阅读说明：本技术 宫颈癌干细胞特异性透膜肽和干扰RabJ基因的组合物的抑癌用途 (Cancer inhibition application of composition of cervical cancer stem cell specific membrane penetrating peptide and interference RabJ gene ) 是由 王阳 曹帅 于 2020-05-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及宫颈癌干细胞特异性透膜肽和干扰RabJ基因的组合物的抑癌用途,该组合物可以有效地抑制内源性RabJ基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长。(The invention relates to a cancer suppressor application of a composition of cervical cancer stem cell specific membrane-penetrating peptide and interference RabJ gene, which can effectively suppress the expression of endogenous RabJ gene so as to suppress the growth of tumor cells.)

宫颈癌干细胞特异性透膜肽和干扰RabJ基因的组合物的抑癌 用途

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及一种宫颈癌干细胞特异性透膜肽和干扰RabJ基因的组合物的抑癌用途。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(HIV-1)转录蛋白的反式激活因子是最早被发现能够穿过细胞膜的因子，Derossi,D.等发现果蝇触角转录因子蛋白也能够穿过细胞膜进入细胞。随后人们发现TAT蛋白中较短的一段碱性氨基酸区域，氨基酸残基在47-57的11个氨基酸短肽TAT(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)发挥透膜作用，而果蝇触角转录因子蛋白中的第三螺旋同源区域的16个氨基酸区域发挥透膜活性，后来被命名为penetratin(Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys)。以TAT和penetratin为基础，发展出了一类新型的能够递送各种分子的多肽载体:透膜肽。

近年来，各种跨学科研究报道了各类透膜肽作为递送工具递送核酸、蛋白、脂质体和纳米颗粒等进入细胞。透膜肽的主要特点是低毒性，递送效率呈剂量依赖性，对要递送的生物分子或纳米颗粒尺寸、类型没有限制。透膜肽的氨基酸数量通常在40个以下，通过各种途径进入细胞(主要是内吞途径)，并且能够与核酸、蛋白和小分子等通过共价或非共价方式结合，介导其进入细胞。透膜肽通常序列中含有大量阳离子赖氨酸和精氨酸(少数为不带电荷或带负电)，在生理条件带有大量正电荷，可以和核酸通过静电相互作用结合形成多肽/核酸纳米复合物，从而介导核酸进入细胞。科学家们已经利用TAT多肽递送反义核酸来抑制肿瘤细胞P_糖蛋白的表达。

大部分细胞透膜肽自身的透膜机制多为非能量依赖的直接转导，而在转运分子量较大的DNA等生物大分子时则大多采用内吞机制。例如，TAT是通过非能量依赖的方式直接透膜，而TAT/DNA复合物转染HepG2和CHO1细胞系时是经过小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞。一般来说，阳离子透膜肽与细胞膜外带负电荷的糖胺聚糖基质如肝素等结合，小部分直接转导进入细胞，绝大部分插入到细胞膜经各种蛋白(如小窝蛋白、网格蛋白)介导的内吞或大包吞作用进入细胞。透膜肽/核酸复合物的尺寸对细胞透膜机制有较大影响，部分较小尺寸的复合物可以直接转导进入细胞，而随着复合物尺寸的增大，小窝蛋白、网格蛋白介导的内吞作用和大包吞作用呈逐渐增多趋势。

RNA干扰(RNAi)是一个过程，其中激活由21-23个核苷酸(nt)组成的小干扰RNA(siRNA)调节的细胞内途径会导致特定的靶向mRNA降解(在1、2中进行了综述)。为了在人细胞中引起RNAi介导的基因沉默，将双链siRNA转染到细胞中。进入细胞后，siRNA双链体会经历5'磷酸化，解链，并与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。活化的RI SC(RISC*)和与目标mRNA互补的解链反义链与mRNA靶标。然后发生mRNA靶标的单位点特异性切割，其位置参照siRNA反义链的5'端确定。一旦发生切割，靶标mRNA降解，RISC循环用于另一种切割反应。由于RNAi在沉默特定靶向基因方面的有效性，因此被广泛用于各种实验室应用和未来的临床治疗中。

由于RNAi在生物学和医学中的广泛潜在应用，因此重要的是了解RNAi的机制并开发将siRNA成功递送至靶细胞的新方法。最近已经探索了许多递送siRNA的方法。一种方法是将编码siRNA序列的DNA或RNA模板传递到可转录以表达siRNA的细胞中。这些基于DNA和RNA的siRNA表达方法依赖于质粒或病毒载体进行递送，并且需要转染，稳定的载体整合以及选择以维持第8、9、10、11、12、13、14、15代的表达，其他成功的方法都集中在直接将siRNA传递到细胞中，而细胞摄取siRNA的保真度是使用这种方法导致RNAi的关键。目前，最常用的siRNA递送方法是Lipofectamine转染。然而，这种方法的使用仅限于特定的细胞类型，并且这种方法可能对细胞和动物有毒。

人RabJ是来源于健康成年人外周血单核细胞来源的树突状细胞一个新的小G蛋白家族成员，其特征是在其蛋白质组成中包含三类功能域:N端(1-18氨基酸)和中间(210-216氨基酸)的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、中间的Rab样功能域(19-209氨基酸)和C端的J功能域(217-273氨基酸)，并与Ras家族分子有较高同源性。三类功能域分别介导RabJ的核定位；与细胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulatedkinase,ERKl/2)激酶(ERK kinase}MEK1/2)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),磷脂酞肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的P85亚基、P53亚基相互作用；与HSC70和Raf(Ras相关因子，Ras-associated factor)相互作用等功能。RabJ的核着酸序列和氨基酸序列以及制法公开于中国专利申请CN01126826.3中。

此前已有针对RabJ的siRNA，但是设计的siRNA在抑制效率以及转染效率上都有改进的空间。

发明内容

本发明提供了特异性针对RabJ基因的siRNA。

针对RabJ基因的siRNA，其正义链分别如下所示：

SiRabJ1:5’-gcagatgccattcgcagaat-3’(SEQ ID N0:1)

SiRabJ2:5’-tagcagtgctagtttcacc-3’(SEQ ID N0:2)

根据本发明的另一种实施方式，所述正义链的3′末端可以连接1至3个核苷酸，从而在所述正义链和所述反义链互补形成所述双链结构后，在所述双链结构的至少一个末端形成由所述1至3个核苷酸构成的3′突出端。其中，优选所述3′突出端为由连续的两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT或连续的两个尿嘧啶核苷酸UU构成。

根据本发明的另一种实施方式，所述正义链和所述反义链链中分别包含至少一个被修饰的核苷酸基团。其中，所述被修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团或碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团。优选所述被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2′-羟基被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。

更重要的，本发明涉及一种特异性针对宫颈癌干细胞的透膜肽。

更具体的，本发明提供一种筛选透膜肽的方法，将宫颈癌干细胞加入含0.1％BSA的DMEM培养基孵育，加入随机十二肽噬菌体展示文库的原液，放入37℃摇床，，温和振摇孵育，继续在细胞培养箱中孵育。37℃孵育1h后终止噬菌体的内化。弃去未结合的噬菌体上清，洗涤细胞。用胰酶混合液消化干细胞，置于培养箱中保温至镜下观察细胞圆缩脱离皿壁。离心，去上清，再加入轻柔重悬细胞，离心，反复洗涤细胞3次。将沉淀的细胞置于液氮和37℃恒温水浴中反复冻融5次，并充分震荡。冻融物中加入2ml含1％TritonX-100的PBS(含有PMSF和Cocktail)，室温下作用2h以裂解细胞。4℃下5000r/min离心10min。离心后的上清即为筛选的分离液。取重复上述筛选方法5次，筛选得到的噬菌体回收率逐步提高，内化进入干细胞的噬菌体数目得到提高，目标噬菌体得到明显的富集。将筛选得到的噬菌体克隆扩增液20μl，96℃金属浴加热10min，取上清1μl作为DNA模板。根据十二肽插入序列的上下游共有序列设计引物，进行PCR反应。对经电泳鉴定为有插入片段的噬菌体克隆，取其PCR产物进行测序。根据编码链中噬菌体pⅢ基因的阅读框架推导出与pⅢ蛋白融合的外源十二肽的氨基酸序列。根据测序结果，有1条序列出现了4重复，该高峰度出现的十二肽序列即为具有干细胞透性特性的TM-2多肽，其序列为SEQ ID NO：3所示。

此外，本发明还提供一种取透膜肽与siRNA偶联的方法，具体的为siRNA用PBS稀释；将多肽样品配成溶液，按照多肽/siRNA电荷比N/P为10的量取多肽溶液，用PBS稀释；然后将多肽溶液逐滴加如到siRNA溶液中，用移液器吹打均匀，涡旋10s，放置在室温孵育3Omin让阳离子多肽与DNA充分结合形成纳米复合物；最后用无血清的DMEM培养液稀释到500ul用于细胞转染。

另一方面，本发明提供一种抑制乳腺癌干细胞内RabJ基因表达的方法，该方法包括向乳腺癌干细胞内导入如上所述的siRNA偶联物，从而使所述siRNA能够序列特异性地诱导所述RabJ基因表达的抑制。

另一方面，本发明提供如上所述的siRNA偶联物在制备治疗和/或预防乳腺癌的药物中的用途。

有益效果

本发明筛选得到了特异性的乳腺癌干细胞的透膜肽，能够特异性的针对乳腺癌干细胞来提供相应的基因递送能力，同时本发明还设计了特异性的siRNA能够序列特异性地介导RabJ基因表达的抑制，可以有效地抑制内源性RabJ基因的表达，从而抑制肿瘤细胞生长。

附图说明

图1示出TM-2多肽对细胞活力的影响，黑色代表TM-2多肽，灰色代表TAT多肽。

图2示出siRNA对基因表达量影响的检测结果。

图3示出蛋白表达水平的检测结果，从左至右依次代表TM-2多肽+SEQ ID NO：1siRNA，TAT多肽+SEQ ID NO：1siRNA，TM-2多肽+SEQ ID NO：2siRNA，TAT多肽+SEQ ID NO：2siRNA，阴性对照。

具体实施方式

实施例1宫颈癌干细胞的制备

取宫颈癌手术取下的新鲜肿瘤组织边缘无坏死、钙化及电凝部位无菌取材，置于培养基中(DMEM/F12，内含10％FBS)。修剪去除坏死组织及残余血管，用PBS冲洗3遍，将组织块剪碎，经0.14％I型胶原酶和0.25％胰蛋白酶-EDTA37℃分别消化30min，弃上清，收集含细胞的沉淀移至培养瓶中，以含有10％FBS、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基在37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养48h，洗掉未贴壁细胞继续培养。从取材到接种在2h内完成。原代培养3—5天时进行第1次换液，以后每3～4天换液1次，每7天按1：2传代。每株原代培养宫颈癌细胞均独立培养。

利用BD FACS流式细胞仪分选宫颈癌SP及非侧群细胞NSP细胞。选取对数生长期的细胞，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，将细胞浓度调整为1×10⁶/ml。向细胞悬液中加入Hoechst33342至终浓度为10μl，避光，于37℃孵育110min，每间隔15min混匀1次。4℃1000r/min离心10min，去上清，预冷的PBS洗涤细胞1遍，以含2％FBS的PBS重悬，经40um滤网过滤后的入流式细胞仪进行分选，得到宫颈癌SP细胞，即为宫颈癌干细胞，SP细胞比例为(1.43±0.50)％。

实施例2细胞膜穿透噬菌体短肽的筛选

将实施例1制备得到的宫颈癌干细胞进行传代培养后，弃去10cm皿中的培养液，用DMEM培养基冲洗贴壁的干细胞3次，加入含0.1％BSA的DMEM培养基于37℃下孵育1h。加入随机十二肽噬菌体展示文库的原液10μl(滴度为3×10¹³pfu/ml)，放入37℃摇床，70r/min，温和振摇孵育15min，继续在细胞培养箱中孵育1.5h。37℃孵育1h后立即将培养板于冰上放置5min，终止噬菌体的内化。弃去未结合的噬菌体上清，用5ml含0.1％BSA的DMEM培养基于室温下洗涤细胞6次。用2mlPBS和1.5ml 0.25％胰酶混合液消化干细胞，置于培养箱中保温至镜下观察细胞圆缩脱离皿壁。4℃、1000r/min离心2min，去上清，再加入3ml PBS轻柔重悬细胞，离心，反复洗涤细胞3次。将沉淀的细胞置于液氮和37℃恒温水浴中反复冻融5次，并充分震荡。冻融物中加入2ml含1％TritonX-100的PBS(含有PMSF和Cocktail)，室温下作用2h以裂解细胞。4℃下5000r/min离心10min。离心后的上清即为筛选的分离液。取重复上述筛选方法5次，筛选得到的噬菌体回收率逐步提高，内化进入干细胞的噬菌体数目提高了500倍左右，目标噬菌体得到明显的富集。将筛选得到的噬菌体克隆扩增液20μl，96℃金属浴加热10min，取上清1μl作为DNA模板。根据十二肽插入序列的上下游共有序列设计引物，进行PCR反应。对经电泳鉴定为有插入片段的噬菌体克隆，取其PCR产物进行测序。根据编码链中噬菌体pⅢ基因的阅读框架推导出与pⅢ蛋白融合的外源十二肽的氨基酸序列。根据测序结果，有1条序列出现了4重复，该高峰度出现的十二肽序列即为具有干细胞透性特性的TM-2多肽，其序列为SEQ ID NO：3所示。

实施例3TM-2多肽对细胞活力的影响

(1)取对数生长期培养的实施例1分离的宫颈癌干细胞，以1×10⁴个细胞/孔的接种密度接种于96孔板常规培养，每孔100μl，每种细胞设3个复孔，37℃培养；

(2)至对数生长期，培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养1h；

(3)分别换成TM-2多肽浓度梯度为10μM、20μM、30μM、40μM及50μM无血清的RPMI-1640培养液，继续培养24h；

(4)孵育时间结束后，按每孔100μl加入PBS洗涤，2min×3次；

(5)每孔加入80μl含血清的正常培养液及20μl MTT(母液浓度5mg/ml，即0.5％MTT)溶液，于37℃继续培养4h，终止培养后吸去培养液。以200μl/孔加入二甲基亚砜，振荡10min至结晶物充分溶解后用全波长酶标仪上检测波长为570nm的吸光值A，每组取3个复孔的平均值。测定OD490。重复3次，计算细胞存活率。细胞生存率的计算如下：细胞生存率＝(实验孔OD值－对照孔OD值－空白孔OD值)/(对照OD值－空白孔OD值)×100％。

以本领域常用的11个氨基酸短肽TAT多肽

(C18-CLLHHLLHHLLHHCGRKKRRQRRR-NH₂)按照上述相同方法处理作为对照。

本实验采用MTT法测定不同浓度TM-2多肽处理24h后对细胞活力的影响情况。干细胞经不同浓度TM-2多肽处理后MTT分析数据显示，浓度高于50mM的TM-2多肽长时间处理细胞后细胞依然保持在98％以上，对细胞的活力影响甚微(图1)。这提示TM-2多肽在50mM范围内并不影响细胞活力，而对照TAT多肽在50mM时细胞的存活率为90％，该多肽不利于研究siRNA真正对干细胞基因的实际抑制情况。

实施例4透膜肽透膜效率鉴定

(1)siRNA的设计

根据IKCa1的基因序列，申请人设计了1条siRNA序列，其正义链是Si-IKCa1-2:5’-GCCTGGATGTTCTACAAACAT-3’，siRNA序列由上海生工合成。

(2)siRNA与TM-2多肽偶联

质粒DNA用YOYO-1荧光标记物标记，每μg siRNA加2.5μl YOYO-1(10μM)，37℃空气浴中孵育30min，使YOYO-1荧光标签能够完全嵌入到DNA碱基对中。

取1ug siRNA,用PBS稀释到25ul；将多肽样品分别配成1mg/ml溶液，按照多肽/siRNA电荷比N/P为10的量取多肽溶液，用PBS稀释到25ul；然后将多肽溶液逐滴加如到siRNA溶液中，用移液器吹打均匀，涡旋10s，放置在室温孵育3Omin让阳离子多肽与DNA充分结合形成纳米复合物；最后用无血清的DMEM培养液稀释到500ul用于细胞转染。以短肽TAT多肽同样条件进行偶联作为阳性对照。

取实施例1的干细胞，给siRNA/肽复合物前24h，在NEST 15mm玻璃培养皿中接种3×10⁴个细胞，在37℃，5％CO₂培养箱中培养。24h后吸出培养液，加入1ml无血清并含有YOYO-1荧光标记的多肽/siRNA复合物的DMEM培养液，在37℃培养箱中孵育4h，4h后吸出培养液，依次用4℃预冷的PBS洗3次，4％的甲醛/PBS溶液固定10min，PBS再洗3次，用2.0μg/ml的DAPI/PBS溶液染细胞核15min，最后用PBS洗3次(以上过程中清洗细胞要缓慢贴壁滴加溶液，尽量避免细胞脱落)。在CarlZeissLSM510激光共聚焦显微镜下观察、拍照，60倍油镜下观察，激发波长分别为543nm。结果显示，本发明的透膜肽比现有技术的透膜肽具有更高的荧光细胞数目，具有更好的透膜效率，透膜效率达到97.5％细胞数以上。

实施例5透膜肽特异性鉴定

将人胰腺癌CFPAC-1细胞、人原髓细胞白血病细胞,AL7P/HL-60R细胞、人永生化表皮细胞HaCaT细胞、HEK293F细胞按照实施例4的操作方式导入所述的siRNA和Tm-2多肽，经过鉴定，几种细胞均显示非常弱的荧光活性和数目，透膜最强的HEK293F细胞也只有5％的透膜效率，说明本发明提供的透膜肽具有较好的特异性，初步分析原因是透膜肽具有宫颈癌干细胞表面特异性的结合及激活活性，能够特异性的刺激宫颈癌细胞来识别及内吞所述的多肽进而实现外面核酸的递送。

实施例6siRNA抑制效果测定

(1)siRNA的设计

根据RabJ的基因序列，申请人研究设计了2条siRNA序列，其正义链分别是SiRabJ1:5’-gcagatgccattcgcagaat-3’(SEQ ID N0:1)和SiRabJ2:5’-tagcagtgctagtttcacc-3’(SEQ ID N0:2)，2条siRNA序列由上海生工合成。

(2)siRNA与TM-2多肽偶联

取1ug siRNA,用PBS稀释到25ul；将多肽样品分别配成1mg/ml溶液，按照多肽/siRNA电荷比N/P为10的量取多肽溶液，用PBS稀释到25ul；然后将多肽溶液逐滴加如到siRNA溶液中，用移液器吹打均匀，涡旋10s，放置在室温孵育3Omin让阳离子多肽与DNA充分结合形成纳米复合物；最后用无血清的DMEM培养液稀释到500ul用于细胞转染。以短肽TAT多肽同样条件进行偶联作为阳性对照。

(3)复合物转染

实施例1的干细胞，给药前24h，在NEST 15mm玻璃培养皿中接种3×10⁴个细胞，在37℃，5％CO₂培养箱中培养。24h后吸出培养液，加入1ml无血清并含有YOYO-1荧光标记的多肽/siRNA复合物的DMEM培养液，在37℃培养箱中孵育4h，4h后吸出培养液，用PBS洗3次后，用RPMI-1640培养液，继续培养36h后收获细胞进行检测。

(4)RT-PCR和PCR产物定量分析法检测mRNA

按TRIzol总RNA提抽试剂盒提取总RNA。取总RNA 2.5ug，加入50u1逆转录反应体系，用SuperScriptTMII逆转录置试剂盒，按说明书操作进行逆转录。

PCR扩增:PCR反应体系按常规(试剂购自Invitrogen公司)。

RabJ引物1:5’-ATG CCG AAG AGG AAG GAG CCC-3'；

RabJ引物2:5’-GTT TCA CCA AAG AAC AAG CAG-3'；

β-actin引物l:5’-GCATCGTGATGGACTCCG-3'；

β-actin引物2:5’-TCGGAAGGTGGACAGCGA-3'，以上序列均由上海生工生物工程公司合成。

循环条件:94℃变性45秒，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后延伸10分钟。另以β-actin的扩增产物为内参对照。

PCR产物定量:取10u1的扩增产物在15g/L的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，以PCRmark(华美公司)作为分子质量标准，电压100V,20分钟。溴化乙锭染色，紫外反射仪上显象、照相。用扫描分析进行目的基因的半定量(以RabJ/β-actin cDNA的比值反映RabJ mRNA的表达水平)。

结果如图2显示，细胞经siRNA处理36h后检测，与阴性对照组相比，SiRabJ1比siRabJ2都能够下调mRNA的表达，但是SiRabJ1具有更显著的下调效果。特别是在本发明的透膜肽存在的情形下，能够加速干扰的效果，比不加透膜肽抑制效果更家显著，具有预料不到的技术效果。

收集36h的各组细胞，制备细胞裂解液，用RabJ多抗进行Western blot检测，检测RabJ蛋白水平的表达。从图3中结果显示，采用TM-2多肽介导的SEQ ID NO：1的siRNA在36h后即具有比不加TM-2更快以及更好的抑制效果，采用TM-2多肽介导的SEQ ID NO：2的siRNA在36h后同样比不加TM-2更快以及更好的抑制效果，但是明显的，SEQ ID NO：1比SEQ IDNO：2具有更好的效果。

实施例7RabJ siRNA干扰RabJ表达后，对肿瘤细胞体内致瘤性的抑制

将实施例4中所述透膜肽-siRNA偶联物转染(终浓度为100nmol)转染的宫颈癌干细胞(1X10⁶)皮下注射到Balb/C裸鼠的右下侧腹部，然后观察五周，计算肿瘤的发生率(出现肿瘤的小鼠个数/注射细胞的裸鼠个数)。另外，使用不加透明肽的SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2转染宫颈癌干细胞，按照上述相同实验方案进行，作为对照组。

结果显示，采用TM-2多肽介导的SEQ ID NO：1的siRNA其致瘤性为(9.25±0.33)％，而TM-2多肽介导的SEQ ID NO：2的siRNA其致瘤性为(30.52±1.17)％，不加透膜肽的SEQ ID NO：1的siRNA其致瘤性为(17.59±1.01)％，不加透膜肽的SEQ ID NO：2的siRNA其致瘤性为(40.88±2.13)％，这充分说明，采用了本发明的透膜肽能够提高siRNA的穿透速度以及透过效率，能够明显抑制宫颈癌干细胞在动物体内的致瘤性。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 北京瀚梅生物科技有限公司

<120> 宫颈癌干细胞特异性透膜肽和干扰RabJ基因的组合物的抑癌用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gcagatgcca ttcgcagaat 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

tagcagtgct agtttcacc 19

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

Gln Arg Tyr Arg Glu Arg Pro Ser His Ser Arg Arg

1 5 10