阅读说明：本技术 一种绵羊chchd7基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用 (Detection method of sheep CHCHCHD 7 gene insertion/deletion polymorphism and application thereof ) 是由 蔡勇 徐红伟 李海霞 蓝贤勇 阿依木古丽 杨具田 臧荣鑫 于 2020-04-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术与家畜育种技术领域,具体是公开了一种绵羊CHCHD7基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用,该方法包括以下步骤,以包含CHCHD7基因的待测绵羊全基因组DNA为模板,利用PCR扩增包含绵羊CHCHD7基因3’侧翼区插入/缺失多态性位点的片段,对PCR扩增产物进行电泳,根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型。本发明检测的插入/缺失多态性位点能够作为滩羊公羊体长性状、胸深性状的分子标记,有利于快速建立体尺性状优良的滩羊种群,加快良种选育速度。(The invention relates to the technical field of biotechnology and livestock breeding, and particularly discloses a detection method of sheep CHCHCHD 7 gene insertion/deletion polymorphism and application thereof. The insertion/deletion polymorphic site detected by the invention can be used as a molecular marker for body length traits and chest depth traits of Tan sheep rams, is beneficial to quickly establishing Tan sheep populations with excellent three-dimensional size traits and quickens the breeding speed of improved varieties.)

一种绵羊CHCHD7基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术与家畜育种技术领域，具体属于一种绵羊CHCHD7基因NC_040260.1:g36219994_3622000位8-bp插入/缺失多态性(indel)位点的快速、准确分型检测及其在分子标记辅助选择育种中的应用。

背景技术

随着分子遗传学的发展，人们越来越多地关注在DNA分子水平上研究基因之间的关系，迄今为止已经发现了几十个与数量性状遗传密切相关的主基因。标记辅助选择(Marker assistance selection，简称MAS)是利用与数量性状相关的分子标记，以标记信息为辅助信息，可以从分子水平准确快速地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的选择。自1990年MAS的提出到现在，已经有二十多种遗传标记用于MAS研究，包括RFLP，RAPD，SSCP，RAMP，DDRT等。MAS可以用于检测基因多态性，是分子育种中常用的方法，经常与传统育种方法结合使用从而实现对基因型的直接选择，以缩短育种周期，加速动物育种速度。并且，该方法在克服表型鉴定的困难、早期选择、进行无损害的性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。

插入/缺失多态性(insertion/deletion，indel)是一种分子标记，是DNA或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的改变，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的小片段DNA。与SNP相比，indel均是源于单突变事件，其突变频率较低，相对比较稳定，在结构上属于二等位基因多态性，能够通过很小的扩增子(<50bp)进行扩增。

indel大致分成以下5大类：(1)单碱基对的插入/缺失；(2)单一碱基的插入/缺失；(3)重复单元为2～15个碱基的多碱基对插入/缺失；(4)转座子插入/缺失；(5)任意DNA序列的插入/缺失多态性。随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的优点。indel多集中在人类和各种农作物(如水稻和玉米等)的基因组研究中，在畜禽上则集中在对鸡生长性状的研究，在反刍动物上研究和应用甚少。由此，对反刍家畜的功能性基因的indel标记研究亟待开拓和深入。

随着人们生活水平的提高，社会对绵羊产品的需求不断加强，但近年来羊肉、羊奶、羊绒等羊产品严重短缺。在高产、优质和高效的绵羊育种目标上，通过对在DNA水平上筛查的与绵羊生长发育性状密切相关的DNA标记进行基因多态性的检测，以及基因多态性与体尺性状的关联分析，从而利用MAS加快建立优良体尺性状绵羊种群一直是关注热点。

CHCHD7基因(Coiled-Coil-Helix-Coiled-Coil-Helix Domain Containing7)，也称为COX23(Cytochrome C Oxidase Assembly Homolog)或MGC2217，位于绵羊的9号染色体，具有5个外显子和4个内含子，长度7139bp，其cDNA可以编码91个氨基酸(Westerman etal.，2004；Banci et al.，2012)。CHCHD7蛋白含有保守的双胞胎Cc9C结构基序，是存在于线粒体膜间隙的细胞色素c氧化酶组装所必需的保守因子(Barros et al.，2004；Cavallaro，2010；Banci et al.，2012)，可能与细胞色素c氧化酶生物发生过程中的铜递送，铜稳态以及与血红素转移过程中的Cox1血红素化有关(Dela Cruz et al.，2016；Murtha et al.，2018)。而且，CHCHD7编码的可溶性蛋白在哺乳动物体内普遍表达，其中在成人的组织中具有最高表达水平，特别是在心脏，骨骼肌和胰腺中；但在胎儿的组织中表达水平较低(Aspet al.，2006)。全基因组分析显示，CHCHD7基因多态性与牛和羊的生长性状有关，如身高，体型和肌肉形成(Utsunomiya et al.，2013；Randhawa et al.，2014；Jiao et al.，2014；Zhao et al.，2015；Taye et al.，2018)。近年来，越来越多的研究表明CHCHD7基因对哺乳动物的生长性状产生有重要影响，如Nellore牛的出生体重(Utsunomiya et al.，2013)；杜洛克猪的断奶重(Jiao et al.，2014)；日本和牛的胴体重量(Nishimura et al.，2012)；安格斯牛，泽西岛牛和荷斯坦牛的体高(Lettre et al.，2008；Taye et al.，2018)；德国Fleckvieh牛，安格斯牛和利木赞牛的体型(Lettre et al.，2008；Zhao et al.，2015；Tayeet al.，2018)。但是，目前尚未见到关于CHCHD7基因indel位点及其与生长发育性状存在显著相关的报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种绵羊CHCHD7基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用，克服了现有技术的不足，。

为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：

一种绵羊CHCHD7基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

以包含CHCHD7基因的待测绵羊全基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含绵羊CHCHD7基因3’侧翼区插入/缺失多态性位点的片段，对PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型；

所述PCR采用的引物对(P1)为：

上游引物：5'-TGGCCTTGACAGACACATCC-3'(20nt)；

下游引物：5'-CCTGCAGAGCTTCCCTTTCT-3'(20nt)。

进一步，所述插入/缺失多态性位点选自绵羊CHCHD7基因NC_040260.1:g36219994_3622000位8-bp插入/缺失多态性位点。

进一步，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型表现为156bp一条带纹，插入/缺失基因型表现为156bp和148bp以及异源双链条带共三条带纹，无缺失/缺失基因型。

进一步，所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，30个循环；72℃延伸10min。

进一步，所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。

上述绵羊CHCHD7基因插入/缺失多态性的检测方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。

进一步，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型可以作为提高滩羊公羊体长和胸深性状的DNA标记。

进一步，所述绵羊选自滩羊。

本发明与现有技术相比较，本发明的实施效果如下：

本发明所述一种绵羊CHCHD7基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用，本发明根据绵羊CHCHD7基因3’侧翼区插入/缺失多态性位点(参考序列NC_040260.1:g36219994_3622000delGTTACAAG)设计引物，以绵羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。

本发明对绵羊(例如，滩羊)CHCHD7基因插入/缺失多态性位点(参考序列NC_040260.1:g36219994_3622000delGTTACAAG)进行基因型和基因频率分析，对插入/缺失多态性位点与绵羊公羊多个体尺性状进行关联分析，结果表明本发明检测的插入/缺失多态性位点能够作为滩羊公羊体长性状(P<0.05)、胸深性状(P<0.05)的分子标记，有利于快速建立体尺性状优良的滩羊种群，加快良种选育速度。

附图说明

图1为引物对P1扩增滩羊CHCHD7基因的产物琼脂糖凝胶电泳结果；M表示Marker；A表示异源双链条带。

图2为绵羊CHCHD7基因PCR扩增产物测序图，其中：黑色方框标出的部分表示8-bp插入序列：NC_040260.1:g36219994_3622000delGTTACAAG。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明不仅限于这些实例，在为脱离本发明宗旨的前提下，所为任何改进均落在本发明的保护范围之内。

本发明利用PCR方法对绵羊CHCHD7基因第9906-9913位点(参考序列：NC_040260.1)突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与绵羊相关体尺性状进行关联分析，验证其是否可以作为绵羊分子育种中辅助选择的分子标记。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②；蛋白酶K(购自华美生物工程公司)③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×105Pa)、25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

1)提取组织样DNA所用溶液：

除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-HCl(pH 8.0)lmL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝以及0.25％二甲苯青FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.设计绵羊CHCHD7基因indel引物

在NCBI上检索绵羊HIAT1基因的序列(NC_040260.1)，并利用Primer5.0设计能够扩增CHCHD7基因多个候选indel位点DNA片段的引物，其中能够扩增绵羊CHCHD7基因3’侧翼区第9906-9913位区域indel位点的PCR引物对为P1(引物设计时间为:2019年6月30日)。引物序列见表1：

表1 绵羊CHCHD7基因候选indel位点扩增引物表

参见图2，上述引物对P1对绵羊基因组扩增，能够扩增包含绵羊CHCHD7基因(NC_040260.1:g36219994_3622000delGTTACAAG)的片段。理论上，当9906与9913位之间的GTTACAAG缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是148bp大小的带纹；当9906与9913位之间的GTTACAAG存在(插入)时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是156bp大小的一条带纹。当9906与9913位之间的GTTACAAG在一个等位基因上出现插入，在另一个等位基因上出现缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是156bp+148bp两条带纹以及一条异源双链条带。为此，根据理论分析结果，引物对P1所扩增的对应插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)表现为156bp一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为156bp和148bp以及异源双链条带共三条带纹，缺失/缺失基因型(DD)表现为148bp一条带纹。

3.以引物对P1 PCR扩增待测绵羊CHCHD7基因片段

3.1绵羊耳组织样品的采集

实验所用的动物共计458个样本，具体信息见表2。体尺性状数据由保种场或养殖场工作人员测量，采样方式采取个体耳组织样品，这些样品为70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

表2 采样信息表

3.2组织样品基因组DNA的提取与分离

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.4DNA的纯化

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD260值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为50ng/μL绵羊基因组DNA)0.6μL；去离子水4.9μL；共13μL体积的PCR扩增体系。

3.7PCR反应的程序

引物对P1 PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，25个循环；72℃延伸10min。

4.扩增PCR产物后琼脂糖凝胶电泳检测分析

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作3.5％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样4.5μL，点样后120V电压电泳1.0-1.2h；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像系统成像；3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析indel多态性；

用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断indel的多态性(参见图1)：

对于绵羊CHCHD7基因NC_040260.1:g36219994_3622000位存在的8bp插入/缺失多态性(8bp-indel)，II基因型表现为156bp一条带纹，ID基因型表现为156bp+148bp以及异源双链条带共三条带纹，无DD基因型。分析结果经测序进行了验证。

5.绵羊CHCHD7基因indel位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PYY＝NYY/N，其中PYY代表某一位点的YY基因型频率；NYY表示群体中具有YY基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PY＝(2NYY+NYa1+NYa2+NYa3+NYa4+……+NYan)/2N

式中，PY表示等位基因Y频率，NYY表示群体中具有YY基因型的个体数量，NYai表示群体中具有Yai基因型个体数量，a1－an为等位基因Y的n个互不相同的复等位基因。

CHCHD7基因8-bp插入/缺失多态性位点中的基因型频率及等位基因频率如表3所示。

表3.绵羊CHCHD7基因第9906-9913位indel基因频率分布表

6.绵羊CHCHD7基因indel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型；

生产数据：滩羊的体尺性状(体重(kg)、体长(cm)、体高(cm)、胸宽(cm)、胸深(cm)、胸围(cm)、管围(cm)、十字部高(cm)共8个性状)。

关联分析模型：利用SPSS(24.0)软件来分析品种，不同因素与体尺性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y＝μ+G+E，其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；G：标记基因型效应；E：随机误差。

由表4可以看出，在对458只滩羊的体尺性状研究中，CHCHD7基因8bp indel多态性对体长和胸深有显著影响(P<0.05)，II基因型个体性状优于ID基因型个体。因此，绵羊CHCHD7基因NC_040260.1:g36219994_3622000位8-bp插入/缺失多态性位点可作为滩羊体长和胸深性状的DNA分子标记。

表4 绵羊CHCHD7基因P1-8bp indel与滩羊体尺性状关联分析(Mean±SE)

注：平均值肩上字母不同a和b表示差异显著(P<0.05)

结果表明：绵羊CHCHD7基因8bp-indel位点的不同基因型，在滩羊中对体长和胸深都具有显著关联。

总之，本发明利用PCR扩增方法检测绵羊CHCHD7基因NC_040260.1:g36219994_3622000位8-bp插入/缺失多态性位点，并将其与滩羊的生长性状(体重、体高、体长、胸围、胸深、胸宽、管围、十字部高共8个性状)进行关联分析，发现其可以作为滩羊分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明所建立的绵羊CHCHD7基因NC_040260.1:g36219994_3622000位8-bp插入/缺失多态性位点的检测方法，为利用indel实现绵羊体长和胸深性状的标记辅助选择(MAS)应用提供理论和实践依据。

以上内容仅仅是对本发明构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。