转运rna分子及其片段用于预防或治疗心脏疾病的用途

文档序号：1329647 发布日期：2020-07-17 浏览：38次 >En<

阅读说明：本技术 转运rna分子及其片段用于预防或治疗心脏疾病的用途 (Use of transport RNA molecules and fragments thereof for preventing or treating cardiac diseases ) 是由姜志宏胡姱严通萌于 2019-08-23 设计创作，主要内容包括：转运RNA分子及其片段对心脏疾病的治疗用途。本发明提供了一种分离自或源自人参属植物的转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段或其功能变体或同源物在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。本发明还提供了一种用于预防或治疗心脏疾病的药物组合物,其中,所述药物组合物包含治疗有效量的上述本发明所述的离自或源自人参属植物的转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段或其功能变体或同源物和药学上可接受的载体、病毒或辅料。本发明提供了一种预防或治疗患有心脏疾病的受试者的方法。本发明人发现源自人参属的转运RNA分子在治疗心脏疾病方面特别有效。所述转运RNA分子对缺血再灌注损伤的心肌细胞骨架也有恢复作用。(Therapeutic use of transport RNA molecules and fragments thereof for cardiac diseases. The present invention provides the use of a transport RNA molecule isolated or derived from a plant of the genus panax, a fragment derived from a transport RNA molecule, or a functional variant or homologue thereof, in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of a cardiac disease. The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating heart diseases, wherein the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of the transport RNA molecule, the fragment derived from the transport RNA molecule, or the functional variant or homologue thereof, of the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier, virus or adjuvant. The present invention provides a method of preventing or treating a subject having a cardiac disorder. The inventors have found that a transport RNA molecule derived from the genus panax is particularly effective in treating heart diseases. The transport RNA molecule also has a recovery effect on the myocardial cytoskeleton of the ischemia-reperfusion injury.)

转运RNA分子及其片段用于预防或治疗心脏疾病的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种分离自或源自人参属植物的转运RNA分子在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。本发明还提供了一种用于预防或治疗心脏疾病的药物组合。

背景技术

冠心病(CHD)已成为全球导致死亡的最常见疾病。目前已将中药(TCM)广泛用于治疗和预防冠心病，而大量的研究工作有助于研究分离的小分子如皂苷、萜类化合物、黄酮类化合物等在治疗冠心病中的有效性。例如已发现一些皂苷如人参皂苷具有抗心肌缺血的作用。然而，它们中的大多数通常对人体有较大的副作用。此外，诸如DNA、RNA和蛋白质的大分子通常被认为是不稳定的并且在人体中的效果差，因此在所述治疗中没有被广泛认可。

目前，一些研究表明，非编码RNA(non codingRNA)如微小RNA通过在几乎所有真核生物中靶向RNA转录或转录后过程的不同方面而具有不同的调节作用。Lin Zhang等人(Cell research 2012,22,107-126)提出，食物中的外源植物微小RNA可被哺乳动物的消化道吸收并通过血流输送到各个器官，从而调节哺乳动物基因的表达。Goodarzi,H.等人(Cell 2015,161(4),790-802)揭示源自内源性tRNA来源的片段(tRFs)可通过结合和拮抗与发病机制相关的RNA结合蛋白的活性来抑制乳腺癌细胞中多种致癌转录物的稳定性。然而，仍然需要从各种来源，如治疗用的植物中来获得有效分子。

人参(Panax ginseng C.A.Mey)是来自五加科(Araliaceae)的物种，广泛分布于中国和韩国的高山地区，被认为是最珍贵的草药。人参根须作为一味“益气补血”的传统中药已有几千年的历史，其中的主要成分人参皂苷和多糖对心肌缺血有显著的保护作用，但是它们的治疗用量较大，易对人体产生严重的毒副作用。

因此，当前对各种对人体无毒副作用的药物和治疗方法存在需求。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种分离自或源自人参属植物的转运RNA分子在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。具体地，本发明的目的是确定或发现分离自或源自人参属植物的转运RNA分子在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用，将其应用到这些心脏疾病的诊断和治疗中。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一方面，本发明提供了一种分离自或源自人参属植物的转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。

根据本发明所述的用途，其中所述人参属植物为人参(Panax ginseng C.A.Mey)、三七(Panax notoginseng(Burkill)F.H.Chen)或西洋参(Panax quinquefolius Linn)；优选地，所述人参属植物为人参。

优选地，所述转运RNA分子选自如SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:522中任一项所述的核苷酸序列；

或者，所述转运RNA分子来源的片段(tRFs)是双链RNA分子，其包含选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:232中任一项所述的正义序列或其功能变体或同源物，和互补反义序列；

优选地，所述转运RNA分子来源的片段(tRFs)是双链RNA分子，其包含选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:40中任一项所述的正义序列或其功能变体或同源物，和互补反义序列；

其中，所述SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232中任一项示的核苷酸序列的互补反义序列如SEQ ID NO:233至SEQ ID NO:464中任一项所示。

优选地，所述转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物还包含2聚体的3'悬突(overhang)；

优选地，所述转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物还包含3'胆固醇修饰；

优选地，所述转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物包含至少一种选自以下的修饰核苷：肌苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N⁶-甲基腺苷、N⁶-异戊烯基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N⁶-乙酰基腺苷、1-甲基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2-甲硫基-N⁶-甲基腺苷。

根据本发明所述的用途，所述心脏疾病选自心绞痛、心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心肌肥厚和心肌纤维化中的一种或多种。

具体地，本发明所述的RNA分子是非编码RNA分子，其序列长度为约50至200个核苷酸或约10至30个碱基对。

另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗心脏疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物包含有效剂量的上述本发明所述的分离自或源自人参属植物的转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物和药学上可接受的载体、病毒或辅料。

优选地，所述载体选自基因递送载体、壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。

优选地，所述转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物RNA分子以包含基因递送载体的组合物提供。

优选地，所述药物组合物的给药方式选自口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射。

根据本发明所述的组合物，其中所述人参属植物为人参(Panax ginsengC.A.Mey)、三七(Panax notoginseng(Burkill)F.H.Chen)或西洋参(Panax quinquefoliusLinn)；优选地，所述人参属植物为人参。

根据本发明所述的组合物，其中，所述转运RNA分子选自如SEQ ID NO:465至SEQID NO:522中任一项所述的核苷酸序列；

其中，所述SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232中任一项示的核苷酸序列的互补反义序列如SEQ ID NO:233至SEQ ID NO:464中任一项所示。

优选地，所述转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物还包含2聚体的3'悬突(overhang)；

优选地，所述转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物还包含3'胆固醇修饰；

根据本发明所述的组合物，所述心脏疾病选自心绞痛、心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心肌肥厚和心肌纤维化中的一种或多种。

具体地，本发明所述的RNA分子是非编码RNA分子，其序列长度为约50至200个核苷酸或约10至30个碱基对。

再一方面，本发明提供了一种预防或治疗患有心脏疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上述本发明的分离自或源自人参属植物的转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物的步骤。

具体地，所述方法包括使所述受试者的心肌细胞与上述分离自或源自人参属植物的有效量的转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物接触的步骤。

根据本发明所述的方法，其中所述人参属植物为人参(Panax ginseng C.A.Mey)、三七(Panax notoginseng(Burkill)F.H.Chen)或西洋参(Panax quinquefolius Linn)；优选地，所述人参属植物为人参。

优选地，所述转运RNA分子选自如SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:522中任一项所述的核苷酸序列；

其中，所述SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232中任一项示的核苷酸序列的互补反义序列如SEQ ID NO:233至SEQ ID NO:464中任一项所示。

优选地，所述转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物还包含2聚体的3'悬突(overhang)；

优选地，所述转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物还包含3'胆固醇修饰；

根据本发明所述的方法，所述心脏疾病选自心绞痛、心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心肌肥厚和心肌纤维化中的一种或多种。

具体地，本发明所述的RNA分子是非编码RNA分子，其序列长度为约50至200个核苷酸或约10至30个碱基对。

另一方面，本发明涉及包含本发明所述的双链RNA分子的重组载体，其中所述双链RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232中任一项所述的正义序列或其功能变体或同源物，和互补反义序列；

优选地，所述双链RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:40中任一项所述的正义序列或其功能变体或同源物，和互补反义序列；

优选地，所述双链RNA分子还包含2聚体的3'悬突(overhang)；

优选地，所述双链RNA分子还包含3'胆固醇修饰；

优选地，所述双链RNA分子包含至少一种选自以下的修饰核苷：肌苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N⁶-甲基腺苷、N⁶-异戊烯基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N⁶-乙酰基腺苷、1-甲基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2-甲硫基-N⁶-甲基腺苷。

再另一方面，本发明提供了本发明的转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物、药物组合物和重组载体在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途；

本发明通过施用分离自或源自人参属植物的RNA分子，或特别是包含选自SEQ IDNO:1至232的序列的双链RNA分子，提供了治疗心脏疾病的新颖且有效的方法。所述RNA分子的施用也适用于促进心肌细胞的生长和增殖作用。

本发明人发现从人参属植物中分离的非编码RNA分子，特别是转运RNA分子，和源自人参属(Panax)的RNA分子在治疗心脏疾病方面特别有效。序列长度为约10至200个核苷酸的RNA分子在体外促进心肌细胞的生长和增殖方面非常有效。所述RNA分子对缺血再灌注损伤的心肌细胞骨架也有恢复作用。

本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本文描述的发明易于进行变化和修改。本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤和特征，以及步骤或特征的任何和所有组合。

通过考虑以下详细描述和附图，本发明的其他特征和方面将变得显而易见。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示根据本发明的一个示例性实施方案，来自人参(Panax ginseng C.A.Mey)的RNA分子的凝胶电泳谱，包括小RNA标准对照品(表示为“L”)、小RNA组分(表示为“S”)和转运RNA组分(表示为“T”)和转运RNA单体tRNA^Gly(GCC)、tRNA^His(GUG)、tRNA^Met(CAU)(分别表示为“Gly、His、Met”)。

图2显示根据本发明的一个示例性实施方案，来自人参(Panax ginseng C.A.Mey)的转运RNA的读取长度分布的条形图。

图3A显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧组(H)相比，来自人参的300nMRNA分子tRNA^Gly(GCC)、tRNA^His(GUG)、tRNA^Met(CAU)、tRNA^Leu(CAA)对H9C2细胞系的细胞增殖的条形图(平均值±SD，n＝2；****,p<0.0001vs.相对于缺氧组(H)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图3B显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，来自人参的50nMRNA分子tRNA^Gly(GCC)、tRNA^His(GUG)、tRNA^Met(CAU)、tRNA^Leu(CAA)对H9C2细胞系的细胞增殖的条形图(平均值±SD，n＝3；*,p<0.05相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图4A显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即100nM、50nM、25nM、12.5nM的RNA分子tRNA^His(GUG)处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；**,p<0.01,***,p<0.001,****,p<0.0001相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图4B显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即100nM、50nM、25nM、12.5nM的RNA分子tRNA^Gly(GCC)处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；*,p<0.05,**,p<0.01,****,p<0.0001相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图4C显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即100μM、25μM、6.25μM、1.56μM的RNA分子人参皂苷Rg1处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；****,p<0.0001相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图5A显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用源自人参的序列长度为22bp的不同的转运RNA分子(如表2所列)以300nM的剂量处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝6；*,p<0.05,相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图5B显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用源自人参的序列长度为19bp的不同的转运RNA(如表2所列)分子以300nM的剂量处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝6；*,p<0.05,相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图6A显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即900nM、300nM、30nM、3nM、0.3nM的RNA分子HC50处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；*,p<0.05,****,p<0.0001相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图6B显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即900nM、300nM、30nM、3nM、0.3nM的RNA分子HC83处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；**,p<0.01,****,p<0.0001相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图7A显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即300nM、100nM、30nM、3nM的RNA分子HC50处理后，H9C2细胞的线粒体活力的条形图(平均值±SD n＝3；*,p<0.05相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图7B显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即300nM、100nM、30nM、3nM的RNA分子HC83处理后，H9C2细胞的线粒体活力的条形图(平均值±SD n＝3；***,p<0.001相对于缺氧复氧组(H/R)；####,p<0.0001相对于正常组(Control))。

图8A显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即900nM、300nM、100nM、10nM、30nM、3nM、0.3nM的RNA分子HC50处理后，H9C2细胞的细胞骨架成像图。

图8B显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即900nM、300nM、100nM、10nM、30nM、3nM、0.3nM的RNA分子HC83处理后，H9C2细胞的细胞骨架成像图。

图9A显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即900nM、300nM、30nM、3nM、0.3nM的胆固醇修饰的RNA分子cholesterol-conjugated HC50处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；*、p<0.05、****、p<0.0001相对于缺氧复氧组(H/R)；####、p<0.0001相对于正常组(Control))。

图9B显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即900nM、300nM、30nM、3nM、0.3nM的胆固醇修饰的RNA分子cholesterol-conjugated HC83处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；*、p<0.05、***、p<0.001、****、p<0.0001相对于缺氧复氧组(H/R)；####、p<0.0001相对于正常组(Control))。

图10A显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即900nM、300nM、100nM、30nM、10nM、3nM的胆固醇修饰的RNA分子cholesterol-conjugated HC50处理后，H9C2细胞的细胞骨架成像图。

图10B显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组(H/R)相比，在使用不同浓度，即900nM、300nM、100nM、30nM、10nM、3nM的胆固醇修饰的RNA分子cholesterol-conjugated HC83处理后，H9C2细胞的细胞骨架成像图。

图11A显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组+DharmaFECT4(H/R+DharmaFECT4)相比，在使用不同浓度，即300nM、100nM、30nM的RNA分子HC50处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；**、p<0.01相对于载体对照组；####、p<0.0001相对于正常组)。

图11B显示根据本发明的一个示例性实施方案，与正常组(Control)和缺氧复氧组+DharmaFECT4(H/R+DharmaFECT4)相比，在使用不同浓度，即300nM、100nM、30nM的RNA分子HC83处理后，H9C2细胞的细胞活力的条形图(平均值±SD n＝3；*、p<0.05相对于载体对照组；####、p<0.0001相对于正常组)。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。

如本文所使用，“包含”意指包括以下要素但不排除其他要素。“基本上由......组成”是指材料由相应的元素以及通常和不可避免的杂质组成，例如，通常由用于获得材料的相应的制备或方法产生的副产物和组分，例如痕量的另外的组分或溶剂。“由......组成”是指材料仅由相应元素组成，即由相应元素形成。如本文所使用，形式“一(a)”、“一(an)”和“该”旨在包括单数和复数形式，除非上下文另有明确说明。

本发明的第一方面提供了一种分离自或源自人参属植物的转运RNA分子、转运RNA分子来源的片段(tRFs)或其功能变体或同源物在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。根据本发明的RNA分子可以根据本发明公开的序列天然存在、修饰或人工合成，并且优选地，RNA分子分离自或源自人参属植物。本发明的RNA分子不是以从植物中获得的煮沸提取物，例如煎煮液的形式提供的，因为可以理解，RNA分子在高温、碱性pH和核酸酶或二价金属离子的存在下易于自发降解。

本发明的RNA分子的序列长度为约10至200个核苷酸，其可被视为小RNA分子。优选地，RNA分子的序列长度为约50至约200个核苷酸，约60至约150个核苷酸，特别是约70至约100个核苷酸。

本发明的RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的序列或其功能变体或同源物。术语RNA分子的“功能变体”是指与所述RNA分子基本相似的分子，其具有一个或多个不影响所述RNA分子的生物活性或功能的序列改变。不影响得到的RNA分子的功能特性的序列改变是本领域熟知的。例如，预期导致分子的-5’-末端和-3’-末端部分改变的核苷酸变化不会改变多核苷酸的活性。在一个实施方案中，本发明的RNA分子包含至少一种选自以下的修饰核苷：肌苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N⁶-甲基腺苷、N⁶-异戊烯基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N⁶-乙酰基腺苷、1-甲基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2-甲硫基-N⁶-甲基腺苷。

特别地，RNA分子的功能变体与根据本发明的非变体RNA分子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的总体序列同一性。

本文使用的术语“同源物”是指与根据本发明的RNA分子具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性的核苷酸。在一个实施方案中，RNA分子的同源物与所述RNA分子具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的总体序列同一性。

在一个实施方案中，RNA分子是非编码分子，优选地选自转运RNA分子、微小RNA分子、siRNA分子，更优选的是转运RNA分子。tRNA分子是高度保守的RNA，其在各种细胞过程中起作用，例如逆转录、卟啉生物合成等。在一个具体实施方案中，本发明的RNA分子包含选自SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:522的序列或其功能变体或同源物；或RNA分子包含SEQ IDNO:465至SEQ ID NO:468或其功能变体或同源物；或RNA分子由选自SEQ ID NO:465至SEQID NO:522或SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:468的序列或其功能变体或同源物组成。

在供选择的实施方案中，RNA分子是小RNA分子，其序列长度为约10至约30个碱基对，约15至约25个碱基对，约19至约22个碱基对，19个碱基对或22个碱基对。RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的序列或其功能变体或同源物，特别是SEQ ID NO:1至SEQID NO:40的序列或其功能变体或同源物；或由选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的序列，特别是SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:40的序列或其功能变体或同源物组成。

优选地，RNA分子是双链RNA分子，其具有选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的正义序列或其功能变体或同源物，和互补反义序列。

反义序列与正义序列互补，因此反义序列优选选自SEQ ID NO:233至464或其功能变体或同源物。在具体实施方案中，本发明的双链RNA分子具有选自SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:40的正义序列或其功能变体或同源物，以及选自SEQ ID NO:233至SEQ ID NO:272的互补反义序列或其功能变体或同源物。本发明人意外地发现，本发明的双链RNA分子在治疗心脏疾病，如下文详细描述中冠心病中的是特别有用的。

本发明的RNA分子优选分离自或源自人参属植物。人参属植物包括但不限于人参(Panax ginseng C.A.Mey)、西洋参(Panax quinquefolius Linn)、三七(Panaxnotoginseng(Burkill)F.H.Chen)、假人参(Panax pseudoginseng Wall)、姜状三七(Panaxzingiberensis C.Y.Wu et K.M.Feng)。人参属植物可以是人参皂苷Rg1的来源。在一个实施方案中，RNA分子分离自或源自人参(Panax ginseng C.A.Mey)。

更详细地，本发明的RNA分子分离自或源自人参属的不同器官包括但不限于根、茎、叶和果实。在一个实施方案中，RNA分子分离自或源自人参(Panax ginseng C.A.Mey)的根。

更详细地，本发明的RNA分子的优选序列列于下表1和2中。在一个实施方案中，如表1中所示的SEQ ID NO:465至522的RNA分子分离自人参属的植物，特别是人参(Panaxginseng C.A.Mey)。这些序列通过植物的提取、RNA分离和纯化获得。发明人确定这些RNA分子与叶绿体，胞浆和线粒体有关。在实施例1中说明了从特定植物人参(Panax ginsengC.A.Mey)获得RNA分子的一种可能的方法。应当理解，可以应用根据本文公开内容获得本发明的分离和纯化的RNA分子的其他合适方法，并且在不脱离本发明范围的情况下，可以对所述方法进行适当改变以获得改善的RNA分子产率。

表1.根据本发明，从人参(Panax ginseng C.A.Mey)分离的RNA分子，特别是tRNA。

如表2中所示的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的正义序列和SEQ ID NO:233至SEQID NO:464的反义序列是根据本发明人工合成的。特别地，这些序列是根据表1的从人参分离的序列制备的片段。所述片段分为以下三类：第一类为5'-tRFs，即包括成熟tRNA序列的5'末端，在D环、D环臂、反密码子环或反密码子环臂切断而形成的长度为2-35个核苷酸的片段；第二类为3'-tRFs，即包括成熟tRNA序列的3'-CCA末端，在T环、T环臂、反密码子环或反密码子环臂切断而形成的长度为2-35个核苷酸的片段第三类为反密码子-tRFs，即在成熟tRNA序列的反密码子环或反密码子环臂切断而形成的长度为2-24个核苷酸的片段。例如从tRNA^His(GUG)得到的tRF包括22个核苷酸长度的5'-tRFs“GCGGAUGUAGCCAAGUGGAUCA”，22个核苷酸长度的3'-tRFs“UCAAUUCCCGUCGUUCGCCCCA”，19个核苷酸长度的5'-tRFs“GCGGAUGUAGCCAAGUGGA”，19个核苷酸长度的3'-tRFs“AUUCCCGUCGUUCGCCCCA”，以及17个核苷酸长度的反密码子-tRFs“GUGGAUUGUGAAUCCAC”。

每条正义序列与相应的反义序列一起形成双链RNA分子。如表2所示，SEQ ID NO:1的正义序列和SEQ ID NO:233的反义序列形成长度为22个碱基对的双链RNA分子，并且得到的RNA分子表示为HC70以便于参考。类似地，SEQ ID NO:2的正义序列和SEQ ID NO:234的反义序列形成长度为19个碱基对的双链RNA分子，并且所得的RNA分子表示为HC50。表中列出了本发明的其他RNA分子。

双链RNA分子分为2组，即5’-末端组(5’-t)和3’-末端组(3’-t)。5’-t组RNA分子含有从植物中分离的相应全长RNA分子的5’末端部分；并且3’-t组RNA分子含有从植物中分离的相应全长RNA分子的3’末端部分。

在另一个实施方案中，RNA分子可以包含从植物分离的相应全长RNA分子的反密码子环部分，并称为反密码子组RNA分子。SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的正义序列可以通过在全长RNA分子SEQ ID NO:465至522上的不同位点处切割来生成。

此外，本发明的RNA分子可以包含3'悬突(overhang)，优选包含2个核苷酸的3'悬突(overhang)。提供3’悬突(overhang)改善了RNA分子的稳定性。

表2.根据本发明通过人工合成由表1中的序列来源的RNA分子。

本发明人意外地发现了分离自或源自人参属植物，特别是人参(Panax ginsengC.A.Mey)的RNA分子有效保护心肌细胞，特别是它们能够促进心肌细胞的生长和增殖。

转回到治疗方法，该方法包括向患有心脏疾病的受试者施用有效量的如上所述的RNA分子的步骤。在一个实施方案中，向受试者施用RNA分子的步骤包括使受试者的心肌细胞与RNA分子接触。

术语“心脏疾病”描述了受试者的生理病症，其特征在于心脏冠状动脉变窄，以至于到达心脏的血流和氧气变少。在一个实施方案中，待治疗的冠心病是动脉粥样硬化、心绞痛、心肌梗死等。在具体实施方案中，冠心病是心肌梗死。因此，本发明的方法可以应用于治疗患有心脏疾病和相关并发症的受试者。

本文使用的术语“受试者”是指活生物体，并且可以包括但不限于人和动物。受试者优选是哺乳动物，优选人。RNA分子可以通过注射向受试者，优选人施用。术语注射包括静脉内、肌肉内、皮下和皮内施用。在一个实施方案中，通过静脉内注射将本发明的RNA分子与合适的赋形剂(多种赋形剂)一起施用于受试者。例如，RNA分子可以通过转染、电穿孔或病毒介导的递送递送至受试者或细胞。

表述“有效量”通常表示足以产生治疗上期望的结果的量，其中结果的确切性质根据所治疗的具体病症而变化。在本发明中，冠心病是待治疗的病症，因此结果通常是促进(promotion)或保护(protection)心肌细胞的生长和增殖或保护心肌细胞或改善与冠心病相关的症状。在心肌缺血再灌注的实施方案中，结果通常是促进心肌细胞的生长和增殖，恢复受损心肌的细胞骨架或改善与冠心病有关的症状。

本发明的RNA分子可以以包含RNA分子和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的形式施用。药学上可接受的赋形剂可以是稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、表面活性剂、基因递送载体和防腐剂中的一种或多种。药物组合物可以以固体、半固体或液体形式存在，优选以液体形式存在。药物制剂可以为脂质体冻干粉；多肽纳米冻干粉；喷雾剂；片剂。药物组合物可包含另外的药物有效成分，例如用于治疗冠心病的治疗化合物，例如人参皂苷Rg1。技术人员能够根据药物组合物的形式选择合适的药学上可接受的赋形剂，并且知道制备药物组合物的方法，以及能够根据药学上可接受的赋形剂的种类和药物组合物的形式选择合适的制备药物组合物的方法。

在一个实施方案中，RNA分子在包含基因递送载体的药物组合物中提供。基因递送载体是指可以充当将基因递送到细胞中的载体的任何分子。在RNA分子被转染到细胞中的实施方案中，基因递送载体被认为是转染剂。在其中通过重组病毒载体递送RNA分子的实施方案中，基因递送载体是携带本发明的双链RNA分子的病毒载体。基因递送载体包括但不限于载体如病毒载体，胶原如去端肽胶原，聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)，多肽如聚(L-赖氨酸)和鱼精蛋白，和用于形成脂质体的脂质，例如Lipofectamine。基因递送载体可以是商购的，例如来自美国Thermo Fisher的LipofectamineRNAiMAX转染试剂、Lipofectamine3000、2000转染试剂和Dharmacon的DharmaFECT系列的转染试剂；来自中国GenePharma的RNAi-Mate；来自日本Koken Co.、Ltd.的去端肽胶原；和来自中国siRNAomics的组氨酸-赖氨酸肽共聚物。基因递送载体可以是基于逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒和慢病毒的病毒载体。基因递送载体应具有低毒性并且不能在受试者中诱导显著的免疫应答。在一个实施方案中，药物组合物还可以包含核酸稳定剂。核酸稳定剂是指能够维持组合物中RNA分子的稳定性以最小化或避免降解的任何化学品，特别是那些能够使核酸酶等降解RNA分子的活性失活的化学品。

因此，本发明还涉及如上所述的药物组合物，特别是包含RNA分子和如上定义的药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，RNA分子包含至少一条选自SEQ IDNO:1至232的序列或其功能变体或同源物。

优选地，RNA分子分离自或源自如上所述的人参属植物，特别是分离自或源自人参(Panax ginseng C.A.Mey)。

本发明的RNA分子也适用于促进心肌细胞的生长和增殖。在本发明的另一个方面，提供了心肌细胞的生长和增殖的方法，包括使所述细胞与有效量的如上定义的RNA分子接触的步骤。优选地，RNA分子分离自或源自人参属植物，或者包含选自SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:232的序列或其功能变体或同源物。

在一个实施方案中，RNA分子具有约50至200个核苷酸的序列长度，更优选具有约60至约150个核苷酸，特别是约70至约100个核苷酸的长度。RNA分子是非编码分子，优选为转运RNA分子。优选地，RNA分子包含选自SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:522的序列或其功能变体或同源物；或RNA分子包含SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:468或其功能变体或同源物；或RNA分子由选自SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:522或SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:468的序列或其功能变体或同源物组成。

在供选择的实施方案中，RNA分子的序列长度为约10至约30个碱基对，约15至约25个碱基对，约19至约22个碱基对，19个碱基对或22个碱基对。优选地，RNA分子是双链RNA分子，其包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的正义序列或其功能变体或同源物，特别是SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:40或其功能变体或同源物；或由选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的序列，特别是SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:40或其功能变体或同源物组成。双链RNA分子包含互补反义序列。RNA分子还可以包含2聚体的3’悬突(overhang)。

使心肌细胞与本发明的RNA分子接触的步骤可以通过将组合物，特别是包含RNA分子的孵育溶液施加到所述心肌细胞来进行，所述孵育溶液还可以包含如上定义的合适的赋形剂、缓冲液或合适的生长培养基。在本发明的这种实施方案中，心肌细胞取自受试者，例如动物或人，特别是人。RNA分子在组合物中以至少0.3nM、至少3nM、约0.3nM至约900nM、约10nM至约100nM或约50nM至约300nM的浓度提供。此外，赋形剂可包括基因递送载体，例如但不限于基于胶原的载体或脂质体形成剂。

除上述之外，本发明涉及如上所述的双链RNA分子，即包含选自SEQ ID NO:1至SEQID NO:232的正义序列或其功能变体或同源物，和互补反义序列。特别地，双链RNA分子由以下组成:选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的正义序列或其功能变体或同源物，选自SEQID NO:233至SEQ ID NO:464的互补反义序列，和任选的3’悬突(overhang)。双链RNA分子的示例性实施方案示于表2中。双链RNA可以进行修饰，因此可以携带至少一种选自以下的修饰核苷:肌苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N⁶-甲基腺苷、N⁶-异戊烯基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N⁶-乙酰基腺苷、1-甲基肌苷、假尿苷、二氢尿苷或2-甲硫基-N⁶-甲基腺苷。

在本发明的另一方面，提供了包含核酸分子的载体，其中所述核酸分子是如上所述的RNA分子。特别地，RNA分子具有选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的序列或其功能变体或同源物。在一个实施方案中，载体是包含如上所述的双链RNA分子的重组载体。载体可以是源自逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的基于病毒的载体。本领域普通技术人员将理解将本发明的RNA分子掺入载体的合适方法。

更进一步地，本发明涉及核酸分子在制备用于治疗冠心病的药物中的用途。核酸是如上所述的RNA分子，包括其功能变体或同源物。还应理解，本发明的RNA分子可用作小干扰RNA分子以干扰靶标心肌细胞中特定基因的表达，从而引起基因沉默、抑制细胞凋亡和损伤等以达到期望的治疗效果。

因此，本发明提供了一种通过施用分离自或源人参属植物的RNA分子，特别是包含选自SEQ ID NO:1至232的序列的RNA分子，来治疗各种冠心病的新颖且有效的方法。施用所述RNA分子也适用于促进心肌细胞的生长和增殖。发现RNA分子在体外促进心肌细胞的生长和增殖方面非常有效。

现在以以下非限制性实施例描述本发明。

实施例

化学品和材料

2017年从中国吉林省抚松镇收集人参(Panax ginseng C.A.Mey)的新鲜根。西曲溴铵(CTAB)和氯化钠购自Kingdin Industrial Co.、Ltd.(中国香港)。水饱和酚购自Leagene Co.、Ltd.(中国北京)。氯仿和乙醇购自Anaqua Chemicals Supply Inc.Ltd.(美国)。异戊醇和硫氰酸胍购自Tokyo Chemical Industry CO.、Ltd.(日本)。Tris-HCl和乙二胺四乙酸(EDTA)购自Acros Organic(s美国)，小ssRNA Ladder购自New England Biolab(sBeverly、MA，美国)。TRIzol^@Reagent，mirVana^TM miRNA分离试剂盒、SYBR金核酸凝胶染色剂和凝胶上样缓冲液II购自Thermo Fisher Scientific(美国)。40％丙烯酰胺/bis溶液(19:1)、tris/硼酸盐/EDTA(TBE)、过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)购自BioradLaboratories Inc.(美国)。大鼠心肌细胞系(H9C2)购自ATCC(Manassas，Virginia，美国)。Opti-MEM I低血清培养基、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、无糖Dulbecco改良Eagle培养基(无糖DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素购自Gibco(Life Technologies、Auckland、新西兰)。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)和DAPI细胞核染料购自Sigma(St.Louis、MO、美国)。线粒体活力染料购自Abcam(剑桥，英格兰)，Rhodamine Phalloidin细胞骨架染料购自Cytoskeleton、lnc.(Denver、美国)。

实施例1从人参属植物中分离RNA分子

新鲜收集人参(Panax ginseng C.A.Mey)的根，并立即储存在液氮中直至使用。通过使用PARI(polysaccharase-aidedRNAisolation)的方法，从人参(Panax ginsengC.A.Mey)中提取长度为200个核苷酸或更低的RNA，即小RNA种类，该方法由本发明人及其实验室人员首次描述。简言之，将植物组织在液氮中研磨成细粉，然后使用数字分散装置(IKA，德国)在TRIzol试剂中均质化。在室温彻底裂解10分钟后，加入等体积的氯仿，然后在4℃以12,000×g离心15分钟。收集上清并加入1/25体积的氯化钠和1.25倍体积的冷乙醇，在-20℃下共沉淀30分钟。收集沉淀用多糖酶水解直至沉淀完全溶解，加入2X的CTAB缓冲液，并用等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(50:48:1)通过剧烈涡旋振荡萃取。通过以12,000×g离心15分钟在4℃下分离各相，并如上所述用氯仿:异戊醇(24:1)再次提取上清液。收集上清液并与等体积的6M硫氰酸胍混合，接着添加100％乙醇至终浓度为55％。使混合物通过含有二氧化硅膜的滤筒，其使RNA固定。然后用80％(v/v)乙醇溶液洗涤滤器数次，最后用低离子强度溶液或无RNA酶的水洗脱所有RNA。按照制造商的说明，使用mirVana^TM miRNA分离试剂盒分离和富集小RNA种类。

此外，通过在根据制造商的方案(Biorad，美国)制备的含有8M尿素的6％聚丙烯酰胺TBE凝胶中进行电泳，来分离的小RNA种类中的总tRNA。用SYBR金核酸凝胶染色剂染色后，使用UV灯检查聚丙烯酰胺凝胶，并使用干净且锋利的手术刀切下含有总tRNA的凝胶区域。图1显示来自人参(Panax ginseng C.A.Mey)的小RNA物质的凝胶电泳谱，包括小RNA标准对照品(表示为“L”)、小RNA组分(表示为“S”)和转运RNA单体(tRNA^Gly(GCC)、tRNA^His(GUG)、tRNA^Met ^(CAU))。将条带切成小块，通过在3kD分子量截留透析管(Spectrum、C.A.)中在100V下在1XTAE缓冲液中电洗脱50分钟，从凝胶中回收总tRNA。回收透析管中的洗脱液，并使用mirVana^TMmiRNA分离试剂盒对总tRNA进行脱盐和浓缩。然后使用Nanodrop分光光度计(Thermo Scientific，美国)和Agilent2100生物分析仪(Agilent，美国)确证RNA产物的质量和纯度。

然后，发明人构建了总tRNA文库并进行了测序。通过使用TruSeq小RNA文库制备试剂盒(Illumina，美国)，然后进行一轮接头连接、逆转录和PCR富集来产生测序文库。然后纯化PCR产物，并在Agilent生物分析仪2100系统(Agilent Technologies，美国)上定量文库。使用150bp配对末端(PE150)策略在Illumina HiSeq平台上在Novogene BioinformaticsInstitute(北京，中国)对文库制备物进行测序，以产生超过1500万个原始配对读数。通过去除低质量区域和接头序列获得5,772,569个净读数。图2是显示tRNA的读取长度分布的条形图。通过使用tRNAscan-SE2.0程序(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)确定tRNA基因，并使用基本局部比对搜索工具(BLAST)程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，通过搜索核苷酸集合(nr/nt)数据库进行注释。确定了26个来自人参(Panaxginseng C.A.Mey)的tRNA序列并列于表1中。

然后通过用特异性生物素化的捕获DNA探针将靶tRNA固定在链霉亲和素包被的磁珠上，从来自人参(Panaxginseng C.A.Mey)的小RNA(<200聚体)的混合物中分离每种tRNA。为了结合特异性tRNA分子，合成了相应的单链DNA寡核苷酸(20至45聚体)，其基于Illumina测序的序列信息设计并且应当与靶tRNA的独特区段互补。将同源DNA探针与小RNA混合物在退火缓冲液中孵育约1.5小时，并使其在适当的退火温度下与溶液中的靶tRNA分子杂交，所述退火温度通常比解链温度(Tm)低5℃。然后20将链霉亲和素包被的磁珠加入混合物中并在退火温度下孵育30分钟。在通过链霉亲和素-生物素键将杂交序列固定到磁珠上后，用磁铁分离生物素化的DNA/tRNA包被的珠子1-2分钟，并在40℃的洗涤缓冲液中洗涤3-4次。将磁珠在不含RNA酶的水中重悬浮至期望浓度，从而通过在70℃下孵育5分钟来释放固定的tRNA分子。因此，获得了SEQ ID NO:465至522的分离和纯化的tRNA分子。

实施例2 RNA分子的合成

本发明人基于实施例1中的58个分离的tRNA序列设计并合成了长度为约19至22bp的RNA分子。特别地，认为tRNA序列具有至少3个部分，即5’-末端部分(5’-t)、3’-末端部分(3’-t)和反密码子部分。每种特别设计的RNA分子含有任何一个部分。例如，设计的含有相应全长tRNA序列的5’末端部分的RNA分子称为5’-t组RNA分子；设计的含有相应全长tRNA序列的3’末端部分的RNA分子称为3’-t组RNA分子；设计的含有相应全长tRNA序列的反密码子部分的RNA分子称为反密码子组RNA分子。如表2所示，具有选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:232的正义序列和选自SEQ ID NO:233至SEQ ID NO:464的互补反义序列的RNA分子通过在表1中的tRNA序列上的不同位点切割来设计和合成。

实施例3 RNA分子对心肌细胞的保护作用

大鼠心肌H9C2细胞系在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中，并在含有5％CO₂的潮湿气氛的37℃培养箱中培养。

在细胞活性分析中，将心肌细胞H9C2的指数生长细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔微板中的100μL培养基中，并在处理前使之粘附24小时。对于心肌细胞缺氧模型，将实施例1中获得的连续浓度的RNA分子添加至H9C2细胞中，置于KRB缓冲液(氯化钠115mM、氯化钾4.7mM，氯化钙2.5mM，磷酸二氢钾1.2mM，硫酸镁1.2mM，碳酸氢钠24mM，HEPES缓冲液10mM，pH7.4)，在无氧容器(Stem Cell Technologies、美国)中37℃培养3个小时。在心肌细胞缺氧复氧模型中，将H9C2细胞置于无糖DMEM培养基，在94.9％N₂/5％CO₂/0.1％O₂的缺氧工作站(whitley H35hypoxystation、Don Whitley Scientific Ltd.、英格兰)培养12个小时后，将实施例1和2中获得的连续浓度的RNA分子添加至细胞中，再于含有5％CO₂的潮湿气氛的37℃培养箱中复氧培养6个小时。缺氧培养或缺氧复氧培养后，细胞活力测定实验则向各孔中添加MTT溶液(每孔100μL，0.5mg/mL溶液)并在37℃下孵育4小时。随后，添加150μL二甲基亚砜(DMSO)，并使用SpectraMax190酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，美国)在570nm下量热法测定所得溶液的光密度。在线粒体活力测定实验中，则按照说明书加入线粒体活力染料，使用Spectra Max190酶标仪在Ex.550nm/Em.590nm下测定所得溶液的荧光强度。所有测得数值通过GraphPad Prism6(GraphPad，LaJolla，CA，美国)获得剂量-反应曲线。每个实验进行三次。结果表示为平均值±标准偏差。

参考图3A，在添加MTT溶液之前，用tRNA^Gly(GCC)、tRNA^His(GUG)、tRNA^Met(CAU)和tRNA^Leu ^(CAA)的300nMRNA分子，即SEQ ID NO:465至468的RNA分子经过缺氧培养。将这些细胞的细胞活力与正常组和缺氧组进行比较。结果表明，这些tRNA^Gly(GCC)、tRNA^Met(CAU)和tRNA^Leu(CAA)分子能够促进心肌细胞生长和增殖，表明这些RNA分子能够保护心肌细胞对抗缺氧损伤。

参考图3B，在添加MTT溶液之前，用tRNA^Gly(GCC)、tRNA^His(GUG)、tRNA^Met(CAU)和tRNA^Leu ^(CAA)的50nMRNA分子，即SEQ ID NO:465至468的RNA分子经过缺氧复氧培养。将这些细胞的细胞活力与正常组和缺氧复氧组进行比较。结果表明，这些tRNA^Gly(GCC)、tRNA^His(GUG)分子能够促进心肌细胞生长和增殖，表明这些RNA分子能够保护心肌细胞对抗缺氧复氧损伤。

图4A显示tRNA^His(GUG)，即SEQ ID NO:465对H9C2细胞的保护作用。使用不同浓度的tRNA^His(GUG)，即100nM、50nM、25nM、和12.5nM，并与正常组和缺氧复氧组比较。显示tRNA^His ^(GUG)对H9C2细胞的保护作用呈现明显的剂量依赖性。

图4B显示tRNA^Gly(GCC)，即SEQ ID NO:466对H9C2细胞的保护作用。使用不同浓度的tRNA^Gly(GCC)，即100nM、50nM、25nM、和12.5nM，并与正常组和缺氧复氧组比较。显示tRNA^Gly ^(GCC)对H9C2细胞的保护作用呈现明显的剂量依赖性。

使用人参皂苷Rg1实施比较例，结果如图4C所示。

图5A和图5B显示实施例2中合成的RNA分子特别是具有SEQ ID NO:1至40的正义序列对H9C2细胞的保护作用。结果显示，在该实施例中，基于实施例1中确定的tRNA序列设计和合成的RNA分子HC50、HC83在促进心肌细胞生长和增殖方面也是有效的。

然后，本发明人特别确定了RNA分子HC50和HC83在不同浓度下，即在900nM、300nM、30nM、3nM和0.3nM下对H9C2细胞的保护作用和量效关系。如图6A、图6B、图7A、图7B所示，将结果与正常组和缺氧复氧组进行比较。结果表明，RNA分子HC50和HC83对促进心肌细胞的生长和增殖具有剂量依赖性作用。

实施例4 RNA分子对心肌细胞骨架的保护作用

大鼠心肌H9C2细胞系在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中，并在含有5％CO₂的潮湿气氛的37℃培养箱中培养。将心肌细胞H9C2的指数生长细胞以每孔10000个细胞的密度接种在μ-slide8孔板(Ibidi GmbH、德国)中的200μL培养基中，并在处理前使之粘附24小时。在实施例3的缺氧复氧条件下培养后，细胞用Rhodamine Phalloidin细胞骨架染料和DAPI细胞核染料处理后，在Leica TCSSP8共聚焦显微镜20x倍镜下获取细胞骨架成像。

本发明人特别确定了RNA分子HC50和HC83在不同浓度下，即在900nM、300nM、100nM、30nM、10nM、3nM和0.3nM下对H9C2细胞骨架的保护作用和量效关系。如图8A至图8B所示，将结果与正常组和缺氧复氧组进行比较。结果表明，RNA分子HC50和HC83对恢复缺氧复氧损伤的心肌细胞骨架具有显著的作用和剂量依赖性作用。

进一步地，本发明人确定了胆固醇修饰的RNA分子HC50和HC83在不同浓度下，即在900nM、300nM、30nM、3nM和0.3nM下对H9C2细胞的保护作用和量效关系。如图9A至9B所示，将结果与正常组和缺氧复氧组进行比较。结果表明，胆固醇修饰的RNA分子HC50和HC83对促进心肌细胞的生长和增殖具有剂量依赖性作用。发明人还确定了胆固醇修饰的RNA分子HC50和HC83在不同浓度下，即在900nM、300nM、100nM、30nM、10nM、3nM和0.3nM下对H9C2细胞骨架的保护作用和量效关系。如图10A至图10B所示，将结果与正常组和缺氧复氧组进行比较。结果表明，胆固醇修饰的RNA分子HC50和HC83对恢复缺氧复氧损伤的心肌细胞骨架具有显著的作用和剂量依赖性作用。

发明人进一步使用了正常组(Control)和缺氧复氧组+DharmaFECT4(H/R+DharmaFECT4)进行比较，结果如图11A和11B所示，其中RNA分子HC50和HC83对促进心肌细胞的生长和增殖具有剂量依赖性作用。

基于上述结果，发现分离自或源自人参(Panaxginseng C.A.Mey)的小tRNA分子在体外保护心肌细胞方面非常有效。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 澳门科技大学

<120> 转运RNA分子及其片段用于预防或治疗心脏疾病的用途

<130> DIC19110055

<160> 522

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA