miR-19b-1-5p的应用及提高其表达量的药物组合物
阅读说明：本技术 miR-19b-1-5p的应用及提高其表达量的药物组合物 (Application of miR-19b-1-5p and pharmaceutical composition for improving expression level thereof ) 是由 叶文初 黄仕凤 赵贵芳 彭晓飞 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了miR-19b-1-5p的应用,将miR-19b-1-5p应用在动脉粥样硬化过程中,用于缓解动脉粥样硬化的发生发展。本发明还公开了一种治疗动脉粥样硬化斑块的药物组合物,所述药物包括提高miR-19b-1-5p表达量的试剂或药物,以及至少一种药学上接受的载体或赋形剂。本发明能够应用在动脉粥样硬化治疗过程中,可广泛应用于医疗技术领域。(The invention discloses application of miR-19b-1-5p, and the miR-19b-1-5p is applied to the atherosclerosis process and is used for relieving the occurrence and development of atherosclerosis. The invention also discloses a pharmaceutical composition for treating atherosclerotic plaques, which comprises a reagent or a medicament for improving the expression level of miR-19b-1-5p, and at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient. The invention can be applied to the treatment process of atherosclerosis and can be widely applied to the technical field of medical treatment.)
技术领域
本发明涉及医疗领域，具体是指miR-19b-1-5p在动脉粥样硬化治疗中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)是众多心脑血管病的病理基础，以其高致死率、高致残率严重危害人类的身体健康。脂质代谢紊乱是As形成的最重要的诱因之一，其中巨噬细胞的摄取过量脂质，形成泡沫细胞，进而导致动脉粥样硬化病变。对于As发病机制及靶向治疗的研究，一直是国内外研究学者关注的热点。THP-1巨噬细胞的脂质蓄积是As发生发展的核心因素，如何抑制巨噬细胞脂质蓄积是干预As进展的一个重要切入点。
随着新一代测序技术的发展以及基因组研究的深入，人们逐渐意识到非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)可以通过特定的调控机制发挥重要的调控作用。根据ncRNA的长度，可以将ncRNA分为小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(long non coding RNA,lncRNA)，其中miRNAs是一类长度为19～25个核苷酸的单链非编码RNA，通过与靶向mRNA的3'-UTR结合，在转录后水平抑制靶基因表达，是当今生命科学和医学领域的研究热点。
MiR-19b-1是miR-19b-1-5p家族中重要成员之一，根据其作用靶基因的性质常被标记为肿瘤促进因子或肿瘤抑制因子，并在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。近年来研究发现，miR-19b-1-5p异常表达出现在多种疾病中，包括心血管疾病、阿尔茨海默病等，表明miR-19b-1-5p表达水平与心血管疾病的发生发展密切相关。
因此，如何利用miR-19b-1-5p治疗动脉粥样硬化是亟需解决的问题。
发明内容
针对以上问题，本发明提出了小RNA基因miR-19b-1-5p在制备动脉粥样硬化脂质蓄积药物的研究，miR-19b-1-5p可有效缓解动脉粥样硬化的发生发展。
本发明提供的技术方案为：
miR-19b-1-5p的应用，将miR-19b-1-5p应用在动脉粥样硬化过程中，用于缓解动脉粥样硬化的发生发展。
进一步地，miR-19b-1-5p由以下核苷酸组成：5′-AGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGC-3′。
本发明还提供了一种技术方案：
一种治疗动脉粥样硬化斑块的药物组合物，所述药物包括提高上述miR-19b-1-5p表达量的试剂或药物，以及至少一种药学上接受的载体或赋形剂。
进一步地，所述药物为miR-19b-1-5p agomir。
进一步地，所述药物组合物通过单位剂量给药，给药途径包括肠道、非肠道，给药剂型为液体剂型、固体剂型或半固体剂型；所述药物组合物分为单独服用，或与其他治疗药物、对症药物合并使用。
本发明与现有技术相比的优点在于：
附图说明
图1.miR-19b-1-5p对THP-1源性巨噬细胞内脂质蓄积的影响；
图2.miR-19b-1-5p分别在C57和apoE-/-小鼠血液内表达的影响；
图3.尾静脉注射miR-19b-1-5p agomir对apoE-/-小鼠全血和主动脉血管组织miR-19b-1-5p表达水平的影响；
图4.miR-19b-1-5p agomir减少apoE-/-小鼠主动脉斑块的形成。
具体实施方式
下面结合附图1-4对本发明做进一步的详细说明。
本发明提出了通过miR-19b-1-5p可有效缓解动脉粥样硬化的发生发展的技术。为了证明其有效性，进行了如下实验。
利用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理THP-1源性巨噬细胞，制取泡沫细胞，qRT-PCR技术检测miR-19b-1-5p表达水平。结果显示，在ox-LDL处理THP1-1源性巨噬细胞中，miR-19b-1-5p表达量显著低于正常对照组，促进细胞内脂质蓄积；在THP1-1源性巨噬细胞中，转染miR-19b-1-5p mimics，qRT-PCR技术检测miR-19b-1-5p表达水平，油红O染色检测细胞内脂质蓄积情况。结果显示，转染miR-19b-1-5p mimics显著上调miR-19b-1-5p表达，减少细胞内脂质蓄积。这说明miR-19b-1-5p抑制细胞内脂质蓄积，对于动脉粥样硬化的指导治疗具有重要的参考意义。
本发明选取6周龄6只雄性apoE-/-小鼠及6只C57小鼠作为对照，高脂饲料饲养8周，采集血液并利用qRT-PCR技术检测miR-19b-1-5p表达水平。结果显示，在小鼠疾病模型中，miR-19b-1-5p表达量显著低于正常对照组。这对于动脉粥样硬化的临床诊断和指导治疗具有重要的参考意义。
为进一步探究miR-19b-1-5p在动脉粥样硬化斑块形成中的作用，本发明使用miR-19b-1-5p agomir(激动剂)尾静脉注射使其在小鼠动脉血管组织高表达。实验结果显示，造模后apoE-/-小鼠进行miR-19b-1-5p agomir尾静脉注射，其减少主动脉弓根部斑块的形成，进一步证实miR-19b-1-5p agomir在动脉粥样硬化斑块形成发生过程中起到保护性作用。
下面通过具体的技术方案对本发明进行进一步的说明。
本发明提供的miR-19b-1-5p由以下核苷酸组成：5′-AGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGC-3′。药物为提高miR-19b-1-5p表达量的试剂或药物，具体为miR-19b-1-5p agomir。
然后，本发明公开了一种治疗动脉粥样硬化斑块的药物组合物，且药物包含提高miR-19b-1-5p表达量的试剂或药物，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。此药物组合物可以单位剂量给药，给药途径可为肠道或非肠道。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将药物有效成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备胶囊剂。
本发明的药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的药物组合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
此外，本发明也可以是miR-19b-1-5p在动脉粥样硬化治疗中的应用。本发明提供的miR-19b-1-5p由以下核苷酸组成：5′-AGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGC-3′。
药物为提高miR-19b-1-5p表达量的试剂或药物，具体药物为miR-19b-1-5pagomir。
本发明提供的miR-19b-1-5p在ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞及动脉粥样硬化疾病模型小鼠主动脉血管中低表达，且在动脉粥样硬化疾病模型小鼠中给予尾静脉注射miR-19b-1-5p mimic[模拟物]使其在主动脉血管中高表达后，疾病模型小鼠主动脉弓斑块显著减少，表明miR-19b-1-5p可有效减少动脉粥样硬化斑块面积，为心血管疾病的治疗提供了有效的途径。
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)是伴有脂质代谢紊乱的慢性炎症性病理生理学过程，其中巨噬细胞脂质过量蓄积是其发病的关键因素。巨噬细胞通过摄入过量脂质如ox-LDL，导致巨噬细胞泡沫化，引起动脉血管壁泡沫细胞的堆积和脂纹的形成。巨噬细胞泡沫化过程可作为As防治过程中的重要靶点，因此，研究泡沫细胞形成的影响因素及相关分子机制，对As疾病的预防及治疗具有十分重要的意义。
miRNA mimics是运用化学合成的方法合成，模拟生物体内源的miRNAs来调控靶基因的生物学功能。miRNA agomir是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA，通过模拟内源性的miRNA来调控靶基因的生物学功能。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举细胞和动物实验作为实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
油红O染色检测THP-1源性巨噬细胞脂质蓄积情况。
THP-1细胞铺板于12孔板中，加入50ng/mL的佛波醇(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)处理48h，诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞，加入100μg/mL氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理24h,油红O染色镜检结果表明ox-LDL显著促进THP-1源性巨噬细胞脂质蓄积作用(图1)。
在图1中，复苏、培养的THP-1细胞，将THP-1细胞铺板于12孔板中，加入50ng/mL的佛波醇(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞，加入100μg/mL氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理24h。其中，A为RT-PCR检测ox-LDL对miR-19b-1-5p的表达情况，B为油红O染色(oil red O)镜检。在PMA诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞，转染miR-19b-1-5p mimics(模拟物)；C为RT-PCR检测miR-19b-1-5p mimics对miR-19b-1-5p的表达情况。D为油红O(oil red O)染色镜检。NC mimics：对照组，miR-19b-1-5p mimics:miR-19b-1-5p模拟物。***:P<0.001，与Control组比较。
细胞总RNA的提取采用SIAMA公司的Trizol试剂。具体提取步骤如下：
(1)直接在6孔培养板中加入1mL Trizol裂解细胞，用移液器吹打混匀；
(2)将裂解后样品或匀浆液室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离；
(3)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置5min，12000rpm 4℃离心10min；
(4)吸取上层水相转移至干净的无RNA酶1.5mL EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min，12000rpm 4℃离心10min，弃上清；
(5)加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。12000rpm 4℃离心3min，弃上清，室温干燥5-10min；
(6)加入30-50μl RNase-free ddH2O，充分溶解RNA，将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续试验。
反转录PCR采用Takara公司One Step PrimeScript miRNAcDNA SynthesisKit。由于miRNA与mRNA不同，miRNA不具有Poly(A)结构，但在本转录试剂盒中可以同时对样品中的miRNA以及它的small noncoding RNA进行Poly(A)加尾反应，然后利用Universal AdaptorPrimer将经过加尾的RNA以及mRNA进行反转录反应得到的cDNA，并引入了Uni-miR qPCRPrimer的结合位点，利用这一位置可以对样品中任何cDNA进行定量PCR反应。
实施例2
RT-PCR检测miR-19b-1-5p在THP-1源性巨噬细胞内表达情况。
THP-1细胞铺板于6孔板中，加入PMA(50ng/mL)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞，加入ox-LDL(100μg/mL)处理24h，提取总RNA，逆转录为cDNA。RT-PCR检测结果表明ox-LDL下调miR-19b-1-5p表达(图2)，表明miR-19b-1-5p可能参与抑制THP-1源性巨噬细胞内脂质蓄积。
图2中，购买6周龄C57和apoE-/-雄性小鼠12只，分成2组，普通饲料适应1周后，高脂饮食(21％脂肪，0.3％胆固醇)饲养8周，麻醉后处死，取血液。RT-PCR检测小鼠体内miR-19b-1-5p的表达情况.***:P<0.001，与Control组比较。
转染具体步骤具体包括以下步骤：
(1)siRNA合成：从NCBI中选择miR-19b-1-5p的靶序列，设计mimics序列；
(2)细胞转染：miR-19b-1-5p mimics过表达载体的转染；NC mimics和miR-19b-1-5p mimics过表达载体的转染具体步骤如下：
(2.1)转染前二天对THP-1细胞进行铺板，加入PMA(50ng/mL)处理48h，诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞；
(2.2)制备转染复合物：以6孔板为例，每孔加入200pmoL miR-19b-1-5p mimics，稀释到500μl Opti MEM培养基为A液，取4μl LipofectamineTM 2000溶解于Opti MEM培养基为B液，B液混合5min后，A液和B液混合，静置15min后加入到细胞培养板中；
(2.3)37℃含5％CO2培养箱孵育4～6h后，更换为原细胞生长培养基；
(2.4)转染后一天，加入ox-LDL(100μg/mL)处理细胞24h。
下面针对转染后结果进行油红O染色镜检
(1)配制油红O染液储存液：称取0.5g油红O粉末，将粉末溶于异丙醇中，定量液体体积至100mL，混匀后于棕色瓶4℃保存；
(2)配制油红O染液工作液：将油红O储存液与双蒸水按3：2比例混匀，滤纸过滤2次，放置室温；
(3)细胞染色制备：细胞备好后，去除培养基，PBS清洗2次，加入4％多聚甲醛固定；
冰冻切片准备：将新鲜组织(小鼠心脏)，置于4％多聚甲醛固定；
(4)染色：移除固定液，PBS清洗2-3次，将油红O工作液滴加于细胞或心脏组织，染色30min；
(5)调色：用60％异丙醇漂洗，去除多余油红O染料；
(6)复染：将苏木素滴加于心脏组织或细胞中，染色2min，弃去多余染液，流水复染；
(7)封片，显微镜拍照。
实施例3
RT-PCR检测miR-19b-1-5p mimics在THP-1源性巨噬细胞内表达情况。
提取ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的总RNA，逆转录为cDNA。RT-PCR检测结果表明转染miR-19b-1-5p mimics，上调miR-19b-1-5p表达(图3)。
图3中，购买6周龄apoE-/-雄性小鼠12只，分成2组，普通饲料适应1周后，高脂饮食(21％脂肪，0.3％胆固醇)饲养8周，分别给予小鼠尾静脉注射NC agomir，miR-19b-1-5pagomir每周注射1次，共注射8次。麻醉后处死，取血液，主动脉血管，心脏等组织。RT-PCR检测小鼠血液(A)和主动脉血管组织(B)miR-19b-1-5p的表达情况。NC agomir：对照组，miR-19b-1-5p agomir:miR-19b-1-5p激动剂。***:P<0.001，与Control组比较。
实施例4
油红O染色镜检观察miR-19b-1-5p对细胞内脂质蓄积的影响。
转染miR-19b-1-5p mimics，ox-LDL处理THP-1源性巨噬细胞24h，结果表明，miR-19b-1-5p抑制细胞内脂质蓄积(图4)。
图4中，A为取主动脉弓至髂动脉分支处全部主动脉，体视显微镜观察主动脉弓及其三个分支(头臂干、左颈总动脉、左锁骨下动脉)As斑块形成情况，并拍照。B为主动脉弓中间剖开，油红O染色镜检。C为冰冻切片，油红O染色检测主动脉弓根部脂质蓄积情况。
实施例5
RT-PCR检测小鼠血液和血管内miR-146a-5p表达情况。
从南京青紫兰科技有限公司分别购买雄性C57小鼠和雄性apoE-/-小鼠6只，高脂饲料饲养8周，麻醉处死小鼠，抽取血液于抗凝管中。本实施例采血液或血浆RNA提取试剂盒(贝贝生物科技有限公司)进行血液总RNA提取，Mir-X miRNAFirst-Strand Synthesis Kit反转录成cDNA溶液后，利用Mir-X miRNA qRT-PCR TBKit进行miR-19b-1-5p的qRT-PCR检测。PCR采用20μL体系，反应液体系按照说明书比例配制，反应条件为：预变性95℃10sec，40循环(变性95℃5sec，退火60℃20sec)，以U6为内参对照，样品设置3个复孔，取平均CT值采用2-ΔΔCT进行相对表达量分析。qRT-PCR结果表明，高脂饲养apoE-/-小鼠全血中miR-19b-1-5p表达量较正常对照组(C57小鼠)下调。
实施例6
小鼠动脉粥样硬化模型的建立及miR-19b-1-5p agomir干预。
6周龄apoE-/-雄性小鼠12只，普通饲料适应1周后，高脂饮食(21％脂肪，0.3％胆固醇)饲养小鼠，分别给予尾静脉注射NC agomir和miR-19b-1-5p agomir，每周1次，共8周。各组apoE-/-小鼠处死取全血，主动脉血管和心脏用于下述实验。
实验分组如下：(apoE-/-雄性小鼠每组6只)
1)对照组：NC agomir
2)miR-19b-1-5p组：miR-19b-1-5p agomir
实施例7
qRT-PCR检测尾静脉注射miR-19b-1-5p agomir的小鼠全血和血管组织miR-19b-1-5p表达水平。
本实例使用全血和动物组织总RNA提取试剂盒(贝贝生物科技有限公司)提取全血和主动脉血管组织总RNA，具体操作步骤按照说明书进行。按照实例1中的方法进行反转录及qRT-PCR检测。结果表明，动脉粥样硬化动物疾病模型中有miR-19b-1-5p含量的降低，使用miR-19b-1-5p agomir尾静脉注射处理可显著提高血液和主动脉组织miR-19b-1-5p表达水平。
实施例7
体式显微镜观察主动脉弓及其三个分支(头臂干、左颈总动脉、左锁骨下动脉)动脉粥样斑块形成情况。
结果表明，使用miR-19b-1-5p agomir尾静脉注射apoE-/-小鼠，可显著减少动脉粥样斑块形成。
实施例8
油红O检测小鼠主动脉血管斑块情况。
将油红O染液加入到分离的主动脉弓及其三个分支(头臂干、左颈总动脉、左锁骨下动脉)动脉血管，室温孵育20min，流水清洗。油红O染色结果表明，使用miR-19b-1-5pagomir尾静脉注射apoE-/-小鼠，可显著减少动脉粥样斑块形成。
实施例9
油红O染色检测检测主动脉根部斑块面积。
取小鼠心脏和主动脉根部，冰冻切片油红O染色镜检结果表明，使用miR-19b-1-5pagomir尾静脉注射apoE-/-小鼠，可显著减少动脉粥样斑块形成。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的发明内容并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的实施方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。