法包括向所述受试者施用编码基于ADAR的RNA编辑系统的一种或多种载体，所述基于ADAR的RNA编辑系统包含一种或多种用于ADAR的正向指导RNA(“adRNA”)和一种或多种用于ADAR的相应反向指导RNA(“radRNA”)，其中所述基于ADAR的RNA编辑系统特异性地编辑所述点突变。在一些实施方案中，所述点突变产生无义突变，任选地产生提前终止密码子，其具有DNA序列TAA和RNA序列UAA。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UIA，并且任选地，进一步将UIA转化成UII。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将UAA转化成UAI。在一些实施方案中，任选地在涉及无义或错义突变的实施方案中，所靶向的RNA是mRNA。在另外的实施方案中，所述一种或多种载体还编码靶向琥珀型密码子的tRNA。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白。在一些实施方案中，所述点突变产生具有DNA序列CAG和RNA序列CAG的剪接位点或错义突变。在一些实施方案中，所述基于ADAR的RNA编辑系统将CAG转化成CIG。在一些实施方案中，任选地在涉及剪接位点突变的实施方案中，所靶向的RNA是前体mRNA。在一些实施方案中，所述基于ADAR的编辑系统还包含ADAR1、ADAR2、其各自的E488Q突变体和E100Q突变体、包含ADAR的催化结构域和与RNA发夹基序相关的结构域的融合蛋白、包含ADAR的催化结构域和无活性Cas9的融合蛋白或包含ADAR的双链结合结构域和APOBEC的融合蛋白。在另外的实施方案中，与RNA发夹基序相关的结构域选自MS2噬菌体衣壳蛋白(MCP)和N22肽的组。在一些实施方案中，所述方法还包括施用有效量的干扰素以增强内源性ADAR1表达。在又另外的实施方案中，所述干扰素是干扰素α。在一些实施方案中，所述adRNA包含一个或多个RNA发夹基序。在一些实施方案中，所述一个或多个RNA发夹基序选自MS2茎环和BoxB环的组和/或通过用G-C置换A-U来稳定。在一些实施方案中，所述adRNA经由在所述adRNA的任何一个末端或两个末端处掺入2'-O-甲基、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯或2'-O-甲基3'硫代PACE中的一个或多个来稳定。在一些实施方案中，所述疾病、病症或状况选自由表1中所列的疾病、病症和状况组成的组。在另外的实施方案中，所述蛋白质是抗肌萎缩蛋白并且所述疾病、病症或状况是肌营养不良症。在又另外的实施方案中，所述疾病、病症或状况是杜兴氏肌营养不良症。

本领域普通技术人员将了解的是，在这些方法中采用的剂量和施用途径可以基于受试者和所治疗的疾病、病症或状况而变化。基于本领域的知识，这样的合适的剂量和途径可以基于受试者的年龄、种族和其它相关的人口统计学因素来选择。

试剂盒

在一个具体的方面，本公开提供了用于执行本文公开的方法中的任一种的试剂盒以及用于执行本公开的方法和/或施用本文公开的载体、重组表达系统和组合物的说明书。

所述试剂盒还可以包含保存其中所包含的那些组分所需的试剂，例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。所述试剂盒还可以包含检测可检测的标记所需的组分，例如酶或底物。所述试剂盒还可以含有对照样品或一系列对照样品，其可以被测定并且与测试样品进行比较。所述试剂盒的每一种组分可以被封装在单独的容器内并且所有各种容器可以连同用于解释使用所述试剂盒进行的测定的结果的说明书一起放在单个包装内。本公开的试剂盒可以在试剂盒容器上或之中含有书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中所含的试剂。

如果可行，这些建议的试剂盒组分可以本领域技术人员惯用的方式包装。例如，这些建议的试剂盒组分可以溶液或液体分散体等形式提供。

实施例

以下实施例是非限制性的并且说明了可以在各种情况下用于实施本公开的程序。此外，本文公开的所有参考文献以引用的方式整体并入本文。

实施例1：tRNA构建体的设计

按照图1中的示意图设计tRNA构建体以识别无义突变TAA。产生修饰的内源性tRNA和正交tRNA。使用携带无义突变的GFP在体外验证构建体。确定对于修饰的内源性tRNA和正交tRNA，在每一个AAV载体中应当包括两个拷贝的tRNA。选择MbPyl合成酶与正交tRNA一起使用。产生AAV载体，其包含tRNA和GFP(在使用正交tRNA的情况下，还包含合成酶)。这些构建体中使用的序列提供于上述序列表中。

实施例2：mdx小鼠中的全长抗肌萎缩蛋白的恢复

修饰人类丝氨酸tRNA的反密码子茎以使得它识别无义密码子(TAA)。内源性tRNA不能识别终止密码子并且当核糖体到达终止密码子时，翻译终止。Mdx小鼠在编码抗肌萎缩蛋白的基因中带有无义突变(TAA)，因此，它们缺少全长抗肌萎缩蛋白表达。使用AAV将两个拷贝的修饰的tRNA递送到小鼠肌肉中，其进而允许终止密码子通读，从而使得能够表达全长抗肌萎缩蛋白。

向mdx小鼠的小腿肌肉注射1E12个携带2个拷贝的修饰的丝氨酸tRNA和GFP基因的AAV8粒子。然后在1个月之后将这些小鼠处死并且收获小腿肌肉。将肌肉切片并且用针对抗肌萎缩蛋白的抗体染色。注意到抗肌萎缩蛋白表达的明显恢复。此外，肌肉形态也得到改善。

本发明的申请人因此已经使用携带终止密码子的GFP基因在体外证实了我们的载体的活性。此外，本发明的申请人已经证实了mdx小鼠肌肉中抗肌萎缩蛋白表达的恢复。在向mdx小鼠注射携带两个拷贝的丝氨酸tRNA的AAV之后1个月的时间内，本发明的申请人经由免疫组织化学观测到小腿肌肉中抗肌萎缩蛋白表达的恢复。本发明的申请人还注意到肌肉形态改善。

通过小鼠饲料引入吡咯赖氨酸，使用正交tRNA重复本实验，并且在更大的小鼠群体中使用这两种tRNA再次重复本实验。

实施例3：治疗性蛋白质的饮食调节性产生

本发明的申请人旨在实现由骨骼肌按需体内产生治疗剂，如(i)胰岛素；(ii)针对病毒(例如HIV、HCV、HPV、流感)和细菌(例如金黄色葡萄球菌；药物抗性菌株)的中和抗体。

经由AAV(或慢病毒)将所期望的转基因连同正交tRNA/tRNA合成酶对一起递送到肌肉中。这些转基因含有将阻止全长蛋白表达的提前终止密码子(termination codon/stop codon)。为了按需合成治疗剂，在饮食中食用适当的非天然氨基酸，其进而由正交tRNA/tRNA合成酶掺入到提前终止位点处，从而使得能够合成所期望的治疗剂。

实施例4：基于ADAR2的RNA编辑

本发明的申请人怀疑ADAR2(作用于RNA的腺苷脱氨酶)会在mRNA水平上校正突变。本发明的申请人使用腺相关病毒来递送ADAR2和将所述酶引导到突变的adRNA(正向ADAR2指导)或radRNA(反向ADAR2指导)以试图通过编辑无义突变来恢复DMD的mdx小鼠模型中的抗肌萎缩蛋白的表达。本发明的申请人还将该技术应用于代谢障碍鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏的小鼠模型。

与核酸酶相比，ADAR在mRNA中产生位点特异性腺苷向肌苷(A→I)的变化，其中肌苷在翻译期间被阅读成鸟苷(G)并且从而是安全的而免于产生永久的脱靶效应。此外，由于它们在mRNA水平上进行编辑，因此被改变的蛋白质仅瞬时表达。在成年OTC缺陷型小鼠中使用核酸酶会导致大的缺失，这被证明对动物是致命的。使用ADAR可以规避这个问题。对于特征在于点突变的若干种病症来说，这可能是一种容易转化的解决方案。此外，ADAR2的来源是人类，从而使身体对它产生的免疫应答减到最低限度。本发明的申请人还将tRNA抑制的想法与基于ADAR2的RNA编辑组合。此外，本发明的申请人设计了发夹环(3'重叠)和支点(5'重叠)，其有助于提高adRNA/radRNA的特异性。本发明的申请人进而还优化了用于有效A→I编辑的adRNA的长度以及adRNA/radRNA的ADAR2募集结构域。

现有研究已经利用诸如Cas9的核酸酶来使抗肌萎缩蛋白/OTC基因的突变区域缺失并且将它用功能性拷贝置换，以用于治疗由点突变引起的DMD或OTC缺乏。对于DMD，现有治疗包括使用延迟所述病症的症状的皮质类固醇。其它策略包括通过利用诸如阿塔鲁伦或庆大霉素(Gentamycin)的药物进行提前终止密码子通读。另一种策略是外显子跳读，这会产生截短型蛋白质，但是能够降低DMD表型的严重程度。另一种方法是递送u-抗肌萎缩蛋白基因。已经尝试利用腺病毒载体在患者中递送OTC cDNA来进行OTC缺乏的临床试验。其它治疗途径包括使用苯基丁酸钠，其有助于增加废氮的***。

仅在体外证实了ADAR2作为工程化的RNA编辑酶的用途。

本发明的申请人利用包含两个结构域的adRNA和radRNA，一个结构域与靶序列互补并且另一个结构域是ADAR2募集结构域。本发明的申请人利用AAV将这些adRNA/radRNA连同ADAR2酶一起递送。Mdx小鼠在编码抗肌萎缩蛋白的基因中带有无义突变(TAA)。本发明的申请人将两个拷贝的adRNA/radRNA或adRNA/radRNA+tRNA的组合连同ADAR2酶一起包装到AAV中并且将它递送到胫骨前肌(TA)中。本发明的申请人利用三种替代策略来恢复抗肌萎缩蛋白表达：

(1)可以将‘TAA’中的两个腺苷编辑成肌苷的adRNA/radRNA；

(2)顺序方法，其中第一个adRNA/radRNA将TAA转化成TGA，并且下一个adRNA/radRNA将它转化成TGG，从而恢复表达；以及

(3)adRNA/radRNA和tRNA的组合，其中adRNA/radRNA将TAA转化成TAG并且tRNA对琥珀型密码子(TAG)的抑制恢复了抗肌萎缩蛋白表达。

本发明的申请人还经由眼眶后注射将两个拷贝的靶向spf-ash小鼠中的OTC G→A突变的adRNA连同ADAR2一起递送到肝脏中。

所述系统通过将腺苷编辑成肌苷而起作用，所述肌苷在翻译期间被阅读成鸟苷。这可以用于校正点突变以及通过编辑提前终止密码子来恢复表达。在图6中：A.可以通过单次编辑将琥珀型终止密码子转化成色氨酸密码子。B.赭石型终止密码子，在单个步骤中进行两次编辑。C.赭石型终止密码子：顺序编辑。D.赭石型终止密码子：ADAR2编辑与抑制性tRNA组合。

以下10个步骤代表了测试这些构建体的工作流程：

1.设计和克隆ADAR2构建体——adRNA和radRNA。

2.使用携带无义突变的GFP在体外验证构建体。

3.修饰构建体，决定克隆两个拷贝的adRNA/radRNA。产生携带一个拷贝的adRNA/radRNA和一个拷贝的丝氨酸抑制性tRNA的载体。

4.产生携带ADAR2和adRNA/radRNA或抑制性tRNA的AAV8载体。

6.对mdx小鼠进行TA/腓肠肌注射，注射1E12个携带ADAR2和adRNA/radRNA或抑制性tRNA的AAV8粒子。

7.在注射后6周将小鼠处死并且收获TA/腓肠肌。进行免疫组织化学以检测抗肌萎缩蛋白。存在抗肌萎缩蛋白恢复的一些证据。

8.进行qPCR、蛋白质印迹法和NGS。

9.优化载体以提高效率。改变adRNA长度，改变编辑位置。

10.使用优化的载体重复步骤4-步骤8。

本发明的申请人设计了针对GFP中的提前终止密码子的adRNA和radRNA并且证实了表达的稳健恢复(图5)。对于赭石型终止密码子(TAA)，需要两次A→G编辑以恢复表达。本发明的申请人构建了靶向两个A的单个adRNA/radRNA或以顺序方式靶向单个A的两个adRNA/radRNA。本发明的申请人还构建了adRNA/radRNA+抑制性tRNA载体，从而将RNA编辑与tRNA抑制组合。

体外RNA编辑显示出GFP表达的稳健恢复，之后产生带有ADAR2和adRNA/radRNA的AAV以靶向mdx小鼠中的抗肌萎缩蛋白中的无义突变。

向mdx小鼠的胫骨前肌(TA)或腓肠肌注射1E12个携带ADAR2和两个拷贝的adRNA/radRNA或一个拷贝的adRNA/radRNA和抑制性tRNA的AAV8粒子。在6周后将这些小鼠处死并且收获适当的肌肉。将肌肉切片并且用针对抗肌萎缩蛋白的抗体染色。注意到抗肌萎缩蛋白表达的部分恢复。

一般来说，本发明的申请人经由免疫染色注意到抗肌萎缩蛋白表达的部分恢复。然而，蛋白质印迹和NGS没有显示出抗肌萎缩蛋白表达的编辑/恢复的任何证据。

所述系统的潜在应用包括靶向点突变以治疗病症，诸如但不限于DMD、OTC缺乏、威尔逊氏病和1型遗传性酪氨酸血症。它还可以用于形成替代的起始密码子，从而使得蛋白质和它的N末端截短形式能够共存。

实施例5：小鼠模型中的ADAR编辑

基因组工程化方法结合快速发展的合成生物学工具集正使得干扰基因组以用于破译功能、对新功能进行编程和修复异常功能的强大能力成为可能。特别是，可编程的DNA核酸酶，如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas，已经被广泛用于对一系列生物体中的基因组进行工程化。然而，它们在基因治疗中的使用带来至少三个主要的挑战：一是同源重组相对于非同源末端连接的效率通常较低，特别是在占成体的绝大部分的有丝***后细胞中；二是活性核酸酶始终构成引入永久脱靶突变的威胁，从而在不降低活性的情况下对强核酸酶特异性进行工程化以及确保严格调节核酸酶剂量和在靶细胞中的持续时间方面提出了巨大的挑战；以及三是普遍的可编程核酸酶是原核生物来源的或带有非人类来源的结构域，这会在体内治疗应用中造成显著的免疫原性风险。最近出现的碱基编辑方法为基因靶向打开了令人兴奋的替代策略，但是已证实的方法依赖原核生物来源的CRISPR-Cas系统。因此，对于引起蛋白质功能改变的基因组突变，如在引起基因突变的疾病中，改为直接靶向RNA的方法将是非常理想的。利用与双链DNA相比，单链RNA一般更容易进行寡核苷酸介导的靶向而无需另外的使能蛋白的方面并且基于tRNA介导的密码子抑制和遗传密码扩展以及腺苷脱氨酶介导的RNA编辑的进展，本发明的申请人已经工程化和优化了用于RNA靶向的集成平台并且证实了它在体外和体内应用中的功效。

载体设计和构建

为了构建GFP报告基因，即GFP-琥珀型、GFP-赭石型和GFP-蛋白石型，分别使用‘TAG’、‘TAA’和‘TGA’置换野生型GFP的Y39残基而合成了三个基因块并且克隆到CAG启动子的下游。将一个、两个或四个拷贝的内源性抑制性tRNA克隆到含有人类U6和小鼠U6启动子的AAV载体中。分别类似地将吡咯赖氨酰tRNA和adRNA/radRNA连同驱动MbPylRS/MmPylRS/AcKRS或hADAR2表达的CMV启动子一起克隆到含有人类U6和小鼠U6启动子的AAV载体中。

哺乳动物细胞培养和转染

将所有HEK 293T细胞在孵育箱中在37℃和5％CO₂气氛下培养在补充有10％FBS和1％抗生素-抗霉菌素(赛默飞世尔公司)的杜氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium)中。使用市售转染试剂Lipofectamine 2000(赛默飞世尔公司)在HEK 293T细胞中进行所有体外转染实验。在24孔板中使用500ng的报告基因质粒和1000ng的抑制性tRNA/aaRS质粒或adRNA/ADAR2质粒进行所有体外抑制和编辑实验。在30％汇合度下转染细胞。在转染后48小时和72小时收获细胞以分别用于定量抑制和编辑。在转染之前以所期望的浓度将UAA Nε-Boc-L-赖氨酸(Chemimpex公司)和Nε-乙酰基-L-赖氨酸(西格玛公司)添加到培养基中。

AAV载体的产生

使用来自索尔克生物研究所(Salk Institute of Biological Studies)(加利福尼亚州的拉霍亚(La Jolla,CA))的基因转移、靶向和治疗(Gene Transfer,Targeting andTherapeutics)(GT3)核心的方案制备病毒。经由三重转染方法使用HEK 293T细胞产生AAV8粒子并且经由碘克沙醇梯度纯化。转染时的汇合度是约80％。在转染前2小时，将补充有10％FBS的DMEM添加到HEK 293T细胞中。在5×15cm板中产生每一种病毒，其中用7.5μg的pXR-8、7.5μg的重组转移载体、7.5μg的pHelper载体，使用PEI(1μg/μL线性PEI，在1×DPBS(pH 4.5)中，使用HCl)以4:1的PEI:DNA质量比转染每一个板。将混合物在室温下孵育10分钟，然后逐滴施加到细胞培养基上。在72小时后收获病毒并且使用碘克沙醇密度梯度超速离心法纯化。然后使用50kDA过滤器(密理博公司(Millipore))用补充有50mM NaCl和0.0001％Pluronic F68(赛默飞世尔公司)的1×PBS(pH 7.2)将病毒透析到约1mL的最终体积并且根据标准(ATCC VR-1616)，使用对ITR区具有特异性的引物通过qPCR定量。

AAV-ITR-F：5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'；和

AAV-ITR-R：5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3'。

RNA分离和下一代测序文库制备

根据制造商的方案，使用RNeasy Plus通用小型试剂盒(快而精公司(Qiagen))提取mdx小鼠的腓肠肌或TA肌肉或spf^ash小鼠的肝脏中的RNA。如下制备下一代测序文库。使用Protoscript II第一链cDNA合成试剂盒(新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs))合成cDNA。简单地说，使用KAPA Hifi HotStart PCR混合物(卡帕生物系统公司(Kapa Biosystems))，使用扩增所关注的位点周围的150bp的引物，通过PCR扩增500ng输入cDNA。对PCR产物进行凝胶纯化(Qiagen凝胶提取试剂盒)，并且进一步纯化(Qiagen PCR纯化试剂盒)以消除副产物。使用用于Illumina试剂盒的NEBNext多重寡核苷酸(NEB公司)进行文库构建。使用索引引物扩增10ng输入DNA。然后汇集样品并且以5nM浓度加到IlluminaMiseq(150次单端运行)上。使用CRISPResso进行数据分析。

动物实验

AAV注射：根据由加利福尼亚大学圣地亚哥分校(University of California,SanDiego)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的方案进行所有动物程序。所有小鼠都获自杰克逊实验室公司(Jacksonlabs)。使用2.5E+12vg/肌肉将AAV注射到mdx小鼠(6周-10周大)的腓肠肌或TA肌肉中。使用3E+12vg/小鼠经由眼眶后注射将AAV注射到spf^ash(10周-12周大)小鼠体内。

UAA施用：向小鼠喂食含有20mg/ml Nε-Boc-L-赖氨酸(Chemimpex公司)的水，持续1个月。还经由腹膜内注射向小鼠施用30mg的Nε-Boc-L-赖氨酸，每周三次。

免疫荧光

将所收获的腓肠肌或TA肌肉放置在含有OCT化合物(VWR)的模具中并且在液氮中快速冷冻。将20μm切片切割到预处理的组织学载片上。使用4％多聚甲醛固定载片。使用针对抗肌萎缩蛋白的N末端结构域的兔多克隆抗体(1:100，Abcam 15277)，继而使用驴抗兔Alexa 546二抗(1:250，赛默飞世尔公司)检测抗肌萎缩蛋白。

统计分析

使用软件Graphpad Prism进行所有统计分析并且通过不成对双尾t检验计算p值。

结果

本发明的申请人首先集中于建立用于靶向无义突变的系统。这是由于以下事实：无义突变造成了引起可遗传的人类疾病的所有所描述的基因损伤中的11％以及影响基因的编码区的疾病相关的单碱基取代中的接近20％。具体地，我们研究了直接靶向无义突变的两种独立而互补的方法。首先，本发明的申请人集中于经由抑制性tRNA对稳健的无义密码子抑制进行工程化。尽管已经在小鼠体内尝试使用抑制性tRNA进行内源性无义突变的提前终止密码子通读，但是这些先前的研究仅依赖于质粒递送而没有研究稳健和优化的递送形式的使用。此外，也尚未研究对致病性内源性无义突变的基于非天然氨基酸(UAA)的诱导性体内抑制的潜在用途。为此，本发明的申请人首先修饰了丝氨酸tRNA、精氨酸tRNA和亮氨酸tRNA的反密码子茎以形成靶向所有三种终止密码子，即琥珀型、蛋白石型和赭石型的抑制性tRNA，并且使用携带相应无义突变的GFP报告基因在细胞中评价这些构建体。其中，丝氨酸抑制性tRNA表现出最一致和稳健的结果(图16A、图18A)。为了还工程化UAA介导的诱导性密码子抑制，我们随后利用了来自巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)的吡咯赖氨酰tRNA/氨酰tRNA合成酶(aaRS)对(MbPylRS)^32,33并且将它克隆到AAV载体中。这使得能够在终止密码子处可编程地掺入UAA。值得注意的是，本发明的申请人发现将第二个拷贝的tRNA添加到表达载体中显著提高了抑制效率(图18B)。本发明的申请人进一步系统地评价了另外的来自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)的氨酰tRNA合成酶(MmPylRS)³⁴和Nε-乙酰基-赖氨酰-tRNA合成酶(AcKRS)，并且还研究了将每个载体的tRNA拷贝数变为最多4个(图18B)。

由于基于抑制性tRNA的方法可以引起其它非靶标终止密码子的通读，因此本发明的申请人同时还工程化了经由腺苷脱氨酶进行序列特异性靶向RNA编辑的系统。具体地，腺苷→肌苷(A→I)编辑是RNA中常见的转录后修饰，由作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)催化。肌苷是腺苷的脱氨基形式并且在生物化学上识别为鸟嘌呤。最近，多项研究已经证实了体外ADAR2介导的靶向的工程化，并且研究还证实了爪蟾***中的CFTR中的无义突变的校正。在此基础上，本发明的申请人在此利用人类ADAR2酶和从它的天然存在的底物GluR2前体mRNA工程化的相关ADAR2指导RNA (adRNA)工程化了一种用于在体外和体内进行序列特异性靶向RNA编辑的系统。该ADAR2指导RNA包含ADAR募集结构域和可编程的反义区域，所述反义区域与指定的靶RNA序列互补。本发明的申请人首先通过将所述构建体与在Y39处携带无义琥珀型或赭石型突变的GFP报告基因共转染在体外评价了该系统的RNA编辑效率。具体地，本发明的申请人利用两种编辑方法来工程化赭石型终止密码子中的两个腺苷的编辑：其中同时编辑这两个腺苷的一步机制或其中顺序进行编辑的两步机制。此外，我们还研究了将赭石型密码子转化成琥珀型密码子，继而进行琥珀型抑制以恢复GFP表达的可能性。所有三种方法都使得能够恢复GFP表达(图16C、图19A)。本发明的申请人随后构建了AAV载体以连同ADAR2酶一起递送adRNA或反向取向的adRNA (radRNA)。类似于tRNA介导的密码子抑制，添加第二个拷贝的adRNA/radRNA显著提高了靶向效率(图19D)。本发明的申请人进一步系统地评价了修饰的ADAR募集结构域和一系列RNA靶向反义设计，所述设计具有不同的长度和***adRNA的靶标A和R/G基序的核苷酸数量²⁶，从而产生一组有效的adRNA设计(图19B-C)。

基于上述体外优化，本发明的申请人随后测试了用于体内RNA靶向的系统。本发明的申请人首先集中于杜兴氏肌营养不良症(DMD)的mdx小鼠模型³⁵，其在抗肌萎缩蛋白基因的外显子23中带有赭石型终止位点。利用CRISPR-Cas9系统的最新研究已经表明了通过在mdx小鼠中DNA水平上外显子23中进行改变，实现了DMD的预防³⁸和部分功能恢复的有希望的结果。我们因此同时评价了以下三种方法(图17A)：一是用于无义密码子抑制的衍生自修饰的内源性tRNA或吡咯赖氨酰tRNA的抑制性tRNA；二是基于ADAR2的对无义突变的校正；以及三是基于CRISPR-Cas9的基因组靶向以对RNA靶向方法进行基准测试。

相应地，本发明的申请人首先设计了携带两个拷贝的靶向赭石型终止密码子的丝氨酸抑制性tRNA的AAV，并且将其注射到mdx小鼠的胫骨前肌(TA)或腓肠肌中。在2周、4周和8周之后收获小鼠肌肉。随时间推移看到抗肌萎缩蛋白表达的恢复逐渐改善，在8周之后收获的小鼠显示出最大程度的恢复(图17B、图20A)。此外，在肌膜处恢复了神经元一氧化氮合酶(nNOS)活性，这在mdx小鼠中是不存在的，这是因为在突变型抗肌萎缩蛋白中不存在nNOS结合位点(图17B)。为了进一步使所述系统可诱导，还构建了携带两个拷贝的靶向赭石型终止密码子的吡咯赖氨酰tRNA和MbPylRS的载体并且将其注射到mdx小鼠的TA或腓肠肌中，并且将所述小鼠分成两组：一组接受吡咯赖氨酸UAA施用并且对照组不接受所述施用。预期只有接受UAA的小鼠显示出nNOS在肌膜处的定位(图20B)和抗肌萎缩蛋白表达的恢复(图20C)。

随后，本发明的申请人在这种小鼠模型中评价了基于ADAR2的位点特异性RNA编辑方法。为了测试这种系统编辑mdx DMD mRNA中的赭石型终止密码子中的两个腺苷的效率，本发明的申请人首先在HEK293T细胞中使用带有mdx DMD mRNA的片段的报告基因质粒在体外优化了所述构建体。桑格测序和NGS分析确认了成功的靶向(图21A)。本发明的申请人随后将优化的构建体包装到AAV8中并且注射到mdx小鼠的胫骨前肌(TA)或腓肠肌中。在注射后八周，从mdx小鼠、野生型小鼠和接受adRNA靶向和非靶向对照处理的小鼠收集TA和腓肠肌。IHC揭示了抗肌萎缩蛋白表达的明显恢复(图17B)。此外，在肌膜处也恢复了nNOS活性(图17B)。在经过处理的小鼠中观测到0.5％-0.7％的RNA编辑率(TAA→TGG/TAG/TGA)(图17C、图21B)。本发明的申请人还注意到，mdx小鼠没有显示出具有TAA→TGG变化的mRNA，而经过处理的小鼠显示出多达0.42％的TAA→TGG编辑的mRNA。本发明的申请人注意到，在体内靶向研究中公开的CRISPR-Cas9的相应DNA编辑率是约2％³⁹。为了进一步对tRiAD方法进行基准测试，我们因此还经由无义突变的基于CRISPR的基因组编辑来靶向mdx小鼠。本发明的申请人注射了带有双gRNA的载体以切除外显子23密码子，并且预期，这使得一部分肌细胞中的抗肌萎缩蛋白表达恢复(图17B)。

最终，我们还在人类疾病的独立小鼠模型中评价了ADAR2介导的RNA编辑方法。具体地，我们集中于鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏的雄性稀疏皮毛-异常皮肤和毛发(spf^ash)小鼠模型。spf^ash小鼠在OTC基因的第四个外显子的最后一个核苷酸中具有G→A点突变，这导致OTC mRNA缺乏和突变型蛋白质的产生⁴³。最近的研究已经证实使用基于CRISPR-Cas9和同源重组的策略稳健地校正了新生小鼠中的这一突变。然而，在成年小鼠中经由同源定向修复(HDR)进行基因校正是低效的并且会导致基因组缺失，这被证明是致命的，这是因为它们损害靶向小鼠的肝功能。为了测试所述系统在编辑spf^ash OTC mRNA中的点突变方面的有效性(图17D)，本发明的申请人首先在HEK293T细胞中使用带有spf^ash OTC mRNA的片段的质粒在体外评价了我们的构建体。桑格测序和下一代测序(NGS)分析确认了稳健的RNA编辑效率(图21C)。本发明的申请人随后将构建体包装到具有高肝脏趋向性的AAV8中⁴⁴，并且向10周-12周大的spf^ash小鼠注射。在注射后四周，本发明的申请人从spf^ash、野生型同窝仔和接受ADAR2靶向和非靶向载体处理的spf^ash小鼠收集肝脏样品并且经由NGS评价编辑效率。值得注意的是，在经过处理的小鼠中，在剪接的OTC mRNA中观测到在0.8％-4.2％范围内的显著的RNA编辑率(图17E、图21D)，进一步确认了这种方法在成年小鼠体内编辑内源性RNA的效用。

综上所述，本发明的申请人的结果确立了抑制性tRNA和ADAR2作为用于点突变的体内RNA靶向的潜在策略的用途。具体地，通过优化递送，本发明的申请人首先证实了经由使用抑制性tRNA的稳健和可诱导的终止密码子通读。递送修饰的内源性抑制性tRNA进行提前终止密码子通读具有以下几个潜在的优势：它没有与诸如庆大霉素的通读药物相关的毒性并且可以用于在有丝***后细胞中实现有效的终止密码子通读。此外，由于它是内源性来源的，因此它不可能引发强烈的免疫应答。此外，通过基于UAA的系统(尽管是非原生的)实现的可诱导性可以提供对基因表达的严格调节。在未来的研究中将UAA局部注射到靶肌肉中可以进一步有助于提高系统的效率。值得注意的是，本发明的申请人在mdx靶向研究中经由这种方法没有观测到任何明显的毒性。然而，本发明的申请人也注意到，与通读药物类似，对这种策略的重要警告是基于抑制性tRNA的方法将引起其它非靶标终止密码子的通读。在这方面，本发明的申请人因此还在两个独立的小鼠模型中证实了对RNA中的点突变的基于ADAR2的位点特异性校正。本发明的申请人注意到，与DNA相比，RNA中的潜在脱靶是有限的，这是因为转录组仅是基因组的一小部分。其次，即使存在脱靶，所述酶也需要在靶标窗口内存在A才能产生脱靶A→G变化。最后，脱靶效应将是瞬时的。因此，由于诸如ADAR2的RNA编辑酶所引起的总体脱靶效应可能是有限的，尽管需要充分研究酶加工性、混杂性以及adRNA的反义结构域的脱靶杂交。与抑制性tRNA方法相比，人类来源的ADAR2也不太可能引发免疫应答，同时使得能够对RNA进行更具位点特异性的编辑。

本发明的申请人还注意到，与上述基于tRiAD的RNA靶向方法相比，基于CRISPR的基因组靶向方法目前显示出更快的动力学和更大程度的突变型蛋白质恢复。然而，本发明的申请人预测，ADAR2的系统工程化和定向进化可以有助于提高编辑效率并且还消除ADAR2对某些序列的内在偏差，这可以与来自发掘出新型ADAR2调节剂的研究的见解相结合，从而为提高它的稳定性提供线索。在这方面，本发明的申请人测试了ADAR2-E488Q突变体并且注意到，对于在体外表达的DMD和OTC mRNA片段，它都能够实现比野生型ADAR2更高的编辑效率(图22)。体内位点特异性A→G mRNA编辑的验证还为未来经由胞嘧啶脱氨酶的靶向募集进行位点特异性C→T编辑打开了大门，从而潜在地扩展了RNA编辑工具的种类。然而，当经由使用诸如AAV的非整合载体靶向RNA进行基因治疗时，重要的考虑因素是需要定期重新施用效应子构建体，这是因为经过编辑的mRNA的半衰期通常是有限的。其次，RNA折叠、固有的半衰期、定位和RNA结合蛋白也可能影响RNA中的靶位点的可及性。例如，在本实施例中，突变型抗肌萎缩蛋白RNA的半衰期短和需要靶向OTC中的瞬时前体mRNA可能会对总体编辑效率产生负面影响。在从对sgRNA的特异性研究⁴⁹，或屏蔽蛋白的偶联，或最近证实的可编程的RNA结合蛋白和RNA靶向CRISPR-Cas系统中获取线索的同时，对tRNA和adRNA进行化学和结构修饰可能有助于提高RNA稳定性和特异性，并且提高上述方法的效率。随着逐步的改进，本发明的申请人因此预测这种集成的tRiAD工具集将对应用生命科学以及基础研究产生广泛的影响。

实施例6：ADAR和APOBEC编辑功效

测试了许多ADAR支架(双重和单个)在其中过表达ADAR2的细胞系中募集ADAR的功效(图28和图29)。对MCP-ADAR融合支架进行了进一步评估(图30)。使用支架v2评估了内源性mRNA靶编辑效率。

等同方案

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本技术所属领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。

本文说明性描述的本技术可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制条件的情况下被适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地并且不加限制地解读。此外，本文所用的术语和措辞已经被用作描述性术语而非限制性术语，并且并不意图在使用这些术语和措辞时排除所示的和所述的特征或其部分的任何等同方案，但应当认识到各种修改在要求保护的本技术的范围内是可能的。

因此，应当了解的是，在此提供的材料、方法和实例代表优选的方面，是示例性的，并且不意图对本技术的范围构成限制。

本技术已经在本文中被广泛地和一般地描述。落入一般性公开内的较缩小内容和亚类分组中的每一个也形成本技术的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来一般性地说明本技术，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。

此外，在本技术的特征或方面以马库什组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的是，本技术也因此以马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。

本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献明确地以引用的方式整体并入本文，其程度就如同每一篇单独地以引用的方式并入本文一般。在矛盾的情况下，将以包括定义在内的本说明书为准。

其它方面阐述于以下权利要求书内。

参考文献

Welch,E.M.等,PTC124 targets genetic disorders caused by nonsensemutations(PTC124靶向由无义突变引起的遗传性病症),Nature 447,87-91(2007)。

Mah,J.Current and emerging treatment strategies for Duchenne musculardystrophy(杜兴氏肌营养不良症的当前和新兴治疗策略),Neuropsychiatr.Dis.Treat.第12卷,1795-1807(2016)。

Tabebordbar,M.等,In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle andmuscle stem cells(营养不良小鼠肌肉和肌肉干细胞中的体内基因编辑),Science(80.).351,407-411(2016)。

Nelson,C.E.等,In vivo genome editing improves muscle function in amouse model of Duchenne muscular dystrophy(体内基因组编辑改善杜兴氏肌营养不良症的小鼠模型中的肌肉功能),Science(80.).351,(2016)。

Cirak,S.等,Exon skipping and dystrophin restoration in patients withDuchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholinooligomer treatment:an open label,phase 2,dose escalation study(在全身性磷酰二胺吗啉代寡核苷酸治疗之后患有杜兴氏肌营养不良症的患者中的外显子跳读和抗肌萎缩蛋白恢复：开放标签2期剂量递增研究),Lancet 378,595-605(2011)。

Malik,V.等,Gentamicin induced readthrough of stop codons in Duchennemuscular dystrophy(庆大霉素诱导杜兴氏肌营养不良症中的终止密码子的通读),Ann.Neurol.67,NANA (2010)。

Wagner,K.R.等,Gentamicin treatment of Duchenne and Becker musculardystrophy due to nonsense mutations(庆大霉素对由于无义突变所引起的杜兴氏和贝克尔肌营养不良症的治疗),Ann.Neurol.49,706-11(2001)。

Yang,Y.等,A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of ametabolic liver disease in newborn mice(双AAV系统使得Cas9介导的新生小鼠代谢性肝病的纠正成为可能),Nat.Biotechnol.34,334-338(2016)。

Wettengel,J.等,Harnessing human ADAR2 for RNA repair-Recoding a PINK1mutation rescues mitophagy(利用人类ADAR2进行RNA修复——重编码PINK1突变挽救线粒体自噬),Nucleic Acids Res.gkw911(2016)。

Fukuda,M.等,Construction of a guide-RNA for site-directed RNAmutagenesis utilising intracellular A-to-I RNA editing(构建指导RNA以利用细胞内A到I RNA编辑进行定点RNA诱变),1-49。

Hendel,A.等,Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genomeediting in human primary cells(化学修饰的指导RNA增强人类原代细胞中的CRISPR-Cas基因组编辑),Nature Biotechnology,33(9),第985-989页(2015)。

Jinek,M.等,A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease inAdaptive Bacterial Immunity(适应性细菌免疫中的可编程双RNA指导的DNA核酸内切酶),Science(80-.).337,816-821(2012)。

Christian,M.等,Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL EffectorNucleases(使用TAL效应子核酸酶靶向DNA双链断裂),Genetics 186,757-761(2010)。

Urnov,F.D.等,Highly efficient endogenous human gene correction usingdesigned zinc-finger nucleases(使用设计的锌指核酸酶进行高效内源性人类基因校正),Nature 435,646-651(2005)。

Urnov,F.D.,Rebar,E.J.,Holmes,M.C.,Zhang,H.S.和Gregory,P.D.Genomeediting with engineered zinc finger nucleases(使用工程化的锌指核酸酶的基因组编辑),Nat.Rev.Genet.11,636-646(2010)。

Mali,P.等,RNA-guided human genome engineering via Cas9(经由Cas9进行RNA指导的人类基因组工程化),Science 339,823-6(2013)。

Cong,L.,Ran,F.,Cox,D.,Lin,S.和Barretto,R.Multiplex Genome EngineeringUsing CRISPR/Cas Systems(使用CRISPR/Cas系统进行多重基因组工程化),Science(80-.).819,(2013)。

Mario,R.等,Altering the genome by Homologous Recombination(通过同源重组改变基因组),Sci.Virol.Sci.Theor.Appl.Genet.Arch.Tierz.Kexue Tongbao K.Ozatoal.Cell Differ.Aquac.Trans.Am.Fish.Soc 244,1288-1292(1989)。

Takata,M.等,Homologous recombination and non-homologous end-joiningpathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in themaintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells(DNA双链断裂修复的同源重组和非同源末端连接途径在维持脊椎动物细胞的染色体完整性中具有重叠的作用),EMBO J.17,5497-508(1998)。

Cho,S.W.等,Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases(CRISPR/Cas衍生的RNA指导的核酸内切酶和切口酶的脱靶效应的分析),Genome Res.24,132-41(2014)。

Schaefer,K.A.等,Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing invivo(CRISPR-Cas9体内编辑之后的意外突变)；Digenome-seq web tool for profilingCRISPR specificity(用于表征CRISPR特异性的Digenome-seq网络工具),Nature 14,547-548(2017)。

Wang,D.等,Adenovirus-Mediated Somatic Genome Editing of Pten byCRISPR/Cas9 in Mouse Liver in Spite of Cas9-Specific Immune Responses(在小鼠肝脏中通过CRISPR/Cas9对Pten进行腺病毒介导的体细胞基因组编辑，尽管有Cas9特异性免疫应答),Hum.Gene Ther.26,432-42(2015)。

Chew,W.L.等,A multifunctional AAV-CRISPR-Cas9 and its host response(多功能AAV-CRISPR-Cas9和它的宿主响应),Nat.Methods 13,868-874(2016)。

Komor,A.C.,Kim,Y.B.,Packer,M.S.,Zuris,J.A.和Liu,D.R.Programmableediting of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage(在不进行双链DNA切割的情况下对基因组DNA中的靶碱基进行可编程的编辑),Nature533,420-424(2016)。

Gaudelli,N.M.等,Programmable base editing of A.T to G.C in genomicDNA without DNA cleavage(在不进行DNA切割的情况下基因组DNA中A.T到G.C的可编程的碱基编辑),(2017).doi:10.1038/nature24644。

Kim,K.等,Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos(小鼠胚胎中高效的RNA指导的碱基编辑),Nat.Biotechnol.9,12-15(2017)。

Capone,J.P.,Sharp,P.A.和RajBhandary,U.L.Amber,ochre and opalsuppressor tRNA genes derived from a human serine tRNA gene(衍生自人类丝氨酸tRNA基因的琥珀型、赭石型和蛋白石型抑制性tRNA基因),EMBO J.4,213-21(1985)。

Geslain,R.和Pan,T.Functional analysis of human tRNA isodecoders(人类tRNA等解码基因的功能分析),doi:10.1016/j.jmb.2009.12.018。

Panchal,R.G.,Wang,S.,Mcdermott,J.和Link,C.J.Partial FunctionalCorrection of Xeroderma Pigmentosum Group A Cells by Suppressor tRNA(抑制性tRNA对着色性干皮病群A细胞的部分功能校正),Hum.Gene Ther.10,2209-2219(1999)。

Buvoli,M.,Buvoli,A.和Leinwand,L.A.Suppression of nonsense mutationsin cell culture and mice by multimerized suppressor tRNA genes(通过多聚化的抑制性tRNA基因抑制细胞培养物和小鼠中的无义突变),Mol.Cell.Biol.20,3116-24(2000)。

Wang,L.,Brock,A.,Herberich,B.和Schultz,P.G.Expanding the Genetic Codeof Escherichia coli(扩展大肠杆菌的遗传密码),Science(80-.).292,(2001)。

Ernst,R.J.等,Genetic code expansion in the mouse brain(小鼠脑中的遗传密码扩展),1-5(2016).doi:10.1038/nchembio.2160。

Han,S.等,Expanding the genetic code of Mus musculus(扩展小家鼠的遗传密码),Nat.Commun.8,14568(2017)。

Melcher,T.等,A mammalian RNA editing enzyme(哺乳动物RNA编辑酶),Nature379,460-464(1996)。

Rueter,S.M.,Burns,C.M.,Coode,S.A.,Mookherjee,P.和Emeson,R.B.Glutamatereceptor RNA editing in vitro by enzymatic conversion of adenosine to inosine(通过将腺苷进行酶促转化成肌苷在体外编辑谷氨酸受体RNA),Science 267,1491-4(1995)。

Montiel-Gonzalez,M.F.,Vallecillo-Viejo,I.,Yudowski,G.A.和Rosenthal,J.J.C.Correction of mutations within the cystic fibrosis transmembraneconductance regulator by site-directed RNA editing(通过定点RNA编辑来校正囊性纤维化跨膜传导调节因子内的突变),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,18285-90(2013)。

Wettengel,J.,Reautschnig,P.,Geisler,S.,Kahle,P.J.和Stafforst,T.Harnessing human ADAR2 for RNA repair-Recoding a PINK1 mutation rescuesmitophagy(利用人类ADAR2进行RNA修复——重编码PINK1突变挽救线粒体自噬),NucleicAcids Res.gkw911(2016).doi:10.1093/nar/gkw911。

Fukuda,M.等,Construction of a guide-RNA for site-directed RNAmutagenesis utilising intracellular A-to-I RNA editing(构建指导RNA以利用细胞内A到I RNA编辑进行定点RNA诱变),Sci.Rep.7,41478(2017)。

Mort,M.,Ivanov,D.,Cooper,D.N.和Chuzhanova,N.A.A meta-analysis ofnonsense mutations causing human genetic disease(引起人类遗传性疾病的无义突变的荟萃分析),Hum.Mutat.29,1037-1047(2008)。

Bidou,L.,Allamand,V.,Rousset,J.-P.和Namy,O.Sense from nonsense:therapies for premature stop codon diseases(从无义到有义：用于提前终止密码子疾病的治疗),Trends Mol.Med.18,679-688(2012)。

Li,K.等,OCHRE SUPPRESSOR TRANSFER RNA RESTORED DYSTROPHIN EXPRESSIONIN MDX MICE(在MDX小鼠中赭石型抑制性转移RNA恢复抗肌萎缩蛋白表达),Life Sci.61,PL205-PL209(1997)。

Kiselev,A.V.等,Suppression of nonsense mutations in the Dystrophingene by a suppressor tRNA gene(通过抑制性tRNA基因抑制抗肌萎缩蛋白基因中的无义突变)|Ispol'zovanie gena supressornoi tRNK dlia ispravleniia nonsens-mutatsiiv gene distrofina.Mol.Biol.36,43-47(2002)。

Gautier,A.等,Genetically Encoded Photocontrol of Protein Localizationin Mammalian Cells(哺乳动物细胞中蛋白质定位的遗传编码光控制),J.Am.Chem.Soc.132,4086-4088(2010)。

Chatterjee,A.,Xiao,H.,Bollong,M.,Ai,H.和Schultz,P.G.Efficient viraldelivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells(哺乳动物细胞中非天然氨基酸诱变的高效病毒递送系统),110,11803-11808(2013)。

Greiss,S.和Chin,J.W.Expanding the Genetic Code of an Animal(扩展动物的遗传密码),2,14196-14199(2011)。

Robinson-Hamm,J.N.和Gersbach,C.A.Gene therapies that restoredystrophin expression for the treatment of Duchenne muscular dystrophy(恢复抗肌萎缩蛋白表达以用于治疗杜兴氏肌营养不良症的基因治疗),Hum.Genet.135,1029-1040(2016)。

Bulfield,G.,Siller,W.G.,Wight,P.A.和Moore,K.J.X chromosome-linkedmuscular dystrophy(mdx)in the mouse(小鼠中的X染色体连锁肌营养不良症(mdx)),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,1189-92(1984)。

Sicinski,P.等,The molecular basis of muscular dystrophy in the mdxmouse:a point mutation(mdx小鼠中的肌营养不良症的分子基础：点突变),Science244,1578-80(1989)。

Long,C.等,Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA(通过CRISPR/Cas9介导的种系DNA编辑来预防小鼠的肌营养不良症),Science(80-.).345,1184-1188(2014)。

Nelson,C.E.等,In vivo genome editing improves muscle function in amouse model of Duchenne muscular dystrophy(体内基因组编辑改善杜兴氏肌营养不良症的小鼠模型中的肌肉功能),Science(80-.).351,(2016)。

Tabebordbar,M.等,In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle andmuscle stem cells(营养不良小鼠肌肉和肌肉干细胞中的体内基因编辑),Science(80-.).351,407-411(2016)。

Long,C.等,Postnatal genome editing partially restores dystrophinexpression in a mouse model of muscular dystrophy(出生后基因组编辑部分地恢复肌营养不良症的小鼠模型中的抗肌萎缩蛋白表达),Science(80-.).351,400-403(2016)。

Bengtsson,N.E.等,Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editingameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy(肌肉特异性CRISPR/Cas9抗肌萎缩蛋白基因编辑改善杜兴氏肌营养不良症的小鼠模型的病理生理),Nat.Commun.8,14454(2017)。

Hodges,P.E.和Rosenberg,L.E.The spfash mouse:a missense mutation inthe ornithine transcarbamylase gene also causes aberrant mRNA splicing(spfash小鼠：鸟氨酸转氨甲酰酶基因中的错义突变也引起异常的mRNA剪接),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,4142-4146(1989)。

Yang,Y.等,A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of ametabolic liver disease in newborn mice(双AAV系统使得Cas9介导的新生小鼠代谢性肝病的纠正成为可能),Nat.Biotechnol.34,334-338(2016)。

Kuttan,A.和Bass,B.L.Mechanistic insights into editing-sitespecificity of ADARs(ADAR的编辑位点特异性的机制见解),Proc.Natl.Acad.Sci.109,E3295-E3304(2012)。

Tan,M.H.等,Dynamic landscape and regulation of RNA editing in mammals(哺乳动物中的RNA编辑的动态格局和调节),Nature 550,249-254(2017)。

Varani,G.,Cheong,C.和Tinoco,I.Structure of an Unusually Stable RNAHairpint(异常稳定的RNA发夹的结构),Biochemistry 30,3280-3289(1991)。

Tuerk,C.等,CUUCGG hairpins:Extraordinarily stable RNA secondarystructures associated with various biochemical processes(hairpin stability/sequence analysis/reverse transcriptase)(CUUCGG发夹：与各种生物化学过程相关的非常稳定的RNA二级结构(发夹稳定性/序列分析/逆转录酶)),Biochemistry 85,1364-1368(1988)。

Fu,Y.,Sander,J.D.,Reyon,D.,Cascio,V.M.和Joung,J.K.Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs(使用截短型指导RNA提高CRISPR-Cas核酸酶特异性),Nat.Biotechnol.32,279-84(2014)。

Adamala,K.P.,Martin-Alarcon,D.A.和Boyden,E.S.Programmable RNA-bindingprotein composed of repeats of a single modular unit(由单个模块化单元的重复序列构成的可编程RNA结合蛋白),Proc.Natl.Acad.Sci.113,E2579-E2588(2016)。

East-Seletsky,A.等,Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2enable guide-RNA processing and RNA detection(CRISPR-C2c2的两种不同的RNA酶活性使得能够进行指导RNA加工和RNA检测),Nature(2016).doi:10.1038/nature19802。

Abudayyeh,O.O.等,C2c2 is a single-component programmable RNA-guidedRNA-targeting CRISPR effector(C2c2是单组分可编程RNA指导的RNA靶向CRISPR效应子),Science 353,aaf5573 1-9(2016)。

O'Connell,M.R.等,Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9(通过CRISPR/Cas9进行可编程RNA识别和切割),Nature 516,263-266(2014)。

Abudayyeh,O.O.等,RNA targeting with CRISPR-Cas13(用CRISPR-Cas13靶向RNA),Nature(2017).doi:10.1038/nature24049。

Cox,D.B.T.等,RNA editing with CRISPR-Cas13(用CRISPR-Cas13编辑RNA),Science eaaq0180(2017).doi:10.1126/science.aaq0180。

Gootenberg,J.S.等,Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2(用CRISPR-Cas13a/C2c2检测核酸),Science(80-.).356,438-442(2017)。

East-Seletsky,A.,O'Connell,M.R.,Burstein,D.,Knott,G.J.和Doudna,J.A.RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes(通过功能正交的VI-A型CRISPR-Cas酶靶向RNA),Mol.Cell 66,373-383.e3(2017)。

Grieger,J.C.,Choi,V.W.和Samulski,R.J.Production and characterizationof adeno-associated viral vectors(腺相关病毒载体的产生和表征),Nat.Protoc.1,1412-1428(2006)。

Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso(使用CRISPResso分析CRISPR基因组编辑实验),Nat.Biotechnol.34,(2016)。