具体实施方式

RNAi试剂

本文描述了用于抑制HIF-2α(EPAS1)基因的表达的RNAi试剂(在本文中被称作HIF-2α或HIF2αRNAi试剂、或HIF-2α或HIF2αRNAi触发剂)。本文描述的HIF-2αRNAi试剂包括有义链(也被称作乘客链)和反义链(也被称作指导链)。有义链和反义链可以彼此部分地互补、基本上互补或完全互补。本文描述的RNAi试剂有义链和反义链的长度各自可以是16-49个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链和反义链独立地是17-26个核苷酸长度。所述有义链和反义链可以是相同长度或不同长度。在某些实施方案中，所述有义链和反义链独立地是21-26个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链和反义链独立地是21-24个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链和所述反义链是21个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链和/或反义链独立地是16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。本文描述的RNAi试剂在递送给表达HIF-2α的细胞后会在体内或在体外抑制一个或多个HIF-2α(EPAS1)基因的表达。

本文描述的一个方面是用于抑制HIF-2α(EPAS1)基因的表达的RNAi试剂，其包含：

(i)包含至少17个邻接核苷酸的反义链，其与在表3中提供的任一个序列相差0或1个核苷酸；

(ii)有义链，其包含与所述反义链至少部分地互补的核苷酸序列；和

(iii)一个或多个靶向配体。

在另一个方面，描述了能够抑制HIF-2α(EPAS1)基因的表达的RNAi试剂，其包含：

(i)具有18-49个核苷酸之间的长度的反义链，其与HIF-2α(EPAS1)基因(SEQ IDNO:1)至少部分地互补；

(ii)与所述反义链至少部分地互补的有义链；

(iii)连接至所述有义链的靶向配体；和

(iv)连接至所述有义链的PK增强剂。

本文描述的HIF-2αRNAi试剂的反义链包括至少16个连续核苷酸，其与HIF-2αmRNA中的相同数目的核苷酸的核心段序列(在本文中也被称作“核心段”或“核心序列”)和对应有义链中的相同数目的核苷酸的核心段具有至少85％互补性。在某些实施方案中，该反义链核心段是16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸长度。在某些实施方案中，该反义链核心段是19个核苷酸长度。在某些实施方案中，该反义链核心段是17个核苷酸长度。

本文描述的HIF-2αRNAi试剂的有义链包括至少16个连续核苷酸，其与HIF-2αmRNA中的相同数目的核苷酸的核心段具有至少85％同一性。在某些实施方案中，该有义链核心段是16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸长度。在某些实施方案中，该有义链核心段是17个核苷酸长度。在某些实施方案中，该有义链核心段是19个核苷酸长度。

在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂靶向具有在表1中公开的任何序列的序列的HIF-2α基因的部分。

在本文公开的HIF-2αRNAi试剂中可以包含的HIF-2αRNAi试剂反义链的例子提供在表3中。在本文公开的HIF-2αRNAi试剂中可以包含的HIF-2αRNAi试剂反义链的例子提供在表4、4.1、4.2和4.3中。HIF-2αRNAi试剂双链体的例子提供在表5中。由本文公开的HIF-2αRNAi试剂的有义链和反义链组成或被包含在其中的19-核苷酸核心段序列的例子提供在表2中。

在某些实施方案中，本文描述了组合物，其包括具有在表5中公开的双链体结构的一种或多种HIF-2αRNAi试剂。

在另一个方面，通过将RNAi试剂共价地连接或缀合至一种或多种靶向配体(例如，包括对一种或多种细胞受体具有亲和力的化合物的配体，所述受体位于表达HIF-2α的细胞上)，可以将本文公开的HIF-2αRNAi试剂递送给靶细胞或组织。在某些实施方案中，合适的靶向配体包括对一种或多种整联蛋白(可替换地被称作“整联蛋白受体”)具有亲和力的化合物或由其组成。

使用本领域已知的任何寡核苷酸递送技术，可以将HIF-2αRNAi试剂递送给细胞，包括、但不限于癌细胞诸如(ccRCC)细胞。核酸递送方法包括、但不限于：通过连接或缀合至靶向配体，通过包囊在脂质体中，通过离子透入法，或通过掺入其它媒介物，诸如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米囊和生物粘附微球、蛋白性载体或Dynamic Polyconjugates^TM(DPC)。

在某些实施方案中，将HIF-2αRNAi试剂连接至靶向配体，所述靶向配体包含对一种或多种整联蛋白具有亲和力的化合物(在下文中被称作“整联蛋白靶向配体”)。在某些实施方案中，用于与本文公开的HIF-2αRNAi试剂一起使用的合适靶向配体对整联蛋白α-v-β3、整联蛋白α-v-β-5、或这两种整联蛋白具有亲和力。靶向配体可以单独存在(仅一种靶向化合物存在)，或两个或更多个靶向配体可以经由分支点或支架连接，一起形成靶向基团，且所述靶向基团的分支点或支架然后单独连接至RNAi试剂。靶向基团可以包括两个靶向配体(被称作“双齿”)、三个靶向配体(“三齿”)、四个靶向配体(“四齿”)或超过四个靶向配体。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂连接至两个或更多个靶向配体。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂连接至2-10个靶向配体。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂连接至7个靶向配体。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂连接至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或超过10个靶向配体。

在某些实施方案中，当将HIF-2αRNAi试剂缀合至包括对整联蛋白α-v-β3和/或整联蛋白α-v-β-5具有亲和力的化合物的靶向配体时，RNAi试剂通过受体介导的胞吞作用或通过其它方式被ccRCC细胞选择性地内化。可用于递送HIF-2αRNAi试剂的、对整联蛋白α-v-β3和/或整联蛋白α-v-β-5具有亲和力的靶向配体和靶向基团的例子公开在例如PCT专利公开号WO2019/210200，其通过引用整体并入本文。

可以将靶向配体连接至有义链的3′或5′末端、反义链的3′或5′末端，和/或在内部连接至HIF-2αRNAi试剂的有义链和/或反义链的一个或多个单独核苷酸。在某些实施方案中，靶向配体或靶向基团连接至有义链的3′或5′末端。在某些实施方案中，靶向配体或靶向基团连接至有义链的5′末端。在某些实施方案中，靶向配体或靶向基团在内部连接至RNAi试剂的有义链和/或反义链的核苷酸。在某些实施方案中，靶向配体或靶向基团连接至有义链的5’末端端部，且一个或多个靶向配体连接至有义链的一个或多个内部核苷酸。在某些实施方案中，靶向配体或靶向基团经由接头连接至RNAi试剂。

与或不与接头一起，靶向配体或靶向基团可以连接至在表2、3或4、4.1、4.2或4.3中公开的任何有义链和/或反义链的5′或3′末端。与或不与靶向配体或靶向基团一起，接头可以附着至在表2、3或4、4.1、4.2或4.3中公开的任何有义链和/或反义链的5′或3′末端。

在另一个方面，本文公开的HIF-2αRNAi试剂可以连接或缀合至一种或多种药代动力学/药效动力学(PK)增强剂。本文中使用的PK增强剂(也被称作“药代动力学(PK)修饰剂”)是这样的化合物：其当连接至基于寡核苷酸的药物产品或其它治疗剂时，与治疗剂的游离形式相比，可以增加所述治疗剂在体内的全身循环时间(增加的半衰期或血浆停留时间)，这通过限制肾排泄而不阻碍所述治疗剂向靶细胞或组织的递送来实现，或其以其它方式提供与没有PK增强剂的治疗剂相比的药效动力学改善。本文公开了适合用于与HIF-2αRNAi试剂一起使用的示例性PK增强剂。本领域普通技术人员考虑到所选的治疗剂能够容易地设计有关的体内和/或体外研究以鉴定另外的合适的PK增强剂。例如，可以容易地设计对比具有和没有PK增强剂的治疗剂的研究，其量化在不同时间间隔在受试者的体循环中剩余的药物产品的量，或其评价治疗剂在有关的时间点的效应或效能或效应持续时间。这在本领域普通技术人员的知识范围内。

在另一个方面，本公开内容的特征在于用于抑制HIF-2α(EPAS1)基因的表达的方法，其中所述方法包括给受试者或给受试者的细胞施用能够抑制HIF-2α基因的表达的量的HIF-2αRNAi试剂，其中所述HIF-2αRNAi试剂包含有义链和反义链，且其中所述反义链包括表2或表3中的任一个反义链核苷酸序列的序列。在某些实施方案中，本文公开了抑制HIF-2α基因的表达的方法，其中所述方法包括给受试者或给细胞施用能够抑制HIF-2α基因的表达的量的HIF-2αRNAi试剂，其中所述HIF-2αRNAi试剂包含有义链和反义链，且其中所述有义链包括在表2、4、4.1、4.2或4.3中的任一个有义链核苷酸序列的序列。本文也描述了用于这样的方法中的组合物。

本文也公开了在体内向受试者(诸如哺乳动物)中表达整联蛋白(在本文中也被称作“整联蛋白受体”)的细胞递送HIF-2αRNAi试剂的方法。在某些实施方案中，通过将HIF-2RNAi试剂连接至一种或多种靶向配体和/或一种或多种PK增强剂，促进HIF-2αRNAi试剂向期望的细胞的递送。还描述了用于这样的方法中的组合物。

在另一个方面，本公开内容的特征在于治疗(包括防止性或预防性治疗)疾病、病症或症状的方法，所述疾病、病症或症状可以至少部分地由HIF-2α表达的减少介导，包括ccRCC，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用具有反义链的HIF-2αRNAi试剂，所述反义链包括表2或3中的任一个序列的序列。在某些实施方案中，本文描述了治疗(包括预防性治疗)疾病、症状或病症的方法，所述疾病、症状或病症可以至少部分地由HIF-2α表达的减少介导，包括ccRCC，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用具有有义链的HIF-2αRNAi试剂，所述有义链包含表2、4、4.1、4.2或4.3中的任一个序列的序列。本文也描述了用于这样的方法中的组合物。

还描述了治疗具有病理学状态(诸如病症或疾病)或处于发生病理学状态的风险中的人受试者的方法，所述病理学状态至少部分地由HIF-2α基因表达介导，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的HIF-2αRNAi试剂和/或含有HIF-2αRNAi试剂的组合物的步骤。用HIF-2αRNAi试剂和/或含有HIF-2αRNAi试剂的组合物治疗受试者的方法可以任选地与施用一种或多种另外的(例如，第二、第三等)治疗剂或治疗的一个或多个步骤组合。另外的治疗剂可以是另一种HIF-2αRNAi试剂(例如，靶向HIF-2α基因内的不同序列的HIF-2αRNAi试剂)。另外的治疗剂还可以是小分子药物、抗体、抗体片段和/或适体。

在另一个方面，本文描述了药物组合物，其包括任选地与一种或多种另外的(第二、第三等)治疗剂组合的一种或多种所描述的HIF-2αRNAi试剂。在某些实施方案中，包括任选地与一种或多种另外的(例如第二、第三等)治疗剂组合的一种或多种所描述的HIF-2αRNAi试剂的药物组合物可以配制在药学上可接受的载体或稀释剂中。在某些实施方案中，可以将这些组合物施用给受试者，诸如哺乳动物。在某些实施方案中，所述哺乳动物是人。在某些实施方案中，所述任选的一种或多种另外的治疗剂是被指示用于治疗癌症(诸如一种或多种癌)的药物产品。所述HIF-2αRNAi试剂和另外的治疗剂可以在单一组合物中施用，或它们可以分开施用。在某些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗剂在与RNAi试剂分开的剂型中分开施用(例如，通过静脉内输注或注射施用HIF-2αRNAi试剂，而口服地施用在治疗方法给药方案中涉及的另外治疗剂)。在某些实施方案中，通过静脉内输注或注射将所描述的HIF-2αRNAi试剂施用给有此需要的受试者，也通过静脉内输注、注射或口服地施用一种或多种任选的另外治疗剂，且所述施用一起提供可以由HIF-2α基因表达介导的疾病和病症(诸如ccRCC)的治疗方案。在某些实施方案中，将所述HIF-2αRNAi试剂和一种或多种另外的治疗剂组合在单一剂型(例如，配制成用于静脉内输注或注射的单一组合物的“混合液”)中。与或不与一种或多种另外的治疗剂一起，所述HIF-2αRNAi试剂可以与一种或多种赋形剂组合以形成药物组合物。

在某些实施方案中，本文公开了用于抑制细胞或受试者中的HIF-2α基因的表达的方法，其中所述方法包括给细胞或受试者施用具有有义链和反义链的HIF-2αRNAi试剂，所述有义链包含表4、4.1、4.2或4.3中的任一个序列的序列，所述反义链包含表3中的任一个序列的序列。

在某些实施方案中，描述了在体内将HIF-2αRNAi试剂递送给ccRCC细胞的组合物，所述组合物包含：连接或缀合至一种或多种靶向配体的HIF-2αRNAi试剂。在某些实施方案中，所述靶向配体包括对整联蛋白α-v-β-3和/或整联蛋白α-v-β-5具有亲和力的化合物。在某些实施方案中，连接或缀合至一种或多种靶向配体的HIF-2αRNAi试剂进一步连接或缀合至一种或多种PK增强剂。

在某些实施方案中，本文公开了在体内将HIF-2αRNAi试剂递送给ccRCC细胞的组合物，所述组合物包括缀合或连接至一种或多种靶向配体和/或靶向基团的HIF-2αRNAi试剂。在某些实施方案中，所述靶向配体和/或靶向基团包含对一种或多种整联蛋白具有亲和力的化合物。在某些实施方案中，描述了在体内将HIF-2αRNAi试剂递送给ccRCC细胞的组合物，所述组合物包括与α-v-β-3和/或α-v-β-5整联蛋白靶向配体连接的HIF-2αRNAi试剂。

在某些实施方案中，本文公开了用于抑制细胞中HIF-2α(EPAS1)基因的表达的方法，其中所述方法包括给所述细胞施用包括反义链的HIF-2αRNAi试剂，所述反义链与具有表1中的序列的HIF-2αmRNA的部分至少部分地互补。在某些实施方案中，本文公开了抑制细胞中的HIF-2α基因的表达的方法，其中所述方法包括给细胞施用包括反义链和有义链的HIF-2αRNAi试剂，所述反义链包含表2或3中的任一个序列的序列，所述有义链包含与反义链至少部分地互补的表2或表4、4.1、4.2或4.3中的任一个序列。在某些实施方案中，本文公开了抑制细胞中的HIF-2α基因的表达的方法，其中所述方法包括施用包括有义链和反义链的HIF-2αRNAi试剂，所述有义链包含表2或表4、4.1、4.2或4.3中的任一个序列，所述反义链包括与有义链至少部分地互补的表2或3中的任一个序列的序列。

在某些实施方案中，本文公开了用于抑制细胞中HIF-2α基因的表达的组合物，其中所述方法包括施用包含HIF-2αRNAi试剂的组合物，所述HIF-2αRNAi试剂具有在表5中所示的双链体的双链体结构。

本文公开的HIF-2αRNAi试剂被设计成靶向HIF-2α(EPAS1)基因(SEQ ID NO:1)上的特定位置。如本文中定义的，如果与所述基因碱基配对，当反义链的5′末端核碱基与在所述基因的位置下游19个核苷酸(朝向3′末端)的位置对齐时，反义链序列被设计成靶向所述基因上的给定位置处的HIF-2α基因。例如，如本文表1和2所示，被设计成靶向在位置5033处的HIF-2α基因的反义链序列要求，如果与所述基因碱基配对，反义链的5′末端核碱基与HIF-2α(EPAS1)基因的位置5051对齐。

如本文提供的，HIF-2αRNAi试剂不要求在反义链的位置1(5′→3′)处的核碱基与所述基因互补，前提条件是，反义链和所述基因在至少16个连续核苷酸的核心段序列上存在至少85％互补性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性)。例如，对于被设计成靶向HIF-2α基因的位置5033的本文公开的HIF-2αRNAi试剂，HIF-2αRNAi试剂的反义链的5′末端核碱基必须与所述基因的位置5051对齐；但是，反义链的5′末端核碱基可以与HIF-2α基因的位置5051互补，但不作此要求，前提条件是，反义链和所述基因在至少16个连续核苷酸的核心段序列上存在至少85％互补性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性)。如尤其是本文公开的实施例所证实的，HIF-2αRNAi试剂的反义链与所述基因的特异性结合位点(例如，不论HIF-2αRNAi试剂被设计成靶向在位置5033处还是在某个其它位置处的HIF-2α(EPAS1)基因)对于HIF-2αRNAi试剂所实现的抑制水平而言是重要的。

所描述的HIF-2αRNAi试剂可以介导RNA干扰以抑制HIF-2α蛋白的产生所必需的一个或多个基因的表达。HIF-2αRNAi试剂还可以用于治疗或预防各种疾病、障碍或病症，包括ccRCC。此外，描述了在体内向ccRCC细胞递送HIF-2αRNAi试剂的组合物。

可以以许多方式施用包括一种或多种HIF-2αRNAi试剂的药物组合物，取决于需要局部还是全身治疗。施用可以是、但不限于静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、真皮下(例如，经由植入装置)和实质内施用。在某些实施方案中，通过静脉内输注或注射来施用本文描述的药物组合物。

在某些实施方案中，将本文描述的包含一种或多种HIF-2αRNAi试剂的组合物包装在试剂盒、容器、包、分配器、预填充的注射器、输注袋或管形瓶中。在某些实施方案中，胃肠外地施用本文描述的组合物。

每种HIF-2αRNAi试剂包含有义链和反义链。有义链和反义链各自可以是16-30个核苷酸长度。有义链和反义链可以是相同长度，或它们可以是不同长度。在某些实施方案中，所述有义链和反义链各自独立地是17-27个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链和反义链各自独立地是17-21个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链和反义链各自是21-26个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链和反义链各自是21-24个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链是约19个核苷酸长度，而所述反义链是约21个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链是约21个核苷酸长度，而所述反义链是约23个核苷酸长度。在某些实施方案中，有义链是23个核苷酸长度且反义链是21个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链和反义链各自是21个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述RNAi试剂有义链和反义链各自独立地是16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸长度。在某些实施方案中，双链RNAi试剂具有约16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的双链体长度。

在某些实施方案中，有义链和反义链之间的完美、基本上或部分互补性的区域是16-26(例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26)个核苷酸长度并存在于反义链的5′末端处或附近(例如，该区域可以与反义链的5′末端间隔0、1、2、3或4个核苷酸，它们不是完美、基本上或部分地互补的)。

有义链和反义链各自含有16-23个核苷酸长度的核心段(在本文中也被称作“核心序列”或“核心段序列”)。反义链核心段与存在于HIF-2α(EPAS1)mRNA靶标中的核苷酸序列(有时称作，例如，靶序列)具有100％(完美)互补性或至少约85％(基本上)互补性。有义链核心段序列与反义链中的核心段序列具有100％(完美)互补性或至少约85％(基本上)互补性，且因而有义链核心段序列通常与存在于HIF-2αmRNA靶标中的核苷酸序列(靶序列)具有完美同一性或至少约85％同一性。有义链核心段序列可以是与对应反义核心序列相同的长度，或它可以是不同的长度。在某些实施方案中，所述反义链核心段序列是16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸长度。在某些实施方案中，所述有义链核心段序列是16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸长度。

用于形成HIF-2αRNAi试剂的核苷酸序列的例子提供在表2、3和4(以及4.1、4.2和4.3)中。包括表2、3和4中的有义链和反义链序列的RNAi试剂双链体的例子显示在表5中。

HIF-2αRNAi试剂有义链和反义链退火以形成双链体。HIF-2αRNAi试剂的有义链和反义链可以彼此部分地互补、基本上互补或完全互补。在互补双链体区域内，有义链核心段序列与反义核心段序列具有至少85％互补性或100％互补性。在某些实施方案中，有义链核心段序列含有至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23个核苷酸的序列，该序列与反义链核心段序列的对应16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸序列具有至少85％或100％互补性(例如，HIF-2αRNAi试剂的有义和反义核心段序列可以具有至少85％碱基配对或100％碱基配对的至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23个核苷酸的区域)。

在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂的反义链与表2或表3中的任何反义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂的有义链与表2或表4、4.1、4.2或4.3中的任何有义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。

有义链和/或反义链可以任选地和独立地在核心段序列的3′端、5′端或3′和5′端二者处含有另外的1、2、3、4、5或6个核苷酸(延伸段)。反义链另外核苷酸如果存在的话可以与或不与HIF-2αmRNA中的对应序列互补。有义链另外核苷酸如果存在的话可以与或不与HIF-2αmRNA中的对应序列相同。反义链另外核苷酸(如果存在的话)可以与或不与对应有义链的另外核苷酸(如果存在的话)互补。

本文中使用的延伸段包含在有义链核心段序列和/或反义链核心段序列的5'和/或3'末端处的1、2、3、4、5或6个核苷酸。在有义链上的延伸段核苷酸可以与或不与对应反义链中的核苷酸(核心段序列核苷酸或延伸段核苷酸)互补。相反，在反义链上的延伸段核苷酸可以与或不与在对应有义链中的核苷酸(核心段核苷酸或延伸段核苷酸)互补。在某些实施方案中，RNAi试剂的有义链和反义链含有3′和5′延伸段。在某些实施方案中，一条链的3′延伸段核苷酸中的一个或多个与另一条链的一个或多个5′延伸段核苷酸发生碱基配对。在其它实施方案中，一条链的3′延伸段核苷酸中的一个或多个不与另一条链的一个或多个5′延伸段核苷酸碱基配对。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有3′延伸段的反义链和具有5′延伸段的有义链。在某些实施方案中，所述延伸段核苷酸未配对并形成突出端。本文中使用的“突出端”表示位于有义链或反义链的末端端部处的一个或多个未配对核苷酸的段，其没有形成本文公开的RNAi试剂的杂交或双链化部分的一部分。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有1、2、3、4、5或6个核苷酸长度的3′延伸段的反义链。在其它实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有1、2或3个核苷酸长度的3′延伸段的反义链。在某些实施方案中，反义链延伸段核苷酸中的一个或多个包含与对应的HIF-2αmRNA序列互补的核苷酸。在某些实施方案中，反义链延伸段核苷酸中的一个或多个包含与对应的HIF-2αmRNA序列不互补的核苷酸。

在某些实施方案中，反义链的5’和/或3′末端可以包括脱碱基残基(Ab)，其还可以被称作“脱碱基位点”或“脱碱基核苷酸”。脱碱基残基(Ab)是缺乏在糖部分的1′位置处的核碱基的核苷酸或核苷(参见，例如，美国专利号5,998,203，其通过引用并入本文)。在某些实施方案中，脱碱基残基可以位于核苷酸序列内部。在某些实施方案中，可以将Ab或AbAb添加至反义链的3′末端。在某些实施方案中，有义链的5′末端可以包括一个或多个另外的脱碱基残基(例如，(Ab)或(AbAb))。在某些实施方案中，可以将UUAb、UAb或Ab添加至有义链的3′末端。在某些实施方案中，可以用核糖醇(脱碱基核糖)残基替换脱碱基(脱氧核糖)残基。

在某些实施方案中，所述有义链或所述反义链可以包括“末端帽”，其如本文中所使用是非核苷酸化合物或可以掺入在本文公开的RNAi试剂的链的一个或多个末端处的其它部分，且在某些情况下可以给RNAi试剂提供某些有益性能，例如，保护免于外切核酸酶降解。在某些实施方案中，添加倒置脱碱基残基(invAb)作为末端帽(参见表7)。(参见，例如，F.Czauderna,Nucleic Acids Res.,2003,31(11),2705-16)。末端帽通常是本领域已知的，且包括，例如，倒置脱碱基残基以及碳链诸如末端C₃H₇(丙基)、C₆H₁₃(己基)或C₁₂H₂₅(十二烷基)基团。在某些实施方案中，末端帽存在于有义链的5′末端端部、3′末端端部或5′和3′末端端部二者处。在某些实施方案中，有义链的3′末端可以包括另外的脱碱基残基或倒置脱碱基末端帽。

在某些实施方案中，将一个或多个倒置脱碱基残基(invAb)添加至有义链的3′末端。在某些实施方案中，将一个或多个倒置脱碱基残基(invAb)添加至有义链的5′末端。在某些实施方案中，将一个或多个倒置脱碱基残基或倒置脱碱基位点插入在靶向配体和RNAi试剂的有义链的核苷酸序列之间。在某些实施方案中，一个或多个倒置脱碱基残基或倒置脱碱基位点在RNAi试剂的有义链的一个或多个末端端部处或附近的包含允许增强RNAi试剂的活性或其它期望性能。

在某些实施方案中，将一个或多个倒置脱碱基残基(invAb)添加至有义链的5′末端。在某些实施方案中，可以将一个或多个倒置脱碱基残基插入在靶向配体和RNAi试剂的有义链的核苷酸序列之间。在某些实施方案中，一个或多个倒置脱碱基残基在RNAi试剂的有义链的一个或多个末端端部处或附近的包含可能允许增强RNAi试剂的活性或其它期望性能。在某些实施方案中，可以用倒置核糖醇(脱碱基核糖)残基替换倒置脱碱基(脱氧核糖)残基。

在某些实施方案中，反义链核心段序列的3′末端或反义链序列的3′末端可以包括倒置脱碱基残基(invAb(参见表7))。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有1、2、3、4或5个核苷酸长度的3′延伸段的有义链。在某些实施方案中，有义链延伸段核苷酸中的一个或多个包含腺苷、尿嘧啶或胸苷核苷酸、AT二核苷酸或与HIF-2αmRNA序列中的核苷酸对应或相同的核苷酸。在某些实施方案中，3′有义链延伸段包括下述序列之一或由下述序列之一组成，但不限于此：T、UT、TT、UU、UUT、TTT或TTTT(各自以5′至3′列出)。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有1、2、3、4、5或6个核苷酸长度的5′延伸段的有义链。在某些实施方案中，有义链延伸段核苷酸中的一个或多个包含与HIF-2αmRNA序列中的核苷酸对应或相同的核苷酸。在某些实施方案中，所述有义链5′延伸段是下述序列之一，但不限于：CA、AUAGGC、AUAGG、AUAG、AUA、A、AA、AC、GCA、GGCA、GGC、UAUCA、UAUC、UCA、UAU、U、UU(各自以5′至3′列出)。有义链可以具有3′延伸段和/或5'延伸段。

用于形成HIF-2αRNAi试剂的序列的例子提供在表2、3和4、4.1、4.2和4.3中。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链包括在表2或3中的任一个序列的序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链包含表3中的任一个修饰的序列或由其组成。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链包括表2或3中的任一个序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)1-17、2-15、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21或2-21的序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂有义链包括表2或4中的任一个序列的序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂有义链包括表2或4中的任一个序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)1-18、1-19、1-20、1-21、2-19、2-20、2-21、3-20、3-21或4-21的序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂有义链包含表4、4.1、4.2或4.3中的任一个修饰的序列的修饰的序列或由其组成。

在某些实施方案中，本文描述的RNAi试剂的有义链和反义链含有相同数目的核苷酸。在某些实施方案中，本文描述的RNAi试剂的有义链和反义链含有不同数目的核苷酸。在某些实施方案中，RNAi试剂的有义链5′末端和反义链3′末端形成平头末端。在某些实施方案中，RNAi试剂的有义链3′末端和反义链5′末端形成平头末端。在某些实施方案中，RNAi试剂的两个末端形成平头末端。在某些实施方案中，RNAi试剂的任一个末端都不是平端。本文中使用的“平头末端”表示双链RNAi试剂的末端，其中两条退火链的末端核苷酸是互补的(形成互补碱基对)。

在某些实施方案中，RNAi试剂的有义链5′末端和反义链3′末端形成翻口末端(frayed end)。在某些实施方案中，RNAi试剂的有义链3′末端和反义链5′末端形成翻口末端。在某些实施方案中，RNAi试剂的两个末端形成翻口末端。在某些实施方案中，RNAi试剂的任一个末端都不是翻口末端。本文中使用的翻口末端表示双链RNAi试剂的末端，其中两条退火链的末端核苷酸形成对(没有形成突出端)，但不是互补的(形成非互补对)。在某些实施方案中，在双链RNAi试剂的一条链的末端处的一个或多个未配对核苷酸形成突出端。未配对核苷酸可以是在有义链或反义链上，从而建立3'或5'突出端。在某些实施方案中，所述RNAi试剂含有：一个平头末端和一个翻口末端，一个平头末端和一个5′突出末端，一个平头末端和一个3′突出末端，一个翻口末端和一个5′突出末端，一个翻口末端和一个3′突出末端，两个5′突出末端，两个3′突出末端，一个5′突出末端和一个3′突出末端，两个翻口末端，或两个平头末端。通常，当存在时，突出端位于有义链、反义链、或有义链和反义链二者的3’末端端部处。

当用在不同的多核苷酸或寡核苷酸构建体中时，修饰的核苷酸可以保留化合物在细胞中的活性，并同时增加这些化合物的血清稳定性，并且也可以最小化在施用多核苷酸或寡核苷酸构建体后在人类中活化干扰素活性的可能性。

在某些实施方案中，将HIF-2αRNAi试剂制备或提供为盐、混合的盐或游离酸。在某些实施方案中，将HIF-2αRNAi试剂制备为钠盐。本领域众所周知的这样的形式是在本文公开的发明的范围内。

定义

本文中使用的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，其中每个可以独立地修饰或未修饰。

本文中使用的“RNAi试剂”(也被称作“RNAi触发剂”)是指含有RNA或RNA-样(例如，化学修饰的RNA)寡核苷酸分子的组合物，其能够以序列特异性方式降解或抑制(例如，在适当的条件下降解或抑制)靶mRNA的信使RNA(mRNA)转录物的翻译。本文中使用的RNAi试剂可以如下起作用：通过RNA干扰机制(例如，通过与哺乳动物细胞的RNA干扰途径机制(RNA诱导的沉默复合物或RISC)的相互作用而诱导RNA干扰)，或通过替代机制或途径。尽管据信，正如在本文中使用的该术语，RNAi试剂主要通过RNA干扰机制起作用，但是公开的RNAi试剂不受任何特定途径或作用机理约束或限于此。本文公开的RNAi试剂包含有义链和反义链，且包括、但不限于：短的(或小的)干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和dicer底物。本文描述的RNAi试剂的反义链与被靶向的mRNA(HIF-2αmRNA)至少部分地互补。RNAi试剂可以包括一个或多个修饰的核苷酸和/或一个或多个非-磷酸二酯键。

当提及给定基因的表达时，本文中使用的术语“沉默”、“减少”、“抑制”、“下调”或“敲低”是指，当用本文描述的RNAi试剂处理细胞、细胞集合、组织、器官或受试者时，与没有如此处理的第二细胞、细胞集合、组织、器官或受试者相比，所述基因的表达减少，这通过在其中转录所述基因的细胞、细胞集合、组织、器官或受试者中从所述基因转录的RNA的水平或从mRNA翻译的多肽、蛋白或蛋白亚基的水平来测量。

本文中使用的术语“序列”和“核苷酸序列”是指使用标准命名法用连续字母描述的核碱基或核苷酸的系列或顺序。

本文中使用的“碱基”、“核苷酸碱基”或“核碱基”是作为核苷酸的组分的杂环嘧啶或嘌呤化合物，并且包括初级嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤以及初级嘧啶碱基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核碱基可进一步修饰为包括、但不限于通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基和氟化的碱基(参见，例如，Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.编Wiley-VCH,2008)。这样的经修饰的核碱基(包括包含经修饰的核碱基的亚磷酰胺化合物)的合成是本领域已知的。

如本文中使用的和除非另有说明，否则术语“互补的”当用于相对于第二核碱基或核苷酸序列(例如，RNAi试剂反义链或单链反义寡核苷酸)描述第一核碱基或核苷酸序列(例如，RNAi试剂有义链或靶向的mRNA)时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交(在哺乳动物生理条件(或类似的体外条件)下形成碱基对氢键)和在某些标准条件下形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包含沃森-克里克碱基对或非沃森-克里克碱基对，并且至少在满足以上杂交要求的程度上包含天然的或修饰的核苷酸或核苷酸模仿物。序列同一性或互补性与修饰无关。例如，为了确定同一性或互补性的目的，本文定义的a和Af与U(或T)互补并且与A相同。

本文中使用的“完美互补”或“完全互补”是指，在核碱基或核苷酸序列分子的杂交对中，第一寡核苷酸的连续序列中的所有(100％)碱基将与第二寡核苷酸的连续序列中的相同数目的碱基杂交。连续序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。

本文中使用的“部分互补”是指，在核碱基或核苷酸序列分子的杂交对中，第一寡核苷酸的连续序列中的至少70％(但不是全部)碱基将与第二寡核苷酸的连续序列中的相同数目的碱基杂交。连续序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。

本文中使用的“基本上互补”是指，在核碱基或核苷酸序列分子的杂交对中，第一寡核苷酸的连续序列中的至少85％(但不是全部)的碱基将与第二寡核苷酸的连续序列中的相同数目的碱基杂交。连续序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。

如本文中使用的，关于RNAi试剂的有义链与反义链之间或RNAi试剂的反义链与HIF-2α(EPAS1)mRNA的序列之间的核碱基或核苷酸匹配使用术语“互补”、“完全互补”、“部分互补”和“基本上互补”。

本文中使用的如应用于核酸序列的术语“基本上相同”或“基本上具有同一性”是指，与参照序列相比，核苷酸序列(或核苷酸序列的一部分)具有至少约85％序列同一性或更高，例如，至少90％、至少95％或至少99％同一性。通过在对比窗中对比两个最佳比对的序列来确定序列同一性的百分比。如下计算百分比：确定两个序列中出现相同类型的核酸碱基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较的窗口中位置的总数目并将该结果乘以100以产生序列同一性的百分比。本文公开的发明涵盖与本文公开的那些基本上相同的核苷酸序列。

本文中使用的术语“治疗”、“处理”等是指用来提供受试者中的疾病的一种或多种症状的数目、严重程度和/或频率的缓解或减轻的方法或步骤。本文中使用的“治疗”和“处理”可以包括受试者中的疾病的一种或多种症状的数目、严重程度和/或频率的预防性治疗、管理、预防性治疗和/或抑制或减少。

当提及RNAi试剂时，本文中使用的短语“引入到细胞中”是指将RNAi试剂功能性地递送进细胞中。短语“功能性递送”是指，以使RNAi试剂具有预期的生物学活性(例如，基因表达的序列特异性抑制)的方式将RNAi试剂递送给细胞。

本文中使用的术语“异构体”表示这样的化合物：其具有相同的分子式，但其原子的键合性质或顺序或其原子在空间中的排列不同。其原子在空间中的排列不同的异构体被称为“立体异构体”。不是彼此镜像的立体异构体被称为“非对映异构体”，且为不可重叠镜像的立体异构体被称为“对映异构体”或有时被称为光学异构体。与4个不同取代基键合的碳原子被称为“手性中心”。

如本文中使用的，除非在结构中特别鉴定为具有特定构象，否则对于其中存在不对称中心并因此产生对映异构体、非对映异构体或其它立体异构构型的每种结构，本文公开的每个结构意图代表所有这样的可能的异构体，包括其光学纯的和外消旋的形式。例如，本文公开的结构意图涵盖非对映异构体的混合物以及单一立体异构体。

在本文权利要求中使用的短语“由……组成”不包括在权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文权利要求中使用时，短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限于指定的材料或步骤和不会实质上影响要求保护的发明的基本和新特征的那些。

本领域普通技术人员将易于理解和意识到，根据化合物或组合物所处的环境，本文公开的化合物和组合物可具有处于质子化或去质子化状态的某些原子(例如，N、O或S原子)。因此，如本文中使用的，本文公开的结构设想某些官能团(例如，OH、SH或NH)可被质子化或去质子化。如本领域普通技术人员易于理解的，本文公开内容意图涵盖所公开的化合物和组合物，不论它们基于环境(诸如pH)的质子化状态如何。

当提及两个化合物或分子之间的连接时，本文中使用的术语“连接”或“缀合”是指，两个分子通过共价键结合或通过非共价键(例如，氢键或离子键)结合。在某些实施例中，其中术语“连接”或“缀合”表示两个分子之间通过非共价键的结合，两个不同分子之间的结合在生理上可接受的缓冲液(例如，缓冲盐水)中具有小于1x10^-4M(例如，小于1x10^-5M、小于1x10^-6M或小于1x10^-7M)的K_D。除非另有说明，否则本文所用的术语“连接”和“缀合”可以表示具有或不具有任何插入原子或原子团的第一化合物和第二化合物之间的连接。

本文中使用的连接基团是一个或多个原子，其将一个分子或分子的一部分连接至第二分子或分子的第二部分。类似地，如本领域中所使用的，术语支架有时与连接基团互换使用。连接基团可包含任何数目的原子或官能团。在某些实施方案中，连接基团可能不促进任何生物或药物应答，而仅仅用于连接两个生物活性分子。

除非另有说明，否则本文所使用的符号的应用意指，根据本文所述发明范围的任何一个或多个基团可连接其上。

本文中使用的术语“包括”在本文中用于指短语“包括、但不限于”，并且与该短语互换使用。除非上下文另外清楚地指出，否则术语“或”在本文中用于表示术语“和/或”，并且与该术语互换使用。

如本文权利要求书中所使用的，短语“由……组成”不包括在权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文权利要求中使用时，短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限于指定的材料或步骤和不会实质上影响要求保护的发明的基本和新特征的那些。

修饰的核苷酸

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂含有一个或多个修饰的核苷酸。本文中使用的“修饰的核苷酸”是除了核糖核苷酸(2′-羟基核苷酸)以外的核苷酸。在某些实施方案中，至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的核苷酸是修饰的核苷酸。本文中使用的修饰的核苷酸可以包括、但不限于：脱氧核糖核苷酸、核苷酸模仿物、脱碱基核苷酸、2′-修饰的核苷酸、倒置核苷酸、包含修饰的核碱基的核苷酸、桥连核苷酸、肽核酸(PNA)、2′,3′-开环核苷酸模仿物(解锁的核碱基类似物)、锁定核苷酸、3′-O-甲氧基(2′核苷间连接的)核苷酸、2'-F-阿拉伯糖核苷酸、5'-Me、2'-氟核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、含有乙烯基膦酸酯的核苷酸和含有环丙基膦酸酯的核苷酸。2′-修饰的核苷酸(即，在五元糖环的2′位置具有除了羟基以外的基团的核苷酸)包括、但不限于：2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸(在本文中也被称作2′-脱氧-2′-氟核苷酸)、2′-脱氧核苷酸、2′-甲氧基乙基(2′-O-2-甲氧基乙基)核苷酸(也被称作2′-MOE)、2′-氨基核苷酸和2′-烷基核苷酸。给定化合物中的所有位置不一定均匀修饰。相反地，可在单个HIF-2αRNAi试剂中或甚至在其单个核苷酸中掺入超过一种修饰。通过本领域已知的方法可以合成和/或修饰HIF-2αRNAi试剂有义链和反义链。在一个核苷酸处的修饰独立于在另一个核苷酸处的修饰。

经修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，诸如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(例如，2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶或5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-烷基(例如，6-甲基、6-乙基、6-异丙基或6-正丁基)衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-烷基(例如，2-甲基、2-乙基、2-异丙基或2-正丁基)和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫基烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(例如，5-溴)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

在某些实施方案中，RNAi试剂的所有的或基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸。如本文中使用的，其中存在的基本上所有核苷酸均是修饰的核苷酸的RNAi试剂是在有义链和反义链两者中具有的四个或更少(即0、1、2、3或4)个核苷酸均为核糖核苷酸(未修饰)的RNAi试剂。如本文中使用的，其中存在的基本上所有核苷酸均是修饰核苷酸的有义链是在有义链中具有的两个或更少(即0、1或2)个核苷酸为未修饰的核糖核苷酸的有义链。如本文中使用的，其中存在的基本上所有核苷酸均是修饰核苷酸的反义链是在反义链中具有的两个或更少(即0、1或2)个核苷酸为未修饰的核糖核苷酸的反义链。在某些实施方案中，RNAi试剂的一个或多个核苷酸为未修饰的核糖核苷酸。

如本文别处提及的，在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂可以连接至RNAi试剂的有义链或反义链的内部核苷酸上的一种或多种靶向配体和/或一种或多种PK增强剂，以促进HIF-2αRNAi试剂的体内递送。在某些实施方案中，所述靶向配体或PK增强剂连接或缀合至HIF-2αRNAi试剂的有义链的一个或多个内部核苷酸。例如，靶向配体可以连接至在核糖环的2’位置、核糖环的3’位置、核糖环的1’位置处的单个核苷酸，或连接至核苷酸的核碱基、核糖环的4’位置、核苷酸的5’位置，或连接至核糖环上的氧原子。以下描绘了一种假定的核糖核苷酸，其中将碳编号：

在某些实施方案中，为了促进一种或多种靶向配体与内部核苷酸的连接，将2’-O-炔丙基修饰的核苷酸掺入核苷酸序列(参见，例如，表7和表4、4.1、4.2和4.3)中。合成各个链后，使用本领域已知的标准偶联技术，可以将2’-O-炔丙基修饰的核苷酸在2’位置连接或缀合至靶向配体、靶向基团和/或PK增强剂。

在某些实施方案中，可以合成本文公开的HIF-2αRNAi试剂以在有义链中具有至少一个2’-O-炔丙基修饰的核苷酸，以促进与靶向配体或靶向基团的连接。在某些实施方案中，合成RNAi试剂的有义链以包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或超过10个2’-O-炔丙基修饰的核苷酸，以促进至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或超过10个靶向配体和/或靶向基团与内部核苷酸的连接。在某些实施方案中，可以合成本文公开的HIF-2αRNAi试剂，在有义链中具有一个2’-O-炔丙基修饰的核苷酸。在某些实施方案中，可以合成本文公开的HIF-2αRNAi试剂，在有义链中具有2个2’-O-炔丙基修饰的核苷酸。在某些实施方案中，可以合成本文公开的HIF-2αRNAi试剂，在有义链中具有3个2’-O-炔丙基修饰的核苷酸。在某些实施方案中，可以合成本文公开的HIF-2αRNAi试剂，在有义链中具有4个2’-O-炔丙基修饰的核苷酸。在某些实施方案中，可以合成本文公开的HIF-2αRNAi试剂，在有义链中具有5个2’-O-炔丙基修饰的核苷酸。在某些实施方案中，可以合成本文公开的HIF-2αRNAi试剂，在有义链中具有超过5个2’-O-炔丙基修饰的核苷酸。

修饰的核苷间连接

在某些实施方案中，通过非标准键或主链(例如，修饰的核苷间连接或修饰的主链)连接HIF-2αRNAi试剂的一个或多个核苷酸。修饰的核苷间连接或主链包括、但不限于：硫代磷酸酯基(在本文中表示为小写字体“s”)、手性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如，甲基膦酸酯或3′-亚烷基膦酸酯)、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯(例如，3′-氨基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯或硫羰氨基磷酸酯)、硫羰烷基-膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、吗啉代连接、具有正常3′-5′连接的硼代磷酸酯、硼代磷酸酯的2′-5′连接的类似物或具有倒置极性的硼代磷酸酯，其中相邻的核苷单元对连接3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′。在某些实施方案中，修饰的核苷间连接或主链缺少磷原子。缺少磷原子的修饰的核苷间连接包括、但不限于短链烷基或环烷基糖间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间连接、或者一个或多个短链杂原子或杂环糖间连接。在某些实施方案中，修饰的核苷间主链包括、但不限于硅氧烷主链、硫化物主链、亚砜主链、砜主链、甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链、亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链、含烯烃的主链、氨基磺酸酯主链、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链、磺酸酯和磺酰胺主链、酰胺主链和其它具有混合的N、O、S和CH₂组分的主链。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂的有义链可以含有1、2、3、4、5或6个硫代磷酸酯键，HIF-2αRNAi试剂的反义链可以含有1、2、3、4、5或6个硫代磷酸酯键，或者有义链和反义链两者均可独立地含有1、2、3、4、5或6个硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂的有义链可以含有1、2、3或4个硫代磷酸酯键，HIF-2αRNAi试剂的反义链可以含有1、2、3或4个硫代磷酸酯键，或者有义链和反义链两者均可独立地含有1、2、3或4个硫代磷酸酯键。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂有义链含有至少2个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，所述至少2个硫代磷酸酯核苷间连接位于从有义链的3′末端开始1-3位的核苷酸之间。在某些实施方案中，一个硫代磷酸酯核苷间连接位于有义链的5′末端，且另一个硫代磷酸酯键位于有义链的3′末端。在某些实施方案中，两个硫代磷酸酯核苷间连接位于有义链的5’末端，且另一个硫代磷酸酯键位于有义链的3’末端。在某些实施方案中，有义链不包括在核苷酸之间的任何硫代磷酸酯核苷间连接，但是含有在5’和3’末端上的末端核苷酸之间的1、2或3个硫代磷酸酯键，且任选地存在倒置脱碱基残基端帽。在某些实施方案中，靶向配体经由硫代磷酸酯键而连接至有义链。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链含有4个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方案中，4个硫代磷酸酯核苷间连接位于从反义链的5'末端开始1-3位的核苷酸之间，和从5'末端开始在位置19-21、20-22、21-23、22-24、23-25或24-26处的核苷酸之间。在某些实施方案中，3个硫代磷酸酯核苷间连接位于从反义链的5’末端开始的位置1-4之间，且第四个硫代磷酸酯核苷间连接位于从反义链的5’末端开始的位置20-21之间。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂在反义链中含有至少3或4个硫代磷酸酯核苷间连接。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂含有一个或多个修饰的核苷酸和一个或多个修饰的核苷间连接。在某些实施方案中，将2′-修饰的核苷与修饰的核苷间连接组合。

HIF-2αRNAi试剂

在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂靶向在表1所示的HIF-2α基因序列的位置处或附近的HIF-2α基因。在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂的反义链包括核心段序列，其与表1公开的靶HIF-2α19-聚体序列完全、基本上或至少部分地互补。

表1.HIF-2α19-聚体mRNA靶序列(取自智人内皮PAS结构域蛋白1(EPAS1或HIF-2α)转录物,GenBank NM_001430.4(SEQ ID NO:1))

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包括反义链，其中反义链(5′→3′)的位置19能够与在表1中公开的19-聚体靶序列的位置1形成碱基对。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包括反义链，其中反义链(5′→3′)的位置1能够与在表1中公开的19-聚体靶序列的位置19形成碱基对。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包括反义链，其中反义链(5′→3′)的位置2能够与在表1中公开的19-聚体靶序列的位置18形成碱基对。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包括反义链，其中反义链(5′→3′)的位置2至18能够与位于在表1中公开的19-聚体靶序列的位置18至2处的各个互补碱基中的每一个形成碱基对。

对于本文公开的RNAi试剂，在反义链(从5′末端→3′末端)的位置1处的核苷酸可以与HIF-2α基因完全互补，或可以不与HIF-2α基因互补。在某些实施方案中，在反义链(从5′末端→3′末端)的位置1处的核苷酸是U、A或dT。在某些实施方案中，在反义链(从5′末端→3′末端)的位置1处的核苷酸与有义链形成A:U或U:A碱基对。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链包含表2或表3中的任一个反义链序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)2-18或2-19的序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi有义链包含表2或表4、4.1、4.2或4.3中的任一个有义链序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)1-17、1-18或2-18的序列。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含：(i)反义链，其包含表2或表3中的任一个反义链序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)2-18或2-19的序列；和(ii)有义链，其包含表2或表4、4.1、4.2或4.3中的任一个有义链序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)1-17或1-18的序列。

在某些实施方案中，所述HIF-2αRNAi试剂包括下面表2所示的核心19-聚体核苷酸序列。

包含表2中的序列或由其组成的HIF-2αRNAi试剂有义链和反义链可以是修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸。在某些实施方案中，具有有义和反义链序列(其包含表2中的序列或由其组成)的HIF-2αRNAi试剂都是或基本上都是修饰的核苷酸。

在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂的反义链与表2中的任一个反义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂的有义链与表2中的任一个有义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。

如本文中使用的，在表2公开的序列中所列的各N可独立地选自任何和所有核碱基(包括在修饰的和未修饰的核苷酸上发现的那些)。在某些实施方案中，在表2公开的序列中所列的N核苷酸具有与另一条链上对应位置处的N核苷酸互补的核碱基。在某些实施方案中，在表2公开的序列中所列的N核苷酸具有与另一条链上对应位置处的N核苷酸不互补的核碱基。在某些实施方案中，在表2公开的序列中所列的N核苷酸具有与另一条链上对应位置处的N核苷酸相同的核碱基。在某些实施方案中，在表2公开的序列中所列的N核苷酸具有与另一条链上对应位置处的N核苷酸不同的核碱基。

某些修饰的HIF-2αRNAi试剂反义链、以及其基础的未修饰的核碱基序列提供在表3中。某些修饰的HIF-2αRNAi试剂有义链、以及其基础的未修饰的核碱基序列提供在表4中(以及反映在4.1、4.2和4.3中)。在形成HIF-2αRNAi试剂时，在表3和4以及上述表2中所列的基础碱基序列各自中的每个核苷酸可以是修饰的核苷酸。

本文所述的HIF-2αRNAi试剂通过使反义链与有义链退火而形成。含有表2或表4、4.1、4.2或4.3中所列的序列的有义链可以与含有表2或表3中所列的序列的任何反义链杂交，条件是两个序列在连续16、17、18、19、20或21个核苷酸序列上具有至少85％互补性的区域。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链包含表2或表3中的任一个序列的核苷酸序列。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含双链体或由双链体组成，所述双链体具有表2、表3或表4、4.1、4.2或4.3中的任一个序列的有义链和反义链的核碱基序列。

含有修饰的核苷酸的反义链的例子提供在表3中。含有修饰的核苷酸的有义链的例子提供在表4中。

如表3和4和4.1、4.2和4.3中所用的，使用以下注释指示修饰的核苷酸、靶向基团和连接基团：

A ＝腺苷-3′-磷酸酯；

C ＝胞苷-3′-磷酸酯；

G ＝鸟苷-3′-磷酸酯；

U ＝尿苷-3′-磷酸酯

I ＝肌苷-3′-磷酸酯

a ＝2′-O-甲基腺苷-3′-磷酸酯

as ＝2′-O-甲基腺苷-3′-硫代磷酸酯

c ＝2′-O-甲基胞苷-3′-磷酸酯

cs ＝2′-O-甲基胞苷-3′-硫代磷酸酯

g ＝2′-O-甲基鸟苷-3′-磷酸酯

gs ＝2′-O-甲基鸟苷-3′-硫代磷酸酯

t ＝2′-O-甲基-5-甲基尿苷-3′-磷酸酯

ts ＝2′-O-甲基-5-甲基尿苷-3′-硫代磷酸酯

u ＝2′-O-甲基尿苷-3′-磷酸酯

us ＝2′-O-甲基尿苷-3′-硫代磷酸酯

i ＝2′-O-甲基肌苷-3′-磷酸酯

is ＝2′-O-甲基肌苷-3′-硫代磷酸酯

Af ＝2′-氟腺苷-3′-磷酸酯

Afs ＝2′-氟腺苷-3′-硫代磷酸酯

Cf ＝2′-氟胞苷-3′-磷酸酯

Cfs ＝2′-氟胞苷-3′-硫代磷酸酯

Gf ＝2′-氟鸟苷-3′-磷酸酯

Gfs ＝2′-氟鸟苷-3′-硫代磷酸酯

Tf ＝2′-氟-5′-甲基尿苷-3′-磷酸酯

Tfs ＝2′-氟-5′-甲基尿苷-3′-硫代磷酸酯

Uf ＝2′-氟尿苷-3′-磷酸酯

Ufs ＝2′-氟尿苷-3′-硫代磷酸酯

dA ＝2′-脱氧腺苷-3′-磷酸酯

dAs ＝2′-脱氧腺苷-3′-硫代磷酸酯

dC ＝2′-脱氧胞苷-3′-磷酸酯

dCs ＝2′-脱氧胞苷-3′-硫代磷酸酯

dG ＝2′-脱氧鸟苷-3′-磷酸酯

dGs ＝2′-脱氧鸟苷-3′-硫代磷酸酯

dT ＝2′-脱氧胸苷-3′-磷酸酯

dTs ＝2′-脱氧胸苷-3′-硫代磷酸酯

dU ＝2′-脱氧尿苷-3′-磷酸酯

dUs ＝2′-脱氧尿苷-3′-硫代磷酸酯

A_UNA ＝2′,3′-开环-腺苷-3′-磷酸酯

A_UNAs ＝2′,3′-开环-腺苷-3′-硫代磷酸酯

C_UNA ＝2′,3′-开环-胞苷-3′-磷酸酯

C_UNAs ＝2′,3′-开环-胞苷-3′-硫代磷酸酯

G_UNA ＝2′,3′-开环-鸟苷-3′-磷酸酯

G_UNAs ＝2′,3′-开环-鸟苷-3′-硫代磷酸酯

U_UNA ＝2′,3′-开环-尿苷-3′-磷酸酯

U_UNAs ＝2′,3′-开环-尿苷-3′-硫代磷酸酯

aAlk ＝2′-O-炔丙基腺苷-3′-磷酸酯，参见表7

aAlks ＝2′-O-炔丙基腺苷-3′-硫代磷酸酯，参见表7

cAlk ＝2′-O-炔丙基胞苷-3′-磷酸酯，参见表7

cAlks ＝2′-O-炔丙基胞苷-3′-硫代磷酸酯，参见表7

gAlk ＝2′-O-炔丙基鸟苷-3′-磷酸酯，参见表7

gAlks ＝2′-O-炔丙基鸟苷-3′-硫代磷酸酯，参见表7

tAlk ＝2′-O-炔丙基-5-甲基尿苷-3′-磷酸酯，参见表7

tAlks ＝2′-O-炔丙基-5-甲基尿苷-3′-硫代磷酸酯，参见表7

uAlk ＝2′-O-炔丙基尿苷-3′-磷酸酯，参见表7

uAlks ＝2′-O-炔丙基尿苷-3′-硫代磷酸酯，参见表7

a_2N ＝参见表7

a_2Ns ＝参见表7

(invAb) ＝倒置脱碱基脱氧核糖核苷酸，参见表7

(invAb)s ＝倒置脱碱基脱氧核糖核苷酸-5′-硫代磷酸酯，参见表7

s ＝硫代磷酸酯键

(C6-SS-Alk) ＝参见表7

(C6-SS-C6) ＝参见表7

(C3-SS-C3) ＝参见表7

(6-SS-6) ＝参见表7

(NH2-C6) ＝参见表7

(C6-NH2) ＝参见表7

(TriAlk#) ＝参见表7

(TriAlk#)s ＝参见表7

如本领域普通技术人员将容易地理解的，除非通过序列(例如，通过硫代磷酸酯键“s”)另外指明，否则当存在于寡核苷酸中时，核苷酸单体通过5'-3'-磷酸二酯键相互连接。如本领域普通技术人员清楚地理解的，包括如本文公开的修饰的核苷酸序列中所示的硫代磷酸酯键替代通常存在于寡核苷酸中的磷酸二酯键。此外，本领域普通技术人员将容易地理解，在给定寡核苷酸序列的3’末端处的末端核苷酸将通常在给定单体的相应3'位置处具有羟基(-OH)基团而非离体磷酸酯部分。另外，对于本文公开的实施方案，当以5’→3’观察各条链时，插入倒置脱碱基，使得脱氧核糖的3’位置连接在各条链上的在先单体的3’末端。此外，如普通技术人员容易地理解和明白的，尽管本文描述的硫代磷酸酯化学结构通常显示在硫原子上的阴离子，但本文公开的发明涵盖所有硫代磷酸酯互变异构体(例如，其中硫原子具有双键且阴离子是在氧原子上)。除非本文另外明确指出，否则当描述本文公开的HIF-2αRNAi试剂和HIF-2αRNAi试剂的组合物时，使用本领域普通技术人员的此类理解。

与本文公开的HIF-2αRNAi试剂一起使用的连接基团的某些具体例子提供在下面表7中。本文也公开了可以连接或缀合至本文公开的HIF-2αRNAi试剂的靶向配体和/或靶向基团和PK增强剂的某些例子。例如，某些实例PK增强化合物提供在下面表6中。此外，在某些实施方案中，所述PK增强剂可以位于HIF-2αRNAi试剂的有义链的3’末端端部处。

连接基团包括、但不限于以下，它们的化学结构提供在下面表7中：(NH2-C6)、(C6-NH2)、(C6-SS-C6)、(6-SS-6)、(TriAlk1)、(TriAlk1)s、(TriAlk2)、(TriAlk2)s、(TriAlk3)、(TriAlk3)s、(TriAlk4)、(TriAlk4)s、(TriAlk5)、(TriAlk5)s、(TriAlk6)、(TriAlk6)s、(TriAlk7)、(TriAlk7)s、(TriAlk8)、(TriAlk8)s、(TriAlk9)、(TriAlk9)s、(TriAlk10)、(TriAlk10)s、(TriAlk11)、(TriAlk11)s、(TriAlk12)、(TriAlk12)s、(TriAlk13)、(TriAlk13)s、(TriAlk14)或(TriAlk14)s。每个有义链和/或反义链可以具有缀合至序列的5′和/或3′末端的本文列出的任何靶向配体或靶向基团、连接基团和/或PK增强剂、以及其它靶向配体/基团、其它连接基团和/或其它PK增强剂。

如在上面表4中所示，显示了许多实例HIF-2α核苷酸序列以进一步包括在有义链的核苷酸序列的5’末端端部、3’末端端部或5’和3’末端端部两者处的反应性连接基团。例如，上表4中显示的几个HIF-2α核苷酸序列具有在核苷酸序列的5’末端处的(NH2-C6)连接基团或(TriAlk)连接基团。类似地，上表4中显示的几个HIF-2α核苷酸序列具有在核苷酸序列的3’末端处的(C6-SS-C6)或(6-SS-6)连接基团。这样的反应性连接基团定位成促进靶向配体、靶向基团和/或PK增强剂与本文公开的HIF-2αRNAi试剂的连接。连接或缀合反应是本领域众所周知的，并提供了两个分子或反应物之间共价键的形成。用于本文本发明范围的合适的缀合反应包括、但不限于酰胺偶联反应、迈克尔加成反应、腙形成反应和点击化学环加成反应。

在某些实施方案中，靶向配体可以合成为四氟苯基(TFP)酯，其可以被反应性氨基(例如，NH2-C6)置换以将靶向配体连接至本文公开的HIF-2αRNAi试剂。在某些实施方案中，靶向配体被合成为叠氮化物，其可以缀合至炔丙基或DBCO基团，例如通过点击化学环加成反应。

另外，合成了几个核苷酸序列，在有义链的3’末端端部具有dT核苷酸，然后是(3’→5’)接头(例如，C6-SS-C6)，其在某些实施方案中可以在从树脂上切割下来后用于促进与另外组分(例如，PK增强剂或一种或多种靶向配体)的连接。以这种方式进行的合成涉及将dT连接至树脂，然后偶联接头和有义链的其余核苷酸。如本文所述，在缀合期望的PK增强剂(或靶向配体)后，末端dT从分子上切割下来。下面的表4.1显示了在上面表4中鉴定的核苷酸序列，但不包括3’末端dT核苷酸。

此外，下面的表4.2显示了在上面表4中鉴定的核苷酸序列，但是不存在末端连接基团。

如本文所讨论的，在某些实施方案中，将一种或多种靶向配体和/或PK增强剂连接或缀合至RNAi试剂。在某些实施方案中，将靶向配体(或靶向基团)和/或PK增强剂连接至有义链的5’末端、有义链的3’末端和/或一个或多个内部核苷酸。可以设计有义链和/或反义链的合成，使得反应基团易于获得以促进与另外组分(诸如靶向配体或PK增强剂)的连接。下面表4.3描绘了在与一种或多种靶向配体和/或PK增强剂(在下面共同显示为Z)连接后，在上面表4中公开的HIF-2αRNAi试剂的有义链。

表4.3.显示靶向配体和/或PK增强剂位置的HIF-2αRNAi试剂有义链序列

(每个X、Y和Z独立地是药理学部分(例如，靶向配体、靶向基团和/或PK增强剂)；(Z)₃＝连接的三个配体(例如，三齿靶向基团)；u^Z、a^Z、g^Z和c^Z分别代表尿苷、腺苷、鸟苷和胞苷，其中药理学部分(例如，靶向配体、靶向基团和/或PK增强剂)连接至核苷酸的2’位置(其对于在本文实施例中公开的HIF-2αRNAi试剂而言通过偶联至2’-O-炔丙基而结束。)

本文描述的HIF-2αRNAi试剂通过使反义链与有义链退火而形成。含有表2或表4(或4.1、4.2或4.3)中所列的序列的有义链可以与含有表2或表3中所列的序列的任何反义链杂交，条件是两个序列在连续16、17、18、19、20或21个核苷酸序列上具有至少85％互补性的区域。

在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂的反义链与表3中的任一个反义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。在某些实施方案中，本文公开的HIF-2αRNAi试剂的有义链与表4中的任一个有义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链包含表2或表3中的任一个序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链包含表2或表3中的任一个序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)1-17、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21、2-21、1-22、2-22、1-23、2-23、1-24或2-24的序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链包含表3中的任一个修饰的序列的修饰的序列或由其组成。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂有义链包含表2或表4(或表4.1、4.2或4.3)中的任一个序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂有义链包含表2或表4(或表4.1、4.2或4.3)中的任一个序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)1-17、2-17、3-17、4-17、1-18、2-18、3-18、4-18、1-19、2-19、3-19、4-19、1-20、2-20、3-20、4-20、1-21、2-21、3-21、4-21、1-22、2-22、3-22、4-22、1-23、2-23、3-23、4-23、1-24、2-24、3-24或4-24的序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂有义链包含表4(或表4.1、4.2或4.3)中的任一个修饰的序列的修饰的序列或由其组成。

对于本文公开的HIF-2αRNAi试剂，在反义链(从5′末端→3′末端)的位置1处的核苷酸可以与HIF-2α基因完美互补，或者可以与HIF-2α基因不互补。在某些实施方案中，在反义链(从5′末端→3′末端)的位置1处的核苷酸是U、A或dT(或其修饰形式)。在某些实施方案中，在反义链(从5′末端→3′末端)的位置1处的核苷酸与有义链形成A:U或U:A碱基对。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂反义链包含表2或表3中的任一个反义链序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)2-18或2-19的序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi有义链包含表2或表4(或表4.1、4.2或4.3)中的任一个有义链序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)1-17或1-18的序列。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包括：(i)反义链，其包含表2或表3中的任一个反义链序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)2-18或2-19的序列，和(ii)有义链，其包含表2或表4(或表4.1、4.2或4.3)中的任一个有义链序列的核苷酸(从5′末端→3′末端)1-17或1-18的序列。

含有在表2或表4中列出的序列的有义链可以与含有表2或表3中列出的序列的任何反义链杂交，条件是两个序列在连续16、17、18、19、20或21个核苷酸序列上具有至少85％互补性的区域。在某些实施方案中，所述HIF-2αRNAi试剂具有由表4(或表4.1、4.2或4.3)中的任一个修饰序列的修饰序列组成的有义链，和由表3中的任一个修饰序列的修饰序列组成的反义链。某些代表性序列配对由表5中所示的双链体ID No.来例举。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含由本文呈现的双链体ID No.中的任一个代表的双链体，由其组成，或基本上由其组成。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含由本文呈现的双链体ID No.中的任一个代表的任何双链体的有义链和反义链核苷酸序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含由本文呈现的双链体ID No.中的任一个代表的任何双链体的有义链和反义链核苷酸序列以及靶向配体、靶向基团和/或连接基团，其中所述靶向配体、靶向基团和/或连接基团共价地连接(缀合)至所述有义链或所述反义链。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包括本文呈现的双链体ID No.中的任一个的有义链和反义链修饰的核苷酸序列。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含本文呈现的双链体ID No.中的任一个的有义链和反义链修饰的核苷酸序列以及靶向配体、靶向基团和/或连接基团，其中所述靶向配体、靶向基团和/或连接基团共价地连接至所述有义链或所述反义链。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有表2或表5的反义链/有义链双链体中的任一个的核苷酸序列的反义链和有义链，且进一步包含靶向基团。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有表5的反义链/有义链双链体中的任一个的核苷酸序列的反义链和有义链，且进一步包含整联蛋白受体配体靶向基团。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有表5的反义链/有义链双链体中的任一个的核苷酸序列的反义链和有义链，且进一步包含选自以下的一个或多个连接基团：(NH2-C6)、(C6-NH2)、(C6-SS-C6)、(6-SS-6)、(TriAlk1)、(TriAlk1)s、(TriAlk2)、(TriAlk2)s、(TriAlk3)、(TriAlk3)s、(TriAlk4)、(TriAlk4)s、(TriAlk5)、(TriAlk5)s、(TriAlk6)、(TriAlk6)s、(TriAlk7)、(TriAlk7)s、(TriAlk8)、(TriAlk8)s、(TriAlk9)、(TriAlk9)s、(TriAlk10)、(TriAlk10)s、(TriAlk11)、(TriAlk11)s、(TriAlk12)、(TriAlk12)s、(TriAlk13)、(TriAlk13)s、(TriAlk14)或(TriAlk14)s，各自如在表7中定义。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有表3或表4、4.1、4.2或4.3中的反义链和/或有义链核苷酸序列中的任一个的修饰核苷酸序列的反义链和有义链。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含具有表5中的任一个双链体的任何反义链和/或有义链核苷酸序列的修饰核苷酸序列的反义链和有义链，且进一步包含整联蛋白靶向基团。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含表5的任一个双链体，由其组成，或基本上由其组成。

表5.具有对应的有义和反义链ID编号的HIF-2αRNAi试剂双链体

在某些实施方案中，在任选地连接或缀合至一种或多种靶向配体、靶向基团和/或PK增强剂之前或之后，将HIF-2αRNAi试剂制备或提供为盐、混合的盐或游离酸。在递送给表达HIF-2α基因的细胞后，本文描述的RNAi试剂会在体内和/或在体外抑制或敲低一个或多个HIF-2α基因的表达。

靶向配体和靶向基团

靶向基团或靶向部分增强与其附接的缀合物或RNAi试剂的药代动力学或生物分布特性，以改善缀合物或RNAi试剂的细胞特异性(包括，在一些情况下，器官特异性)分布和细胞特异性(或器官特异性)摄入。靶向基团可以是一价的、二价的、三价的、四价的，或对于其针对的靶标具有更高的价态。代表性靶向基团包括、但不限于：对细胞表面分子具有亲和力的化合物、细胞受体配体、半抗原、抗体、单克隆抗体、抗体片段和对细胞表面分子具有亲和力的抗体模仿物。在某些实施方案中，使用接头(诸如PEG接头)或一个、两个或三个脱碱基残基和/或核糖醇(脱碱基核糖)残基(其在一些情况下可以充当接头)将靶向基团连接至RNAi试剂。在某些实施方案中，靶向基团包含整联蛋白靶向配体。

在某些实施方案中，将本文描述的RNAi试剂缀合至靶向基团。在某些实施方案中，靶向配体增强RNAi试剂结合目标细胞上的特定细胞受体的能力。在某些实施方案中，缀合至本文描述的RNAi试剂的靶向配体对整联蛋白受体具有亲和力。在某些实施方案中，用于与本文公开的HIF-2αRNAi试剂一起使用的合适靶向配体对整联蛋白α-v-β3、整联蛋白α-v-β-5或这两种整联蛋白具有亲和力。

在某些实施方案中，将本文公开的HIF-2αRNAi试剂连接至一种或多种整联蛋白靶向配体，所述配体包括下式的化合物：

其中，

X是-C(R³)₂-、-NR³-、

Y是任选地被取代的亚烷基，其中在亚烷基链中具有1-8个碳原子；

Z是O、NR³或S；

R¹是任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的杂环基、任选地被取代的环烷基，或R¹包含RNAi试剂；

R²是H、任选地被取代的烷基，或R²包含RNAi试剂；

R³的每个实例独立地选自H和任选地被取代的烷基，或R³包含RNAi试剂；

R⁴是H或任选地被取代的烷基；且

其中Y、R¹、R²中的至少一个、R³的任何实例和R⁴包含RNAi试剂。

在某些实施方案中，将本文公开的HIF-2αRNAi试剂连接至一种或多种整联蛋白靶向配体，所述配体包括下述结构之一：

其中指示与HIF-2αRNAi试剂的连接点。

在某些实施方案中，使用“点击”化学反应将靶向基团缀合至RNAi试剂。在某些实施方案中，用一个或多个含炔烃的基团将RNAi试剂官能化，且靶向配体包括含叠氮化物的基团。在反应后，叠氮化物和炔烃形成三唑。下面显示了一个实例反应方案：

其中TL包含靶向配体，且RNA包含RNAi试剂。

HIF-2αRNAi试剂可以包含超过一种靶向配体。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含1-20种靶向配体。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种靶向配体至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种靶向配体。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含靶向基团，其包括2种或更多种靶向配体。在某些实施方案中，靶向基团可以缀合在HIF-2αRNAi试剂的有义链的5’或3’末端。在某些实施方案中，靶向基团可以缀合至HIF-2RNAi试剂上的内部核苷酸。在某些实施方案中，靶向基团可以由连接在一起的2个靶向配体组成，被称作“双齿”靶向基团。在某些实施方案中，靶向基团可以由连接在一起的3个靶向配体组成，被称作“三齿”靶向基团。在某些实施方案中，靶向基团可以由连接在一起的4个靶向配体组成，被称作“四齿”靶向基团。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂可以包含缀合至有义链的3’或5’末端的靶向基团，和另外的缀合至内部核苷酸的靶向配体。在某些实施方案中，将三齿靶向基团缀合至HIF-2αRNAi试剂的有义链的5’末端，并将至少一个靶向配体缀合至有义链的内部核苷酸。在其它实施方案中，将三齿靶向基团缀合至HIF-2αRNAi试剂的有义链的5’末端，并将四个靶向配体缀合至有义链的内部核苷酸。在某些实施方案中，将四个靶向配体缀合至有义链的2、4、6和8核苷酸位置。

在某些实施方案中，将HIF-2αRNAi试剂连接至一个或多个下式的靶向基团：

其中指示连接点。在某些实施方案中，所述连接点是HIF-2αRNAi试剂的有义链的5’末端。

内部连接的靶向配体

本文描述的HIF-2αRNAi试剂的一些实施方案包括缀合至有义链或反义链的内部核苷酸的靶向配体。在某些实施方案中，可以将至多15个靶向配体缀合至HIF-2αRNAi试剂的有义链的内部核苷酸。在某些实施方案中，可以将1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个靶向配体缀合至HIF-2αRNAi试剂的有义链的内部核苷酸。在某些实施方案中，将1-5(例如，1、2、3、4或5)个靶向配体缀合至HIF-2αRNAi试剂的有义链的内部核苷酸。在某些实施方案中，将3-4个靶向配体缀合至HIF-2αRNAi试剂的有义链的内部核苷酸。

在某些实施方案中，内部靶向配体的放置可能影响HIF-2αRNAi试剂的效力或效能。在HIF-2αRNAi试剂的某些实施方案中，将靶向基团缀合至有义链的5’末端，且至少10个核苷酸定位在位于有义链的5’末端上的三齿靶向基团与位于有义链的下一个最近靶向配体之间。在某些实施方案中，至少5个核苷酸定位在位于有义链的5’末端上的三齿靶向基团与位于有义链的下一个最近靶向配体之间。

在某些实施方案中，其中2个或更多个靶向配体缀合至位于HIF-2αRNAi试剂的有义链的内部核苷酸，存在至少一个核苷酸的空间，其没有缀合至定位在缀合至靶向配体的2个内部核苷酸之间的靶向配体。在某些实施方案中，其中2个或更多个靶向配体缀合至HIF-2αRNAi试剂的有义链，至少2个未缀合至靶向配体的核苷酸定位在缀合至靶向配体的2个内部核苷酸之间。

在某些实施方案中，将靶向配体缀合至有义链的2、4和6核苷酸，这从与反义链上的5’末端核苷酸形成碱基对的最远3’核苷酸开始从3’至5’编号。在某些实施方案中，将靶向配体缀合至2、4、6和8核苷酸(3’→5’)，这从与反义链上的5’末端核苷酸形成碱基对的3’末端核苷酸开始。

药代动力学增强剂

在某些实施方案中，将药代动力学(PK)增强剂连接至本文公开的HIF-2αRNAi试剂以促进RNAi试剂向期望的细胞或组织的递送。可以合成具有容易存在的反应基团(诸如马来酰亚胺或叠氮基)的PK增强化合物，以促进与HIF-2αRNAi试剂上的一个或多个接头的连接。在某些实施方案中，可以将PK增强剂合成为马来酰亚胺并使用本文描述的反应缀合至RNAi试剂。也可以使用其它缀合反应诸如“点击”化学或酰胺缀合。

在某些实施方案中，PK增强剂可以包括这样的分子：其为脂肪酸、脂质、白蛋白结合剂、抗体结合剂、聚酯、聚丙烯酸酯、聚-氨基酸以及具有约20-1000个环氧乙烷(CH₂-CH₂-O)单元的直链或支链聚乙二醇(PEG)部分。

在某些实施方案中，将HIF-2RNAi试剂连接至PK增强剂，其包括具有下式的结构的化合物：

其中Y是任选地被取代的饱和的或不饱和的脂族链，且n是5-25的整数。

在某些实施方案中，将HIF-2RNAi试剂连接至PK增强剂，其包括具有以下结构的化合物：

在某些实施方案中，将HIF-2RNAi试剂连接至PK增强剂，其包括具有以下结构的化合物：

下面表6显示了某些示例性的PK增强化合物，其可以用作起始原料以连接至本文公开的HIF-2αRNAi试剂。使用本领域已知的任何方法，可以将PK增强化合物添加至HIF-2αRNAi试剂。

表6.适合用于连接至HIF-2αRNAi试剂的示例性PK增强剂化合物

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂可以包含一种或多种PK增强剂。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂包含1、2、3、4、5、6、7种或更多种PK增强剂。

使用本领域已知的任何方法，可以将PK增强剂缀合至HIF-2αRNAi试剂。在某些实施方案中，PK增强剂可以包括马来酰亚胺部分并与包含二硫键的RNAi试剂反应以形成包含PK增强剂的RNAi试剂。可以将二硫化物还原，并通过Michael-加成反应添加至马来酰亚胺。下面显示了一个实例反应方案：

其中PK包含PK增强剂，RNA包含RNAi试剂，且R可以是本领域已知的任意合适基团。在以上反应方案的某些情况下，R是烷基诸如己基(C₆H₁₃)。

在某些实施方案中，PK增强剂可以包括叠氮化物部分并与包含炔烃的RNAi试剂反应以形成包含PK增强剂的RNAi试剂。使用以下一般反应方案的“点击”反应，可以使所述对反应：

其中PK包含PK增强剂，RNA包含RNAi试剂。

在某些实施方案中，可以将PK增强剂缀合至有义或反义链的5’末端，有义或反义链的3’末端，或HIF-2αRNAi试剂的内部核苷酸。在某些实施方案中，可以合成具有在有义链的3’末端处的含二硫化物的部分的HIF-2αRNAi试剂，并可以使用上面显示的一般合成方案将PK增强剂缀合至有义链的3’末端。在某些实施方案中，合成HIF-2αRNAi试剂以包括2’-O-炔丙基修饰的核苷酸(参见，例如，表7)，并可以使用上面显示的一般合成方案将PK增强剂缀合至内部核苷酸。

在某些实施方案中，在已经将PK增强剂缀合至RNAi试剂以后，PK增强剂可能具有下式：

其中指示与RNAi试剂的连接点。

连接基团和递送媒介物

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂含有或者缀合至一个或多个非核苷酸基团，所述非核苷酸基团包括、但不限于连接基团或递送媒介物。所述非核苷酸基团可以增强RNAi试剂的靶向、递送或附着。连接基团的非限制性例子提供在表7中。所述非核苷酸基团可以共价地连接至有义链和/或反义链的3′和/或5′末端。在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂含有连接至有义链的3′和/或5′末端的非核苷酸基团。在某些实施方案中，非核苷酸基团连接至HIF-2αRNAi试剂有义链的5′末端。非核苷酸基团可以经由接头/连接基团直接地或间接地连接至RNAi试剂。在某些实施方案中，非核苷酸基团经由不稳定的、可切割的或可逆的键或接头连接至RNAi试剂。

在某些实施方案中，非核苷酸基团增强与其附接的RNAi试剂或缀合物的药代动力学或生物分布特性，以改善缀合物的细胞-或组织-特异性的分布和细胞-特异性的摄入。在某些实施方案中，非核苷酸基团增强RNAi试剂的胞吞作用。

可以合成在5′-端和/或3′-端具有反应基团诸如氨基(在本文中也被称作胺)的本文描述的HIF-2αRNAi试剂。所述反应基团随后可以用于使用本领域中的典型方法连接靶向部分。

例如，在某些实施方案中，合成在RNAi试剂的有义链的5′-端具有NH₂-C₆基团的本文公开的HIF-2αRNAi试剂。末端氨基随后可以反应以形成缀合物，例如，与包括对一种或多种整联蛋白(整联蛋白靶向配体)具有亲和力的化合物或PK增强剂的基团反应。在某些实施方案中，合成在RNAi试剂的有义链的5′-端具有一个或多个炔烃基的本文公开的HIF-2αRNAi试剂。所述末端炔烃基可以随后反应以形成缀合物，例如，与包括靶向配体的基团反应。

在某些实施方案中，靶向基团包含整联蛋白靶向配体。在某些实施方案中，整联蛋白靶向配体包括对整联蛋白α-v-β3和/或整联蛋白α-v-β5具有亲和力的化合物。整联蛋白靶向配体的应用可以促进向在其各自表面上具有各种整联蛋白的细胞的细胞特异性靶向，且整联蛋白靶向配体的结合可以促进它所连接的HIF-2αRNAi试剂向细胞(诸如ccRCC细胞)中的进入。使用本领域通常已知的方法，可以将靶向配体、靶向基团和/或PK增强剂附着至HIF-2αRNAi试剂的3′和/或5′末端和/或HIF-2αRNAi试剂上的内部核苷酸。靶向配体和靶向基团(诸如整联蛋白αvβ3/αvβ5)的制备描述在例如美国临时专利申请号62/663,763中，其内容整体并入本文。

本公开内容的实施方案包括用于在体内将HIF-2αRNAi试剂递送给ccRCC细胞的药物组合物。这样的药物组合物可以包括，例如，缀合至靶向基团的HIF-2αRNAi试剂，所述靶向基团包含对整联蛋白αvβ3和/或整联蛋白αvβ5具有亲和力的整联蛋白靶向配体。在某些实施方案中，所述靶向配体包含对整联蛋白αvβ3和/或整联蛋白αvβ5具有亲和力的化合物。

在某些实施方案中，合成具有连接基团的HIF-2αRNAi试剂，所述连接基团然后可以促进HIF-2αRNAi试剂与靶向配体、靶向基团、PK增强剂或另一类递送媒介物(诸如递送聚合物)的共价连接。所述连接基团可以连接至RNAi试剂有义链或反义链的3′和/或5′末端。在某些实施方案中，所述连接基团连接至RNAi试剂有义链。在某些实施方案中，所述连接基团缀合至RNAi试剂有义链的5′或3′末端。在某些实施方案中，连接基团缀合至RNAi试剂有义链的5′末端。连接基团的例子包括、但不限于Alk-SMPT-C6、Alk-SS-C6、DBCO-TEG、Me-Alk-SS-C6和C6-SS-Alk-Me、反应基团诸如伯胺和炔烃、烷基、脱碱基残基/核苷酸、氨基酸、三炔烃官能化的基团、核糖醇和/或PEG基团。

接头或连接基团是两个原子之间的连接，所述连接经由一个或多个共价键将一个目标化学基团(诸如RNAi试剂)或区段连接至另一个目标化学基团(诸如靶向配体、靶向基团、PK增强剂或递送聚合物)或区段。不稳定的连接含有不稳定的键。连接可以任选地包括增加两个连接的原子之间的距离的间隔区。间隔区可以进一步给连接增加柔性和/或长度。间隔区包括、但不限于烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基；它们各自可以含有一个或多个杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸和糖。间隔区基团是本领域众所周知的，并且前述列表并不旨在限制说明书的范围。

在某些实施方案中，在不使用额外接头的情况下，将靶向基团连接至HIF-2αRNAi试剂。在某些实施方案中，设计具有易于存在的接头的靶向基团，以促进与HIF-2αRNAi试剂的连接。在某些实施方案中，当在组合物中包括两种或更多种RNAi试剂时，可以使用相同的接头将两种或更多种RNAi试剂连接至它们各自的靶向基团。在某些实施方案中，当在组合物中包括两种或更多种RNAi试剂时，使用不同的接头将两种或更多种RNAi试剂连接至它们各自的靶向基团。

在表2、3和4(或表4.1、4.2或4.3)中列出的任何HIF-2αRNAi试剂核苷酸序列，无论是修饰的还是未修饰的，都可以含有3′和/或5′靶向基团、连接基团和/或药代动力学增强剂。含有3′或5′靶向配体、靶向基团、PK增强剂或连接基团的在表3和4中列出的或在本文中另外描述的任何HIF-2αRNAi试剂序列可以可替换地不含有3′或5′靶向配体、靶向基团、连接基团或PK增强剂，或可以含有不同的3′或5′靶向配体、靶向基团、连接基团或PK增强剂，包括、但不限于在表6和7中所示的那些。在表5中列出的任何HIF-2αRNAi试剂双链体，无论是修饰的还是未修饰的，可以进一步包含靶向配体、靶向基团、连接基团或PK增强剂，包括、但不限于在表6和7中所示的那些，且靶向基团或连接基团可以附着至HIF-2αRNAi试剂双链体的有义链或反义链的3′或5′末端。

在某些实施方案中，连接基团可以合成地缀合至本文描述的HIF-2αRNAi试剂的有义链的5’或3’末端。在某些实施方案中，将连接基团合成地缀合至HIF-2αRNAi试剂的有义链的5’末端。在某些实施方案中，缀合至HIF-2αRNAi试剂的连接基团可以是三炔烃连接基团。

在某些实施方案中，将HIF-2αRNAi试剂连接至一个或多个具有下式的三齿靶向基团或其药学上可接受的盐：

式II

其中，

L¹、L²和L³各自独立地是包含任选地被取代的亚烷基的接头；

L⁴是包含任选地被取代的亚烷基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的环烷基的接头；

R⁵是H或任选地被取代的烷基；

TL是靶向配体；且

Y是O或S。

在其它实施方案中，使用具有在下面表7中所示的TriAlk 1-14中的任一个的式的接头，将HIF-2αRNAi试剂连接至一个或多个三齿靶向基团。合成式II的化合物的方法描述在标题为“Trialkyne Linking Agents and Methods of Use”的PCT申请号PCT/US19/18232中。

某些修饰的核苷酸和连接基团的例子提供在表7中。

表7.代表各种修饰的核苷酸和连接基团的结构

在某些实施方案中，RNAi试剂包括具有以下结构的接头：TriAlk 14:

或TriAlk 14s:其中TL包含靶向配体，其是(TriAlk14)或(TriAlk14)s的化合物与包含叠氮化物的靶向配体的“点击”反应的结果。

可替换地，可以使用本领域已知的其它连接基团。

除了将HIF-2αRNAi试剂连接至一种或多种靶向配体、靶向基团和/或PK增强剂以外或可替换地，在某些实施方案中，递送媒介物可以用于将RNAi试剂递送至细胞或组织。递送媒介物是可以改善RNAi试剂向细胞或组织的递送的化合物，且可以包括、但不限于：聚合物(诸如两亲性聚合物)、膜活性聚合物、肽、蜂毒肽、蜂毒肽-样肽(MLP)、脂质、可逆修饰的聚合物或肽、或可逆修饰的膜活性多胺，或由其组成。

在某些实施方案中，所述RNAi试剂可以与脂质、纳米颗粒、聚合物、脂质体、胶束、DPC或本领域中可用的其它递送系统组合。RNAi试剂还可以化学缀合至靶向基团、脂质(包括、但不限于胆固醇和胆甾醇基衍生物)、纳米颗粒、聚合物、脂质体、胶束、DPC(参见，例如WO 2000/053722、WO 2008/022309、WO 2011/104169和WO 2012/083185、WO 2013/032829、WO 2013/158141，它们中的每一篇通过引用并入本文)或本领域中可用的其它递送系统。

药物组合物

在某些实施方案中，本公开内容提供了包括本文公开的HIF-2αRNAi试剂中的一种或多种、由其组成或基本上由其组成的药物组合物。

本文中使用的“药物组合物”包含药理学上有效量的活性药物成分(API)和任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂(赋形剂)是在药物递送系统中有意包括的除了活性药物成分(API，治疗产品)以外的物质。赋形剂在预期剂量不发挥治疗效果或不意图发挥治疗效果。赋形剂可起如下作用：a)在制造期间有助于药物递送系统的加工，b)保护、支持或增强API的稳定性、生物利用度或患者可接受性，c)有助于产品鉴定，和/或d)在储存或使用期间增强API递送的总体安全性、有效性的任何其它属性。药学上可接受的赋形剂可以是或可以不是惰性物质。

赋形剂包括、但不限于：吸收增强剂、抗粘着剂、消泡剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、载体、包衣剂、着色剂、递送增强剂、递送聚合物、葡聚糖、右旋糖、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、矫味剂、助流剂、保湿剂、润滑剂、油、聚合物、防腐剂、盐水、盐、溶剂、糖、助悬剂、持续释放基质、甜味剂、增稠剂、张度剂、媒介物、防水剂和润湿剂。

本文描述的药物组合物可以含有在药物组合物中通常存在的其它另外组分。在某些实施方案中，所述另外组分是药学活性物质。药学活性物质包括、但不限于：抗瘙痒药、收敛剂、局部麻醉药或抗炎剂(例如，抗组胺剂、苯海拉明等)、小分子药物、抗体、抗体片段、适体和/或疫苗。

药物组合物还可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、香料、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。它们还可以含有具有已知治疗益处的其它试剂。

可以以多种方式施用药物组合物，取决于是否需要局部或全身治疗以及要治疗的区域。可以通过本领域公知的任何方式进行施用，例如，但不限于，局部(例如，通过透皮贴剂)、肺(例如，通过粉剂或气雾剂的吸入或吹入法，包括通过喷雾器、气管内、鼻内)、表皮、透皮、口服或胃肠外。胃肠外施用包括、但不限于静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；真皮下(例如，经由植入装置)、颅内、实质内、鞘内和心室内施用。在某些实施方案中，通过皮下注射施用本文所述的药物组合物。可以口服施用药物组合物，例如以片剂、包衣片剂、糖锭剂、硬或软明胶胶囊剂、溶液、乳剂或混悬液的形式。也可以进行直肠施用，例如使用栓剂；局部或经皮施用，例如使用软膏剂、乳膏剂、凝胶或溶液；或胃肠外施用，例如使用可注射的溶液。

适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑制细菌的水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水。它应当在制造和储存条件下是稳定的，并且应当进行保存而免于微生物诸如细菌和真菌的污染作用。所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)和它们的合适混合物。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣剂诸如卵磷脂，通过维持所需的粒度(在分散系的情况下)，和通过使用表面活性剂。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如，糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇和氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

可以如下制备无菌注射溶液：将活性化合物以所需量掺入根据需要具有与上文所列举的一种成分或成分的组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，如下制备分散体：将活性化合物掺入无菌媒介物中，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其它成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的期望成分的粉末。

适合于关节内施用的制剂可以呈本文描述的任何配体的无菌水性制剂的形式，其可以呈微晶形式，例如呈水性微晶悬浮液的形式。脂质体制剂或可生物降解的聚合物系统也可用于呈送用于关节内和眼科施用的本文描述的任何配体。

可以用载体制备活性化合物，所述载体会保护化合物免于从身体中快速消除，诸如控释制剂，包括植入剂和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。本领域技术人员会明白用于制备这样的制剂的方法。脂质体混悬液也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如在美国专利号4,522,811中所述。

药物组合物可以含有在药物组合物中常见的其它另外组分。这样的另外组分包括、但不限于：抗瘙痒药、收敛剂、局部麻醉药或抗炎剂(例如，抗组胺剂、苯海拉明等)。本文中使用的“药理学有效量”、“治疗有效量”或简称“有效量”表示产生药理学、治疗或预防结果的药学活性剂的量。

含有HIF-2αRNAi试剂的药物也是本发明的一个目的，用于制造此类药物的方法也是本发明的目的，该方法包括将一种或多种含有HIF-2αRNAi试剂的化合物以及如果需要的话一种或多种具有已知治疗益处的其它物质制成药学上可接受的形式。

所描述的HIF-2αRNAi试剂和本文公开的包含HIF-2αRNAi试剂的药物组合物可以包装或包括在试剂盒、容器、包或分配器中。HIF-2αRNAi试剂和包含HIF-2αRNAi试剂的药物组合物可以包装在预填充的注射器或管形瓶中。

治疗方法和表达的抑制

本文公开的HIF-2αRNAi试剂可以用于治疗具有疾病或障碍的受试者(例如，人或其它哺乳动物)，所述疾病或障碍将受益于RNAi试剂的施用。在某些实施方案中，本文公开的RNAi试剂可以用于治疗将受益于HIF-2αmRNA和/或HIF-2α(EPAS1)蛋白水平的表达的减少和/或抑制的受试者(例如，人)，例如，已经被诊断出或正在遭受与癌症、肾癌、透明细胞肾细胞癌、非小细胞肺癌、星形细胞瘤(脑癌)、膀胱癌、乳腺癌、软骨肉瘤、结肠直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头和颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、神经母细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、直肠癌、转移、牙龈炎、银屑病、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒、先兆子痫、炎症、慢性炎症、新生血管疾病和类风湿性关节炎有关的症状的受试者。

在某些实施方案中，给受试者施用治疗有效量的任意一种或多种HIF-2αRNAi试剂。受试者的治疗可以包括治疗性和/或预防性治疗。给受试者施用治疗有效量的任意一种或多种本文描述的HIF-2αRNAi试剂。受试者可以是人、患者或人患者。受试者可以是成年人、青少年、儿童或婴儿。本文描述的药物组合物可以施用给人类或动物。

本文描述的HIF-2αRNAi试剂可以用于治疗受试者中的至少一种症状，所述受试者具有HIF-2α相关的疾病或障碍，或具有至少部分地由HIF-2α基因表达介导的疾病或障碍。在某些实施方案中，所述HIF-2αRNAi试剂用于治疗或管理具有疾病或障碍的受试者的临床表现，所述疾病或障碍将受益于HIF-2αmRNA的减少或至少部分地由HIF-2αmRNA的减少介导。给受试者施用治疗有效量的本文描述的HIF-2αRNAi试剂或含有HIF-2αRNAi试剂的组合物中的一种或多种。在某些实施方案中，本文公开的方法包括给要治疗的受试者施用包含本文描述的HIF-2αRNAi试剂的组合物。在某些实施方案中，给受试者施用预防有效量的所描述的HIF-2αRNAi试剂中的任意一种或多种，由此通过预防或抑制至少一种症状来治疗所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了在有此需要的患者中治疗至少部分地由HIF-2α基因表达介导的疾病、障碍、病症或病理学状态的方法，其中所述方法包括给所述患者施用本文描述的HIF-2αRNAi试剂中的任一种。

在某些实施方案中，与施用HIF-2αRNAi试剂之前的受试者相比，或与没有接受HIF-2αRNAi试剂的受试者相比，给其施用所描述的HIF-2αRNAi试剂的受试者中HIF-2α基因的基因表达水平和/或mRNA水平降低了至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％。受试者中的基因表达水平和/或mRNA水平可能在受试者的细胞、细胞集合和/或组织中降低。

在某些实施方案中，与施用HIF-2αRNAi试剂之前的受试者相比，或与没有接受HIF-2αRNAi试剂的受试者相比，已经给其施用所描述的HIF-2αRNAi试剂的受试者中的HIF-2α蛋白水平降低了至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％。受试者中的蛋白水平可能在受试者的细胞、细胞集合、组织、血液和/或其它流体中降低。

通过本领域已知的任意方法，可以评估HIF-2αmRNA水平和HIF-2α蛋白水平的降低。如本文中使用的，HIF-2αmRNA水平和/或蛋白水平的减少或降低在本文中共同地被称作HIF-2α的减少或降低，或抑制或减少HIF-2α的表达。本文阐述的实施例例证了用于评估HIF-2α基因表达的抑制的已知方法。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂可以用于制备药物组合物，所述药物组合物用于治疗至少部分地由HIF-2α基因表达介导的疾病、障碍或症状。在某些实施方案中，至少部分地由HIF-2α基因表达介导的疾病、障碍或症状是癌症、肾癌、透明细胞肾细胞癌、非小细胞肺癌、星形细胞瘤(脑癌)、膀胱癌、乳腺癌、软骨肉瘤、结肠直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头和颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、神经母细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、直肠癌、转移、牙龈炎、银屑病、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒、先兆子痫、炎症、慢性炎症、新生血管疾病或类风湿性关节炎。

在某些实施方案中，治疗受试者的方法依赖于受试者的体重。在某些实施方案中，可以以约3mg/kg至约80mg/kg受试者体重的剂量施用HIF-2αRNAi试剂。在其它实施方案中，可以以约5mg/kg至约20mg/kg受试者体重的剂量施用HIF-2αRNAi试剂。

在某些实施方案中，可以以分次剂量施用HIF-2αRNAi试剂，这意味着，在短(例如，小于24小时)时间段中给受试者施用2个剂量。在某些实施方案中，在初次施用中施用期望的每日量的约一半，并在初次施用后大约4小时施用期望的每日量的剩余约一半。

在某些实施方案中，可以每周1次(每周)施用HIF-2αRNAi试剂。在其它实施方案中，可以每2周1次(隔周一次)施用HIF-2αRNAi试剂。

在某些实施方案中，施用的HIF-2αRNAi试剂的剂量是每周施用225mg的固定剂量。在某些实施方案中，施用的HIF-2αRNAi试剂的剂量是每周施用525mg的固定剂量。在某些实施方案中，施用的HIF-2αRNAi试剂的剂量是每周施用1,050mg的固定剂量。在某些实施方案中，通过静脉内输注施用HIF-2αRNAi试剂。

在某些实施方案中，HIF-2αRNAi试剂或含有HIF-2αRNAi试剂的组合物可以用于治疗至少部分地由HIF-2α(EPAS1)基因表达介导的疾病、障碍或症状。在某些实施方案中，至少部分地由HIF-2α(EPAS1)基因表达介导的疾病、障碍或症状是ccRCC。

细胞、组织和非人生物体

涵盖细胞、组织和非人生物体，其包括本文描述的HIF-2αRNAi试剂中的至少一种。通过本领域可得到的任何方式将所述HIF-2αRNAi试剂递送给细胞、组织或非人生物体，制备所述细胞、组织或非人生物体。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，包括、但不限于人细胞。

现在用以下非限制性实施例举例说明上面提供的实施方案和项目。

实施例

以下实施例不是限制性的，且意图举例说明本文公开的某些实施方案。

实施例1.HIF-2αRNAi试剂的合成和含有HIF-2αRNAi试剂的组合物.

以下描述了合成某些HIF-2αRNAi试剂及其缀合物的一般规程，其在本文阐述的非限制性实施例中举例说明。

RNAi试剂的合成.使用本领域通常已知的方法，可以合成RNAi试剂。关于在本文阐述的实施例中举例说明的RNAi试剂的合成，根据在寡核苷酸合成中使用的固相上的亚磷酰胺技术，合成RNAi试剂的有义链和反义链。取决于规模，使用(Bioautomation)、(Bioautomation)或Oligopilot 100(GE Healthcare)。在由可控孔度玻璃(CPG,或得自Prime Synthesis,Aston,PA,USA)或聚苯乙烯(得自Kinovate,Oceanside,CA,USA)制成的固体支持物上执行合成。所有RNA和2′-修饰的RNA亚磷酰胺购自Thermo Fisher Scientific(Milwaukee,WI,USA)、ChemGenes(Wilmington,MA,USA)或Hongene Biotech(Morrisville,NC,USA)。具体地，使用的下述2′-O-甲基亚磷酰胺包括下述：(5′-O-二甲氧基三苯甲基-N⁶-(苯甲酰基)-2′-O-甲基-腺苷-3′-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基-三苯甲基-N⁴-(乙酰基)-2′-O-甲基-胞苷-3′-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基-氨基)亚磷酰胺、(5′-O-二甲氧基三苯甲基-N²-(异丁酰基)-2′-O-甲基-鸟苷-3′-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺和5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基-尿苷-3′-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2′-脱氧-2′-氟-亚磷酰胺和2′-O-炔丙基亚磷酰胺携带与2′-O-甲基亚磷酰胺相同的保护基。5′-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基-肌苷-3′-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺购自Glen Research(Virginia)。倒置脱碱基(3′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧核糖-5′-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺购自ChemGenes。使用的下述UNA亚磷酰胺包括下述：5′-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N6-(苯甲酰基)-2′,3′-开环-腺苷、2′-苯甲酰基-3′-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5′-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-乙酰基-2′,3′-开环-胞嘧啶、2′-苯甲酰基-3′-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5′-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-异丁酰基-2′,3′-开环-鸟苷、2′-苯甲酰基-3′-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺和5′-(4,4'-二甲氧基-三苯甲基)-2′,3′-开环-尿苷、2′-苯甲酰基-3′-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。为了引入硫代磷酸酯键，采用3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮(POS，得自PolyOrg,Inc.,Leominster,MA,USA)在无水乙腈中的100mM溶液或苍耳烷氢化物(TCI America,Portland,OR,USA)在吡啶中的200mM溶液。

也商业购买(ThermoFisher)TFA氨基连接亚磷酰胺以引入(NH2-C6)反应基团接头。将TFA氨基连接亚磷酰胺溶解在无水乙腈(50mM)中并加入分子筛将5-苄基硫基-1H-四唑(BTT,250mM在乙腈中)或5-乙基硫基-1H-四唑(ETT,250mM在乙腈中)用作活化剂溶液。偶联时间是10分钟(RNA)、90秒(2′O-Me)和60秒(2′F)。合成含有三炔烃的亚磷酰胺以引入各种(TriAlk#)接头。当与本文某些实施例中呈现的RNAi试剂关联使用时，将含有三炔烃的亚磷酰胺溶解在无水二氯甲烷或无水乙腈(50mM)中，而将所有其它酰胺化物(amidites)溶解在无水乙腈(50mM)中，并加入分子筛将5-苄基硫基-1H-四唑(BTT,250mM在乙腈中)或5-乙基硫基-1H-四唑(ETT,250mM在乙腈中)用作活化剂溶液。偶联时间是10分钟(RNA)、90秒(2′O-Me)和60秒(2′F)。

对于某些RNAi试剂，将接头诸如C6-SS-C6或6-SS-6基团引入在有义链的3’末端端部处。商业获得具有各种接头的预加载树脂。可替换地，对于某些有义链，使用dT树脂，并然后通过标准的亚磷酰胺合成添加各种接头。

支持物结合的寡聚体的切割和去保护.固相合成结束以后，将干燥的固体支持物用40重量％的甲胺水溶液和28％-31％的氢氧化铵溶液(Aldrich)的1:1体积溶液在30℃处理1.5小时。将溶液蒸发并将固体残余物在水中重构(参见下面)。

纯化.使用TSKgel SuperQ-5PW 13μm柱和Shimadzu LC-8系统，通过阴离子交换HPLC纯化粗制的寡聚体。缓冲液A是20mM Tris,5mM EDTA,pH 9.0，且含有20％乙腈，且除了加入1.5M氯化钠以外，缓冲液B与缓冲液A相同。记录在260nm的紫外迹线。将适当的级分合并，然后用100mM碳酸氢铵(pH 6.7)和20％乙腈或过滤水的运行缓冲液使用填充了Sephadex G25 fine的GE Healthcare XK 16/40柱在尺寸排阻HPLC上运行。

退火.通过在1×PBS(磷酸盐缓冲盐水,1×,Corning,Cellgro)中组合等摩尔RNA溶液(有义和反义)混合互补链，以形成RNAi试剂。将一些RNAi试剂低压冻干并在-15至-25℃储存。通过在1×PBS中在UV-Vis光谱仪上测量溶液吸光度，确定双链体浓度。然后将在260nm的溶液吸光度乘以换算因子和稀释因子以确定双链体浓度。使用的换算因子是0.037mg/(mL·cm)，或从实验性地确定的消光系数计算出。

连接试剂TriAlk 14的合成

在某些实施方案中，连接试剂诸如TriAlk 14可以以亚磷酰胺的形式如下附着至RNAi试剂：通过使包含三炔烃的亚磷酰胺反应，或通过合成包含反应基团(诸如末端胺)的RNAi试剂并在RNAi试剂已经从树脂切割下来以后使所述RNAi试剂与包含活化酯的三炔烃部分反应。下述规程提供了用于合成TriAlk 14的活化酯形式(化合物22)或TriAlk 14的亚磷酰胺形式(化合物14)的方法。

向3-L带夹套反应器中加入500mL DCM和4(75.0g,0.16mol)。将反应物的内部温度冷却至0℃并加入TBTU(170.0g,0.53mol)。然后将悬浮液用胺5(75.5g,0.53mol)逐滴处理，保持内部温度小于5℃。然后将反应物用DIPEA(72.3g,0.56mol)缓慢地处理，保持内部温度小于5℃。加入结束后，将反应物历时1小时温热直到23℃，并搅拌3小时。加入所有三种试剂的10％kicker负载，并搅拌另外3小时。当剩余<1％的4时，认为反应结束。将反应混合物用饱和氯化铵溶液(2x 500mL)洗涤并用饱和碳酸氢钠溶液(500mL)洗涤一次。然后将有机层经硫酸钠干燥并浓缩成油。粗制油的质量为188g，通过QNMR确定其含有72％的6。将粗制油用于下一步。C₄₆H₆₀N₄O₁₁的计算质量＝845.0m/z。实测[M+H]＝846.0。

将121.2g含有72重量％化合物6的粗制油(86.0g,0.10mol)溶解在DMF(344mL)中并用TEA(86mL,20v/v％)处理，保持内部温度低于23℃。通过HPLC方法1监测相对于Fmoc-胺6消耗的二苯并富烯(DBF)形成(图2)，并且反应在10小时内结束。向溶液中加入戊二酸酐(12.8g,0.11mol)，且中间体胺7在2小时内转化成化合物8。结束后，将DMF和TEA在30℃在减压下除去，得到100g粗制油。由于化合物7在水中的高溶解度，不可使用水性后处理，并且色谱法是除去DBF、TMU和戊二酸酐的唯一途径。将粗制油(75g)分成三部分在Teledyne ISCOCombi-纯化系统上纯化。将粗制油(25g)加载上330g硅胶柱并在30分钟中用0-20％甲醇/DCM洗脱，得到42g化合物8(经3步54％收率)。C₃₆H₅₅N₄O₁₂的计算质量＝736.4m/z。实测[M+H]＝737.0。

将化合物8(42.0g,0.057mol)在使用前与10体积的乙腈一起共剥离以除去来自色谱溶剂的任何残余甲醇。将所述油再溶解在DMF(210mL)中并冷却至0℃。将溶液先后用4-硝基苯酚(8.7g,0.063moL)和EDC-盐酸盐(12.0g,0.063mol)处理，并发现在10小时内达到完全。将溶液冷却至0℃，并加入10体积的乙酸乙酯，随后加入10体积的饱和氯化铵溶液，保持内部温度低于15℃。允许层分离，并将乙酸乙酯层用盐水洗涤。将合并的水层用5体积的乙酸乙酯萃取2次。将合并的有机层经硫酸钠干燥并浓缩成油。将粗制油(55g)分成三部分在Teledyne ISCO Combi-纯化系统上纯化。将粗制油(25g)加载上330g硅胶柱并历时30分钟从0-10％甲醇/DCM洗脱，得到22g纯的9(化合物22)(50％收率)。C₄₂H₅₉N₅O₁₄的计算质量＝857.4m/z。实测[M+H]＝858.0。

将酯9(49.0g,57.1mmol)和6-氨基-1-己烷醇(7.36g,6.28mmol)在二氯甲烷(3体积)中的溶液用三乙胺(11.56g,111.4mmol)逐滴处理。通过在HPLC方法1上观察化合物9的消失来监测反应，并发现在10分钟内结束。将粗制的反应混合物用5体积的二氯甲烷稀释，并用饱和的氯化铵(5体积)和盐水(5体积)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并浓缩成油。将粗制油使用330g硅胶柱在Teledyne ISCO Combi-纯化系统上纯化。将4-硝基苯酚用100％乙酸乙酯洗脱，并将10使用20％甲醇/DCM从柱冲洗，得到无色油(39g,81％收率)。C₄₂H₆₉N₅O₁₂的计算质量＝836.0m/z。实测[M+H]＝837.0。

将醇10与10体积的乙腈一起共剥离2次以除去来自色谱溶剂的任何残余甲醇，并与干燥二氯甲烷(KF<60ppm)一起再共剥离一次以除去痕量水。将醇10(2.30g,2.8mmol)溶解在5体积的干燥二氯甲烷(KF<50ppm)中并用二异丙基铵四氮唑(tetrazolide)(188mg,1.1mmol)处理。将溶液冷却至0℃并用2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(1.00g,3.3mmol)逐滴处理。将溶液从冰浴取下并在20℃搅拌。发现反应在3-6小时内结束。将反应混合物冷却至0℃并用10体积的饱和碳酸氢铵/盐水的1:1溶液处理，并然后历时1分钟温热至环境温度，并在20℃搅拌另外3分钟。将两相混合物转移至分液漏斗，并加入10体积的二氯甲烷。将有机层分离，并用10体积的饱和碳酸氢钠溶液洗涤以水解未反应的二磷酸(bis-phosphorous)试剂。将有机层经硫酸钠干燥并浓缩成油，得到3.08g的94重量％化合物14。C₅₁H₈₆N₇O₁₃P的计算质量＝1035.6m/z。实测[M+H]＝1036。

三炔烃支架的合成后缀合.在退火以前或以后，可以将RNAi试剂的5′或3′胺官能化的有义链缀合至三炔烃支架。以下描述了三炔烃支架与退火的双链体的缀合：以约50-70mg/mL，将胺官能化的双链体溶解在90％DMSO/10％H₂O中。加入40当量的三乙胺，随后加入3当量的三炔烃-PNP。一旦结束，就将缀合物在1x磷酸盐缓冲盐水/乙腈(1:14比例)的溶剂系统中沉淀2次，并干燥。

靶向配体与HIF-2RNAi试剂的缀合.在退火以前或以后以及在PK增强剂的缀合以前或以后，可以将一种或多种靶向配体连接至本文公开的HIF-2RNAi试剂。以下描述了用于将整联蛋白靶向配体连接至炔烃-官能化的接头(例如，在内部核苷酸上的(TriAlk)或2’-O-炔丙基)的一般缀合过程。所述规程描述了三个靶向配体向三齿靶向基团支架的添加。相同的规程可以用于将靶向配体连接至内部核苷酸，尽管考虑到要添加的靶向配体的数目可以调节靶向配体的当量数目：在去离子水中制备0.5M三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)、0.5M的硫酸铜(II)五水合物(Cu(II)SO₄·5H₂O)和2M抗坏血酸钠溶液的储备溶液。制备75mg/mL的期望的整联蛋白配体在DMSO中的溶液。在含有有义链(75mg/mL在去离子水中)的瓶中，在搅拌下将整联蛋白配体加入反应物(2当量/炔烃)。将三乙胺(40当量/有义链)加入反应瓶中。在单独瓶中，将5份0.5M THPTA与1份0.5M Cu(II)SO₄·5H₂O混合，涡旋，并在室温温育5min。5min以后，将THPTA/Cu溶液(0.5当量Cu/炔烃)加入反应瓶中。然后立即将2M抗坏血酸盐(5当量/Cu)加入反应瓶中。一旦反应结束(通常在0.5-1h内结束)，立即将反应物通过非变性阴离子交换色谱法纯化。除非另外指出，否则在下面实施例中描述的所有包括三齿靶向基团的构建体包括具有以下结构的基团：

TriAlk14:

TriAlk14s:

其中TL包含靶向配体且指示与RNAi试剂的连接点。

PK增强剂与HIF-2RNAi试剂的缀合.在退火以前或以后以及在缀合一种或多种靶向配体以前或以后，可以将一种或多种PK增强剂连接至本文公开的HIF-2αRNAi试剂。以下描述了用于将PK增强剂连接至本文所述实施例中阐述的构建体的一般缀合过程。以下描述了用于将马来酰亚胺-官能化的PK增强剂连接至HIF-2αRNAi试剂的(C6-SS-C6)或(6-SS-6)官能化的有义链的一般方法，这通过进行二硫键的二硫苏糖醇还原、随后进行各种PK增强剂的硫醇-迈克尔加成来实现：在瓶中，将官能化的有义链以75mg/mL溶解在0.1M Hepes pH8.5缓冲液中，并加入25当量的二硫苏糖醇。一旦反应结束(通常在0.5-1h内结束)，立即将缀合物在1x磷酸盐缓冲盐水/乙腈(1:40比例)的溶剂系统中沉淀3次，并干燥。然后制备75mg/mL的马来酰亚胺官能化的PK增强剂在DMSO中的溶液。将二硫键还原的(3′C6-SH、5′HS-C6或3’6-SH官能化的)有义链以100mg/mL溶解在去离子水中，并加入3当量的马来酰亚胺-官能化的PK增强剂。一旦反应结束(通常在1h-3h中结束)，将缀合物在1x磷酸盐缓冲盐水/乙腈(1:40比例)的溶剂系统中沉淀，并干燥。

制备靶向配体的方法

在实施例的合成的下述实验细节中使用的一些缩写定义如下：h或hr＝小时；min＝分钟；mol＝摩尔；mmol＝毫摩尔；M＝摩尔；μM＝微摩尔；g＝克；μg＝微克；rt或RT＝室温；L＝升；mL＝毫升；wt＝重量；Et₂O＝乙醚；THF＝四氢呋喃；DMSO＝二甲亚砜；EtOAc＝乙酸乙酯；Et₃N或TEA＝三乙胺；i-Pr₂NEt或DIPEA或DIEA＝二异丙基乙胺；CH₂Cl₂或DCM＝二氯甲烷；CHCl₃＝氯仿；CDCl₃＝氘化氯仿；CCl₄＝四氯化碳；MeOH＝甲醇；EtOH＝乙醇；DMF＝二甲基甲酰胺；BOC＝叔丁氧基羰基；CBZ＝苄氧基羰基；TBS＝叔丁基二甲基甲硅烷基；TBSCl或TBDMSCl＝叔丁基二甲基甲硅烷基氯；TFA＝三氟乙酸；DMAP＝4-二甲基氨基吡啶；NaN₃＝叠氮化钠；Na₂SO₄＝硫酸钠；NaHCO₃＝碳酸氢钠；NaOH＝氢氧化钠；MgSO₄＝硫酸镁；K₂CO₃＝碳酸钾；KOH＝氢氧化钾；NH₄OH＝氢氧化铵；NH₄Cl＝氯化铵；SiO₂＝二氧化硅；Pd-C＝炭载钯；HCl＝氯化氢或盐酸；NMM＝N-甲基吗啉；H₂＝氢气；KF＝氟化钾；EDC-HCl＝N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐；MTBE＝甲基-叔丁基醚；MeOH＝甲醇；Ar＝氩；N₂＝氮；SiO₂＝二氧化硅；R_T＝保留时间；PTSA＝对-甲苯磺酸；PPTS＝吡啶鎓对-甲苯磺酸盐。

结构1c((S)-3-(6-((1-叠氮基-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十九烷-19-基)氧基)吡啶-3-基)-3-(2-氧代-3-(3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)咪唑烷-1-基)丙酸)的合成.

将含有在苯(25mL)中的化合物1(1.03g,8.23mmol)、化合物2(0.92g14.8mol)和PTSA水合物(156mg,0.82mmol)的混合物在Dean Stark设备中回流过夜。次日早晨，将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠中，并随后加入乙酸乙酯。将有机相分离，经硫酸钠过滤，并浓缩以95％收率得到化合物3，随后将其不经进一步纯化地使用。

向含有在DMF(100mL)中的化合物4(5.39g,53.3mmol)和分子筛的溶液中加入氢化钠(60重量％,2.13g,53.3mmol)，并将反应物搅拌1小时。随后加入化合物3(7.52g,7.52g)在DMF(20mL)中的溶液，并将悬浮液在80℃加热过夜。结束后，将悬浮液在棉花塞上过滤并在减压下浓缩。将残余物在乙醚和水之间分配，并将有机相分离，经硫酸钠过滤，并在减压下浓缩。将残余物用20ml 10％H₂O在TFA中的溶液处理并搅拌30分钟。结束后，将溶液冷却至0℃并用6M NaOH将pH调至11，此后产物作为油沉淀出来。将化合物5用乙醚从油悬浮液中萃取3次。将有机相合并，经硫酸钠过滤，并浓缩。然后通过在硅胶上分离，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，将化合物5以26％收率分离。

将含有在DCM(22mL)中的化合物5(2.29g,9.94mmol)、化合物6(4.82g,39.8mmol)、PPTS(125mg,0.50mmol)、硫酸镁(3g,24.9mmol)、硫酸铜(3.97g,24.9mmol)、和3埃分子筛的混合物加热至回流过夜。结束后，将混合物过滤并在减压下浓缩。然后通过在硅胶上分离，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，将化合物7以76％收率分离。

给火焰干燥的烧瓶装入THF(40mL)和二异丙胺(2.29g,22.6mmol)。将它冷却至-20℃并经由插管加入n-BuLi(2.5M,8.64mL,21.6mmol)。将溶液在-20℃搅拌10min，然后冷却至-78℃。在剧烈搅拌下逐滴加入化合物8(2.02mL,20.6mmol)。加入以后，将溶液在-78℃搅拌30min。接着，将ClTi(iPrO)₃(11.26g,43.2mmol)在THF(10mL)中的溶液在剧烈搅拌下经由加料漏斗历时大约10分钟加入。将反应物在-78℃搅拌30分钟。最后，逐滴加入化合物7(2.29g.6.86mmol)在THF中的悬浮液，并在-78℃搅拌1.25小时直到反应结束。向在-78℃的反应物中加入饱和氯化铵水溶液。然后将反应物从冷却移开并使水相逐渐融化和淬灭(黄橙色消失)。将混合物在EtOAc和饱和氯化铵水溶液之间分配。将有机相分离并将水相用EtOAc萃取2次。将有机相合并和经盐水干燥，然后经硫酸钠干燥，然后过滤并浓缩。将残余物在硅胶上纯化，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱。在纯化后以75％收率得到作为单一非对映异构体的化合物9。

将在MeOH(3.2mL)中的化合物9(1.28g,3.21mmol)用HCl在二氧杂环己烷中的溶液(4M,3.2mL,12.9mmol)处理并在室温搅拌30分钟。结束后，将反应混合物用水稀释，并用乙醚洗涤。随后，使用2N的NaOH水溶液将pH调至11，并将产物用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，以92％收率得到化合物10，随后将其不经进一步纯化地使用。

在15℃向化合物10(0.78g,2.67mmol)和化合物11(0.60g,3.46mmol)在THF(6mL)中的混合物中逐份加入STAB-H固体(1.29g,6.12mmol)。加入以后，移去冷却，并将混合物搅拌大约2.5小时至结束。通过加入饱和碳酸氢钠水溶液将反应淬灭，并使pH达到9。将产物用EtOAc萃取3次，将有机相合并，用盐水干燥，然后经硫酸钠过滤并浓缩。通过在硅胶上分离，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，以85％收率分离化合物12。

在-10℃经由烘干的气密注射器历时2分钟向在THF(35mL)中的DIPEA(7.53mL,53.75mmol)中加入n-BuLi(2.5M,19.9mL,49.8mmol)。将混合物在-10℃搅拌10分钟，然后冷却至-60℃，并历时5-10分钟逐滴加入甲基膦酸二甲酯(6.42g,51.8mmol)在THF(8mL)中的溶液。在-60℃老化约1小时以后，在-60℃历时5分钟逐滴加入化合物13(7.37g.39.82mmol)在THF(15mL)中的溶液。将反应混合物在-60℃搅拌1小时，并然后在-41℃搅拌约1.5小时。通过加入2.6当量的H₂SO₄(2.0M)将反应淬灭，并用乙酸乙酯(约50mL)萃取3次。将有机相合并和用盐水干燥，经硫酸钠过滤，并简单浓缩以确定粗制物重量并取样用于NMR。在确定干重后，将化合物14溶解在MeOH中不经进一步纯化用于下一反应。计算为75.83％收率。通过NMR确定粗制物重量/重量％76.3％。¹H NMR:400MHz CDCl₃δ4.75(s,1H),3.81(s,3H),3.78(s,3H),3.10-3.14(m,2H),3.04-3.09(m,2H),2.68(t,2H),1.82-1.75(m,2H),1.44(s,9H)。

向在MeOH(40mL)中的化合物14(9.33g重量，来自约12g粗制物的NMR,30.16mmol)中加入NaOH(1.45g,36.2mmol)在水(1.5mL)中的溶液。将混合物加热至50℃并加入化合物15(2.76g,22.62mmol)。搅拌30分钟以后，加入化合物15的第二部分(736mg,6.03mmol)，并将反应混合物在50℃搅拌过夜。然后将反应混合物浓缩成油，并在2体积EtOAc和1体积H₂O之间分配。将有机相分离，并用1体积的水洗涤。将水性洗液合并，并用EtOAc反萃取(2x,1体积)。将合并的有机相经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。将粗制物在大约20g硅胶上干燥，通过在硅胶上分离，用乙酸乙酯在含有1％三乙胺的己烷中的梯度洗脱，以69％收率分离化合物16。¹H NMR:400MHzCDCl₃δ9.09(dd,1H),8.17(dd,1H),8.12(d,1H),7.46(dd,1H),7.41(d,1H),4.78(s,1H),3.24(q,2H),3.10(t,2H),2.12(quin,2H),1.43(s,9H)。

在1大气压下向化合物16(5.98g,20.8mmol)在EtOH(50mL)中的溶液中加入钯(10％在碳上,2.22g,2.08mmol)和氢。将反应混合物在室温搅拌过夜。结束后，将反应混合物在上过滤并浓缩。通过在硅胶上分离，用乙酸乙酯在含有1％三乙胺的己烷中的梯度洗脱，以79％收率分离化合物17。¹H NMR:400MHz CDCl₃δ7.05(d,1H),6.34(d,1H),5.48(s,1H),4.81(s,1H),3.36-3.43(m,2H),3.16(q,2H),2.68(t,2H),2.59(t,2H),1.90(dt,2H),1.83(quin,2H),1.44(s,9H)。

将化合物17(4.81g,16.53mmol)溶解在6M HCl水溶液(16.4mL)中并在42℃加热2小时。然后加入6M HCl的另一部分(2.8mL)，并将反应混合物搅拌另外2小时。向反应物中加入氯化钠，随后加入2N NaOH水溶液直到产物作为油沉淀出来(pH大于12)。将混合物用2-丁醇萃取3次。将合并的有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。以85％收率得到化合物18，并随后不经进一步纯化地使用。¹H NMR:400MHz CDCl₃δ7.06(d,1H),6.35(d,1H),4.83(s,1H),3.35-3.46(m,2H),2.75-2.67(m,4H),2.58(t,2H),1.88-1.95(m,2H),1.84-1.76(m,4H)。

在-10℃向在火焰干燥的烧瓶中的三光气(85mg,0.28mmol)在THF(0.9mL)中的溶液中逐滴加入化合物18(236mg,0.62mmol)和TEA(0.134mL,0.96mmol)在THF(0.5mL)中的溶液。将反应混合物温热至室温。TLC指示完全反应后，加入另外的TEA(0.134mL)，随后加入作为固体的化合物12(166mg,0.87mmol)。将异质混合物在剧烈搅拌下在50℃加热2小时。结束后，将反应混合物用1体积的水淬灭，并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水干燥，经硫酸钠过滤并浓缩。假定100％收率，得到化合物19，并随后不经进一步纯化地使用。

向溶解在THF(37mL)中的粗制化合物19(400mg,假定0.62mmol)中加入H₂SO₄(2M,0.6mL)，并将混合物在室温搅拌过夜。次日早晨，加入H₂SO₄的另一部分(0.65当量)。4小时后，反应结束。将反应混合物用乙酸乙酯稀释。将有机相分离并将水相用乙酸乙酯反萃取一次。将合并的有机相经硫酸钠过滤并浓缩。通过在硅胶上分离，用MeOH在DCM中的梯度洗脱，以75％收率分离化合物20。

向化合物20(251mg,0.47mmol)和Pd/C(10重量％,100mg,0.094mmol)在乙醇(9mL)中的悬浮液中充入H₂至1大气压并在35℃搅拌过夜。结束后，通过在上过滤除去钯。使用C₁₈ 5u 19x250mm BEH柱(Waters Corp.)，用乙腈在含有1％TFA的H₂O中的梯度洗脱，通过反相HPLC以20％收率分离作为TFA盐的化合物21。

向化合物21(61mg,0.097mmol)在DCM(250uL)中的溶液中加入TEA(8uL,0.24mmol)，随后加入NHS-PEG₄-N₃(41.4mg,0.11mmol)在DCM(275μL)中的溶液。将反应混合物搅拌15分钟并通过LC-MS检查，其表明反应结束。除去所有挥发物，并将残余物溶解在EtOH(0.4mL)和水(0.4mL)中。加入LiOH(11.2mg,0.47mmol)，并将反应混合物在40℃加热2小时。结束后，将反应混合物在减压下浓缩。使用C₁₈ 5u 19x250 mm BEH柱(Waters Corp.)，用乙腈在含有1％TFA的H₂O中的梯度洗脱，通过反相HPLC以42％收率分离化合物22(结构1c)。

结构2c((S)-3-(4-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-氟苯基)-3-(2-氧代-3-(3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)咪唑烷-1-基)丙酸)的合成.

向化合物23(10g,43.4mmol)在甲苯(80mL)中的溶液中加入化合物6(21.1g,0.17mol)、PPTS(0.55g,2.2mmol)，并然后加入乙酸(1.24mL,21.7mmol))。给反应容器配备Dean Stark分离器，并然后加热至回流过夜。在结束后，将反应混合物浓缩并在60克硅胶上干燥和用乙酸乙酯在己烷中的梯度在SiO₂上纯化，以66％收率产生化合物24。¹H NMR:400MHz CDCl₃δ8.47(s,1H),7.68(d,1H),7.31-7.56(m,6H),6.98-7.16(m,1H),5.23(s,2H),1.26(s,9H)。

给火焰干燥的烧瓶装入THF(190mL)和DIPEA(9.07g,89.7mmol)，冷却至-20℃，然后经由插管装入n-BuLi(2.5M,34.2mL,85.6mmol)。将溶液在-20℃搅拌10min，然后冷却至-78℃。在剧烈搅拌下逐滴加入化合物8(8mL,81.5mmol)。加入以后，在-78℃搅拌30min。接着，历时10分钟通过加料漏斗加入ClTi(iPrO)₃(44.6g,0.171mol)在THF(40mL)中的溶液。将反应物在-78℃搅拌30分钟。最后，逐滴加入化合物24(9.06g,27.2mmol)在THF(20mL)中的悬浮液，并在-78℃搅拌1.25小时直到反应结束。向在-78℃的反应物中加入饱和氯化铵水溶液。然后将反应物从冷却移开并使水相逐渐融化和淬灭(黄橙色消失)。将混合物在EtOAc和饱和氯化铵水溶液之间分配。将有机相分离并将水相用EtOAc洗涤2次。将有机相合并和在盐水上干燥，然后经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。通过在硅胶上分离，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，以70％收率得到作为单一非对映异构体的化合物25。¹H NMR:400MHzCDCl₃δ7.31-7.48(m,5H),7.09(dd,1H),6.89-7.04(m,2H),5.13(s,2H),4.59-4.76(m,2H),4.13(q,2H),2.81(dd,2H),1.21-1.25(m,12H)。

向化合物25(8.07g,19.1mmol)中加入HCl水溶液(6M,20.7mL,0.124mol)，随后加入MeOH(60mL)。加入THF直到得到同质溶液，并将反应混合物在室温搅拌6小时。将反应混合物用2N NaOH水溶液碱化至pH 10，并然后用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水干燥，经硫酸钠过滤，并浓缩。以95％收率得到化合物26，并随后不经进一步纯化地使用。¹H NMR:400MHz CDCl₃δ7.28-7.46(m,6H),7.18(d,1H),6.99(t,1H),5.11(s,2H),4.57(t,1H),4.09(q,2H),2.97-3.09(m,1H),2.81-2.93(m,1H),1.18(t,3H)。

在0℃向化合物26(5.76g,18.2mmol)和化合物27(4.09g,23.6mmol)在THF(40mL)中的混合物中逐份加入STAB-H固体(8.85g,41.8mmol)。最后一次加入以后，移去冷却并将混合物搅拌大约2.5小时至结束。通过加入饱和碳酸氢钠水溶液将反应混合物淬灭。将混合物用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水干燥，经硫酸钠过滤，并浓缩。通过在硅胶上分离，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，以73％收率分离化合物28。¹H NMR:400MHz CDCl₃δ7.30-7.49(m,5H),7.11(dd,1H),6.88-7.02(m,2H),5.13(s,2H),4.40(t,1H),4.10(q,2H),4.00(dd,1H),3.35(s,3H),3.31(s,3H),2.47-2.75(m,4H),1.20(t,3H)。

在-10℃向在火焰干燥的烧瓶中的三光气(1.2g,4.04mmol)在THF(24mL)中的溶液中逐滴加入化合物19(3.64g,8.99mmol)和TEA(1.94mmol,13.9mmol)在THF(6mL)中的溶液。将反应混合物温热至室温。TLC指示完全反应后，加入另外的TEA(3.3mL,23.6mmol)，随后加入作为固体的化合物28(2.61g,13.7mmol)。将异质混合物在剧烈搅拌下在50℃加热2小时。结束后，将反应混合物用1体积的水淬灭，并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水干燥，经硫酸钠过滤并浓缩。假定100％收率，得到化合物29，并随后将粗制物不经进一步纯化地使用。

向溶解在THF(37mL)中的化合物29(5.59g,8.97mmol)中加入水(0.8mL)和H₂SO₄(2M,8.07ml,16.2mmol)，并将反应混合物在28℃搅拌过夜。次日早晨，使用碳酸氢钠将混合物的pH调至9，并用DCM萃取3次。将合并的有机相用盐水干燥，经硫酸钠过滤，并浓缩。通过在硅胶上分离，用MeOH在含有1％TEA的DCM中的梯度洗脱，以82％收率分离化合物30。

向溶解在EtOH(30mL)中的化合物30(4.13g,7.39mmol)加载钯(10重量％,3.15g,2.96mmol)和氢气至50psi。将混合物在室温搅拌过夜。次日，反应为64％完全。将反应混合物在上过滤并浓缩。将残余物溶解在EtOH中并加载钯(10重量％,1.57g,1.48mmol))和氢气至50psi。搅拌48小时以后，将反应混合物加热至30℃并搅拌另外24小时。在结束后，将悬浮液在上过滤并将所有挥发物在真空中除去。将残余物在硅胶上纯化，用MeOH在DCM中的梯度洗脱，以72％收率产生化合物31。¹H NMR:400MHz DMSO-d₆δ9.88(s,1H),7.02-7.14(m,2H),6.86-6.93(m,2H),6.50-6.76(m,1H),6.31(d,1H),5.17(t,1H),4.00(q,2H),3.23-3.28(m,4H),2.79-3.18(m,7H),2.61(t,2H),2.41(t,2H),1.65-1.78(m,4H),1.09(t,3H)。

在-10℃向PPh₃(699mg,2.66mmol)在THF(0.47mL)中的溶液中逐滴加入DEAD的溶液。将混合物温热至室温并加入化合物31(600mg,1.33mmol)和HO-PEG₄-N₃(466mg,3.06mmol)的纯混合物中并搅拌过夜。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在硅胶上纯化，用MeOH在DCM中的梯度洗脱，以50％收率产生化合物32。¹H NMR:400MHz DMSO-d₆δ7.10-7.19(m,2H),6.97-7.06(m,2H),6.18-6.31(m,2H),5.20(t,1H),4.13-4.16(m,1H),3.98-4.04(m,2H),3.71-3.80(m,2H),3.52-3.61(m,8H),3.38-3.37(m,5H),3.10-3.25(m,5H),2.79-3.08(m,5H),2.59(t,2H),2.31-2.42(m,2H),1.65-1.75(m,4H),1.10(t,3H)。

向化合物32(826mg,1.23mmol)中加入EtOH(3mL)和H₂O(3mL)，随后加入LiOH(97mg,4.05mmol)。将混合物在30℃搅拌过夜。在结束后，使用6M HCl水溶液将混合物中和至pH＝5并浓缩。将残余物用Phenomenex Gemini C18,50x250mm,10μm柱通过反相HPLC纯化，其中用乙腈在含有0.1％TFA的水中的梯度洗脱，以81％收率产生化合物33(结构2c)。¹HNMR:400MHz D₂Oδ7.30(d,1H),7.01-7.19(m,3H),6.45(d,1H),5.24(t,1H),4.14-4.32(m,2H),3.84-3.92(m,2H),3.59-3.77(m,10H),3.14-3.45(m,8H),.02-3.12(m,1H),2.97(d,2H),2.85(q,1H),2.50-2.72(m,4H),1.68-1.94(m,4H)。

结构2.1c((S)-3-(4-((11-叠氮基十一烷基)氧基)-3-氟苯基)-3-(2-氧代-3-(3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)咪唑烷-1-基)丙酸)的合成.

在室温向PPh₃在THF中的溶液中逐滴加入DEAD的溶液。将混合物转移至含有化合物31和OH-(CH₂)₁₁-N₃的混合物的瓶，并将反应混合物在室温搅拌过夜。从反应混合物除去挥发物，并将粗制物溶解在EtOH中。加入LiOH在H₂O中的溶液，并加入另外的水/EtOH直到反应混合物变成同质。在室温搅拌1.5小时以后，将混合物用H₂SO₄酸化至pH3，浓缩，并通过反相HPLC(Phenomenex Gemini C18,50x250mm,10μm,0.1％TFA在乙腈/水中,梯度洗脱)纯化。

结构2.2c((S)-3-(4-(2-(1-(6-叠氮基己酰基)哌啶-4-基)乙氧基)-3-氟苯基)-3-(2-氧代-3-(3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)咪唑烷-1-基)丙酸)的合成.

在0℃将溶解在DCM中的化合物35用EDAC处理，并加入乙腈以辅助溶解。5分钟以后，加入TEA和化合物36，移去冷却，并继续搅拌2小时。结束后，加入饱和氯化铵并将有机相分离，经硫酸钠过滤，并浓缩。将得到的粗制物随后不经进一步纯化地使用。

在室温在剧烈搅拌下向PPh₃在THF中的溶液中逐滴加入DEAD的溶液。将混合物转移至含有化合物31和化合物37的混合物的瓶，并将反应混合物在室温搅拌过夜。从反应混合物除去挥发物，并将粗制物溶解在EtOH中。加入LiOH在H₂O中的溶液，并加入另外的水直到反应混合物变得同质。在室温搅拌1.5小时以后，将混合物用H₂SO₄酸化至pH3，浓缩，并通过反相HPLC(Phenomenex Gemini C18,50x250mm,10μm,0.1％TFA在乙腈/水中，梯度洗脱)纯化，产生化合物38(结构2.2c)。

结构2.3c((S)-3-(4-(2-((1r,4S)-4-(5-叠氮基戊烷酰氨基)环己基)乙氧基)-3-氟苯基)-3-(2-氧代-3-(3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)咪唑烷-1-基)丙酸)的合成.

在0℃向化合物35在DCM中的悬浮液中加入EDAC在DCM中的溶液。5分钟以后，移去冷却并加入化合物39，随后加入TEA。将异质混合物在室温搅拌过夜。次日，将反应物用DCM稀释，并使沉淀物溶解。将混合物用5％KHSO₄洗涤2次和用盐水洗涤1次。将有机相经硫酸钠过滤并浓缩。将含有化合物40的粗残余物不经进一步纯化地使用。

在室温在剧烈搅拌下向PPh₃在THF中的溶液中逐滴加入DEAD的溶液。将混合物转移至含有化合物31和化合物40的混合物的瓶，并将反应混合物在室温搅拌过夜。从反应混合物除去挥发物，并将粗制物溶解在EtOH中。加入LiOH在H₂O中的溶液，并加入另外的水直到反应混合物变得同质。在室温搅拌1.5小时以后，将混合物用H₂SO₄酸化至pH3，浓缩，并通过反相HPLC(Phenomenex Gemini C18,50x250mm,10μm,0.1％TFA在乙腈/水中，梯度洗脱)纯化，产生化合物41(结构2.3c)。

结构2.4c((S)-3-(4-(4-(5-叠氮基戊烷酰氨基)苯乙氧基)-3-氟苯基)-3-(2-氧代-3-(3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)咪唑烷-1-基)丙酸)的合成.

向化合物35和化合物42在DCM中的混合物中加入EEDQ，并将溶液在室温搅拌过夜。然后将反应混合物用DCM稀释，用1M HCl洗涤3次，并用盐水洗涤1次。将有机相经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。然后将化合物43不经进一步纯化地使用。

在室温在剧烈搅拌下向PPh₃在THF中的溶液中逐滴加入DEAD的溶液。将混合物转移至含有化合物31和化合物43的混合物的瓶，并将反应混合物在室温搅拌过夜。从反应混合物除去挥发物，并将粗制物溶解在EtOH中。加入LiOH在H₂O中的溶液，并加入另外的水直到反应混合物变得同质。在室温搅拌1.5小时以后，将混合物用H₂SO₄酸化至pH3，浓缩，并通过反相HPLC(Phenomenex Gemini C18,50x250mm,10μm,0.1％TFA在乙腈/水中，梯度洗脱)纯化，产生化合物44(结构2.4c)。

结构2.5c((S)-3-(4-(4-((5-叠氮基戊基)氧基)苯乙氧基)-3-氟苯基)-3-(2-氧代-3-(3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)咪唑烷-1-基)丙酸)的合成.

向化合物45和化合物46在丙酮中的溶液中加入碳酸钾。在N₂保护下在剧烈搅拌下将混合物作为悬浮液在密封瓶中加热至65℃过夜。然后将反应物过滤，浓缩，并在硅胶上纯化，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，产生化合物47。

向化合物47在DMF中的溶液中加入叠氮化钠，并将混合物在密封瓶中在氮气保护下在80℃搅拌过夜。结束后，加入1体积的水，并将产物用乙酸乙酯萃取。将分离的有机相经硫酸钠过滤并浓缩。将化合物48的粗制物不经进一步纯化地使用。

在室温在剧烈搅拌下向PPh₃在THF中的溶液中逐滴加入DEAD的溶液。将混合物转移至含有化合物31和化合物48的混合物的瓶，并将反应混合物在室温搅拌过夜。从反应混合物除去挥发物，并将粗制物溶解在EtOH中。加入LiOH在H₂O中的溶液，并加入另外的水直到反应混合物变得同质。在室温搅拌1.5小时以后，将混合物用H₂SO₄酸化至pH3，浓缩，并通过反相HPLC(Phenomenex Gemini C18,50x250mm,10μm,0.1％TFA在乙腈/水中，梯度洗脱)纯化，产生化合物49(结构2.5c)。

结构2.6c((S)-3-(3-(3-(3-(17-叠氮基-3-氧代-6,9,12,15-四氧杂-2-氮杂十七烷基)-5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)-2-氧代咪唑烷-1-基)-3-(3-氟-4-甲氧基苯基)丙酸)的合成.

在0℃向PPh₃在THF中的溶液中逐滴加入DEAD的溶液。完全加入以后，将混合物转移至含有化合物31和MeOH的纯混合物的瓶。将瓶用N₂封帽并在室温搅拌过夜。在结束后，除去所有挥发物，并将得到的粗制物在硅胶上纯化，用MeOH在DCM中的梯度洗脱，产生化合物50。

向化合物50在AcOH中的溶液中加入溴，并将混合物搅拌0.5小时。结束后，将反应物用5体积的乙酸乙酯和2.5体积的水稀释。将水层用饱和碳酸氢钠水溶液中和至pH 7，并将有机相分离。将水层用乙酸乙酯萃取另外2次。将合并的有机相经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。随后将得到的化合物51的粗制物不经进一步纯化地使用。

将化合物51、Pd(PPh₃)₄和Zn(CN)₂在DMAC中的溶液用氮气脱气30分钟。将混合物在密封瓶中在128℃加热过夜。结束后，将混合物用5体积的EtOAc稀释。将有机相分离，然后用水洗涤2次，用盐水洗涤2次，然后将有机相经硫酸钠过滤并浓缩。将残余物在硅胶上纯化，用100％EtOAc洗脱，产生化合物52。

向化合物52在MeOH中的溶液中加入氨，然后加入用甲醇预冲洗3次的拉尼镍浆。将烧瓶用氢气充气至60psi并在室温搅拌16小时。结束后，将悬浮液过滤并浓缩。将得到的粗残余物再溶解在DMF中。加入DIEA和NHS-PEG₄-N₃，并将混合物搅拌1小时。结束后，除去所有挥发物，并将粗残余物再溶解在MeOH和THF的混合物中。加入LiOH在H₂O中的溶液，并将混合物在室温搅拌17小时。反应结束后，用TFA将pH调至3，并将混合物直接注射到半-制备型反相HPLC(Phenomenex Gemini C18,250x21.2mm,5μm,0.1％TFA在水/ACN中，梯度洗脱)上，产生化合物53(结构2.6c)。

结构2.7c((S)-N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-(2-氧代-3-(3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)咪唑烷-1-基)丙酰胺)、结构2.8c、结构2.9c和结构2.10c的合成.

在0℃向化合物31中依次逐滴加入THF、PPh₃和DEAD的溶液。将混合物在室温搅拌16小时。然后将混合物冷却至-20℃保持1小时并过滤以除去三苯基膦氧化物。将滤液浓缩，并通过在硅胶上纯化分离O-烷基化的中间体，其中用乙酸乙酯在含有1％TEA的己烷中的梯度洗脱。然后将分离的中间体悬浮于THF和H₂O的混合物中，用LiOH在H₂O中的溶液处理，并在35℃搅拌16小时。结束后，用2M HCl将pH调至7，并除去所有挥发物。将粗制物悬浮于H₂O中；加入氯化钠，并将化合物54用乙酸乙酯萃取5次。将有机相合并，经硫酸钠过滤并浓缩。随后将化合物54不经进一步纯化地使用。

将化合物54在DMF中的溶液用HBTU处理并搅拌5分钟。随后加入DIEA和N₃-PEG₃-NH₂，并将混合物在室温搅拌16小时。结束后，用TFA将pH调至3，并通过直接注射进半-制备型反相HPLC(Phenomenex Gemini C18,250x21.2mm,5μm,0.1％TFA在水/ACN中，梯度洗脱)分离化合物55，产生化合物55。

分别使用N₃-PEG₁₁-NH₂、N₃-PEG₂₃-NH₂和N₃-PEG₃₅-NH₂，使用类似的规程合成化合物2.8c、2.9c和2.10c。

结构2.11c((R)-3-(4-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-氟苯基)-3-(2-氧代-3-(3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基)咪唑烷-1-基)丙酸)的合成.

在用氮惰性气氛净化和维持的3-L 4-颈圆底烧瓶中，放入THF(1.50L)、DIPEA(150.00mL,716.000mmol,0.88当量)、正BuLi(430.00mL,680.000mmol,0.84当量)。这之后在-60℃加入亚磷酸三甲酯(195.00mL)并在-60℃搅拌1h。在-60℃向其中加入2-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(150.00g,809.835mmol,1.00当量)。将得到的溶液在液氮浴中在-60℃搅拌1h。然后将反应物通过加入350mL H₂SO₄(2N)淬灭，并用1.5L H₂O稀释。将得到的溶液用2x1L乙酸乙酯萃取。将得到的混合物用1x1L H₂O洗涤，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。这产生200g(粗制的)作为黄色油的N-[5-(二甲氧基磷酰基)-4-氧代戊基]氨基甲酸叔丁酯。

在3-L圆底烧瓶中放入N-[5-(二甲氧基磷酰基)-4-氧代戊基]氨基甲酸叔丁酯(200.00g,1500.00mmol,1.50当量)、MeOH(1.50L)、2-氨基吡啶-3-甲醛(53.00g,1000.00mmol,1.00当量)、NaOH(50.00g,1500.00mmol,1.50当量)。将得到的溶液在油浴中在50℃搅拌16h。用NaHCO₃(水溶液)将溶液的pH值调至8。将得到的混合物浓缩。然后将反应物通过加入1.5L水淬灭，并用2x1.5L乙酸乙酯萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。这产生160g(粗制的)作为黄色油的N-[3-(1,8-萘啶-2-基)丙基]氨基甲酸叔丁酯。

在5-L圆底烧瓶中放入N-[3-(1,8-萘啶-2-基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(160.00g,556.787mmol,1.00当量)、MeOH(2.00L)、Rh/C(140.00g,1.360mmol)、H₂(40Psi)。将得到的溶液在25℃搅拌16h。将固体滤出。将得到的混合物浓缩。这产生106g(65.33％)作为黄色固体的N-[3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基]氨基甲酸叔丁酯。

在1-L圆底烧瓶中放入N-[3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(106.00g,363.767mmol,1.00当量)、EtOAc(500.00mL)、HCl在EtOAc中的溶液(4M,400.00mL)。将得到的溶液在25℃搅拌3h。将得到的溶液用1L H₂O稀释。采用NaOH(水溶液)将pH调至11。将得到的溶液用2x1L乙酸乙酯萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。这产生56g(80.48％)作为黄色固体的3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙烷-1-胺。

在2-L圆底烧瓶中放入3-氟-4-羟基苯甲醛(140.00g,999.194mmol,1.00当量)、ACN(1000mL)、(溴甲基)苯(205.08g,1199.039mmol,1.20当量)、K₂CO₃(414.28g,2997.581mmol,3.00当量)。将得到的溶液在25℃搅拌16h。将固体滤出。将得到的混合物浓缩。这产生230g(99.98％)作为白色固体的4-(苄氧基)-3-氟苯甲醛。

在3-L圆底烧瓶中放入4-(苄氧基)-3-氟苯甲醛(230.00g,998.966mmol,1.00当量)、DCM(1600mL)、(S)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(145.29g,1198.762mmol,1.20当量)、Cs₂CO₃(650.97g,1997.933mmol,2.00当量)。将得到的溶液在油浴中在50℃搅拌6h。将固体滤出。将得到的混合物浓缩。这产生260g(78.06％)作为白色固体的(S)-N-[[4-(苄氧基)-3-氟苯基]亚甲基]-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺。

在用氮惰性气氛净化和维持的3-L圆底烧瓶中放入THF(2.0L)、Zn(1.02kg,15595.945mmol,20.00当量)、CuCl(115.80g,1169.696mmol,1.50当量)、2-溴乙酸乙酯(325.57g,1949.498mmol,2.50当量)、(S)-N-[[4-(苄氧基)-3-氟苯基]亚甲基]-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(260.00g,779.797mmol,1.00当量)。将得到的溶液在水/冰浴中在0℃搅拌30min。使得到的溶液在搅拌下反应另外2h，同时在油浴中将温度维持在50℃。将固体滤出。将得到的混合物浓缩。然后将反应物通过加入2L水淬灭，并用2x2L乙酸乙酯萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。这产生150g(45.63％)作为黄色油的(3R)-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]-3-[[(S)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰基]氨基]丙酸乙酯。

在1-L圆底烧瓶中放入(3R)-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]-3-[[(S)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰基]氨基]丙酸乙酯(150.00g,355.847mmol,1.00当量)、HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(400.00mL,4M)。将得到的溶液在25℃搅拌2h。将得到的混合物浓缩。然后将反应物通过加入1L水淬灭。采用NaHCO₃(水溶液)将pH调至8。将得到的溶液用2x1L乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥并浓缩。这产生100g(88.55％)作为黄色油的(3R)-3-氨基-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]丙酸乙酯。

在2-L圆底烧瓶中放入(3R)-3-氨基-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]丙酸乙酯(100.00g,315.100mmol,1.00当量)、THF(1.00L)、2,2-二甲氧基乙醛(49.21g,472.696mmol,1.50当量)、NaBH(OAc)₃(133.57g,630.199mmol,2.00当量)。将得到的溶液在25℃搅拌2h。然后将反应物通过加入1L水淬灭。将得到的溶液用2x1L乙酸乙酯萃取，经Na₂SO₄干燥并在真空下浓缩。这产生80g(62.62％)作为黄色油的(3R)-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]-3-[(2,2-二甲氧基乙基)氨基]丙酸乙酯。

在2-L 3-颈圆底烧瓶中放入三光气(22.25g,74.975mmol,0.38当量)、THF(500mL)、(3R)-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]-3-[(2,2-二甲氧基乙基)氨基]丙酸乙酯(80.00g,197.304mmol,1.00当量)、TEA(29.95g,295.956mmol,1.50当量)、3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙烷-1-胺(化合物177,33.97g,177.573mmol,0.90当量)。将得到的溶液在油浴中在50℃搅拌1h。然后将反应物通过加入1L水淬灭。采用NaHCO₃(水溶液)将pH调至8。将得到的溶液用2x1L乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥并浓缩。这产生96g(78.13％)作为黄色粗制油的(3R)-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]-3-[(2,2-二甲氧基乙基)([[3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基]氨甲酰基])氨基]丙酸乙酯。

在1000-mL圆底烧瓶中放入(3R)-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]-3-[(2,2-二甲氧基乙基)([[3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基]氨甲酰基])氨基]丙酸乙酯(96.00g,154.158mmol,1.00当量)、THF(500.00mL)、H₂SO₄(180.00mL,2M)。将得到的溶液在25℃搅拌16h。采用NaOH(5M)将pH调至8。将得到的溶液用2x1L二氯甲烷萃取，经无水硫酸钠干燥并浓缩。将残余物与二氯甲烷/甲醇(50/1)一起应用到硅胶柱上。将收集的级分合并，并浓缩。这产生73g(84.76％)作为黄色油的(3R)-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]-3-[2-氧代-3-[3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基]-2,3-二氢-1H-咪唑-1-基]丙酸乙酯。

在3-L圆底烧瓶中放入(3R)-3-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]-3-[2-氧代-3-[3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基]-2,3-二氢-1H-咪唑-1-基]丙酸乙酯(73.00g,130.671mmol,1.00当量)、EtOH(1.50L)、Pd(OH)₂/C(60.00g,427.259mmol,3.27当量)、H₂(50大气压)。将得到的溶液在25℃搅拌72h。将固体滤出。将残余物与二氯甲烷/甲醇(9/1)一起应用到硅胶柱上。将收集的级分合并，并浓缩。这产生41.0415g(66.75％)作为黄色油的(3R)-3-(3-氟-4-羟基苯基)-3-[2-氧代-3-[3-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)丙基]咪唑烷-1-基]丙酸乙酯。

LCMS-PH-ARP-052-0:[MS+1]+＝471

旋光[a]_D ^20.0＝+37.5°(C＝1g/100ml在MeOH中)

H-NMR:(300MHz,DMSO-d₆,ppm)δ9.84(s,1H),7.07-7.00(m,2H),6.95-6.850(m,2H),6.24(d,2H),5.18(t,1H),4.06-3.96(m,2H),3.32-2.75(m,10H),2.60(t,2H),2.37(t,2H),1.77-1.67(m,4H),1.10(t,3H)。

在-10℃向PPh₃在THF中的溶液中逐滴加入DEAD的溶液。将混合物温热至室温并加入化合物185和HO-PEG₄-N₃的纯混合物，并搅拌过夜。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在硅胶上纯化，用MeOH在DCM中的梯度洗脱，产生化合物186。

向化合物186中加入EtOH和H₂O，随后加入LiOH。将混合物在30℃搅拌过夜。在结束后，将混合物使用6M HCl水溶液中和至pH＝5并浓缩。将残余物用Phenomenex Gemini C18,50x250mm,10μm柱通过反相HPLC纯化，用乙腈在含有0.1％TFA的水中的梯度洗脱，产生化合物187(结构2.11c)。

结构28c(化合物118a)结构29c(化合物118b)、结构31c(化合物119a)和结构30c(化合物119b)的合成.

在-78℃向LHMDS(1.0M的在THF中的溶液，95mL,95mmol)和THF(60mL)的溶液中逐滴加入化合物103(2-甲基-[1,8]萘啶(12.5g,86.7mmol))在THF(180mL)中的溶液。搅拌30分钟以后，向反应混合物中逐滴加入化合物104(5-溴-1-戊烯(19.4g,130mmol))在THF(120mL)中的溶液。将反应混合物温热至0℃并搅拌4小时。将反应混合物用饱和NH₄Cl水溶液(100mL)和去离子水(100mL)淬灭，然后用乙酸乙酯(2x400mL)萃取。将合并的有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，并将化合物105通过分离，用50-100％乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱。化合物105的产量:7.93g(43％)。

在室温向化合物105(2.50g,11.8mmol)在丙酮(67.5mL)、水(7.5mL)和2,6二甲基吡啶(2.74mL,23.6mmol)中的溶液中加入4-甲基吗啉N-氧化物(2.07g,17.7mmol)和四氧化锇(2.5重量％在叔丁醇中,2.40g,0.24mmol)。搅拌75分钟以后，将(二乙酰氧基碘代)苯(5.69g,17.7mmol)加入反应混合物中。将反应混合物搅拌2小时，然后用饱和硫代硫酸钠水溶液(100mL)淬灭，并用乙酸乙酯(2x100mL)萃取。将合并的有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，并将化合物106通过分离，用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的梯度洗脱。化合物106的产量:1.12g(44％)。

在0℃向氢化钠(60％的在矿物油中的分散体,0.185g,4.64mmol)在THF(9mL)中的悬浮液中加入化合物107((N-甲氧基-N-甲基氨甲酰基甲基)膦酸二乙酯)(1.06g,4.43mmol)在THF(5mL)中的溶液。搅拌30分钟以后，逐滴加入化合物106(0.903g,4.21mmol)在THF(9mL)中的溶液。将反应混合物在0℃搅拌10分钟，然后用饱和NH₄Cl水溶液(30mL)淬灭，并用乙酸乙酯(3x30mL)萃取。将合并的有机相用半饱和NaHCO₃水溶液洗涤2次。将有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。化合物108的产量:1.40g(假定100％收率并不经进一步纯化用在后续步骤中)。

向化合物108(1.31g,4.38mmol)在乙酸乙酯(20mL)中的溶液中加入Pd/C(10％负载，0.466g,0.44mmol)。将反应容器用H₂增压至50PSI。搅拌3.5小时以后，将反应混合物在上过滤并用甲醇冲洗。将滤液浓缩并将化合物109通过分离，用50-100％乙酸乙酯在含有1％三乙胺的己烷中的梯度洗脱。化合物109的产量:0.833g(62％)。

向化合物109(0.833g,2.73mmol)在THF(10mL)中的溶液中加入DIEA(0.590mL,3.41mmol)和二碳酸二叔丁酯(0.744g,3.41mmol)。将反应混合物加热至50℃保持5小时。基于LC/MS，反应是不完全的，并加入DIEA的另外部分(0.590mL,3.41mmol)和二碳酸二叔丁酯(0.744g,3.41mmol)。将反应混合物在50℃加热另外16小时。将反应混合物浓缩，并通过分离化合物110，用50-100％乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱。化合物110的产量:0.934g(84％)。

在-78℃历时3分钟向正丁基锂(2.5M在己烷中，0.70mL,1.8mmol)和THF(1.5mL)的溶液中逐滴加入化合物111(5-溴-2-(苯基甲氧基)-吡啶)(0.465g,1.8mmol)在THF(0.8mL)中的溶液。然后加入化合物110(0.535g,1.3mmol)在THF(1mL)中的溶液。搅拌30分钟以后，将反应物温热至0℃，用饱和NH₄Cl水溶液(10mL)淬灭，并用6M HCl水溶液进一步酸化至pH7。将混合物用乙酸乙酯(3x10mL)萃取。将合并的有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。向粗制物在THF(8mL)中的溶液中加入DIEA(0.94mL,5.4mmol)和二碳酸二叔丁酯(1.18g,5.4mmol)。将混合物在40℃搅拌过夜。将反应混合物浓缩，并通过分离化合物112，用0-40％乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱。化合物112的产量:471mg(50％)。

在0℃向氢化钠(60％的在矿物油中的分散体,0.106g,2.65mmol)在二甲氧基乙烷(2mL)中的悬浮液中加入化合物113(膦酰基乙酸三乙酯)(0.593g,2.65mmol)在二甲氧基乙烷(1mL)中的溶液。搅拌20分钟以后，将反应混合物温热至室温，并加入化合物112(0.467g,0.88mmol)在二甲氧基乙烷(2mL)中的溶液。将反应混合物在70℃加热4小时。用饱和NH₄Cl水溶液(10mL)淬灭反应，并将产物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取。将有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，并将化合物114通过分离为顺式:反式异构体的1:1混合物，用0-30％乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱。化合物114的产量:392mg(74％)。

向化合物114(390mg,0.65mmol)在乙醇(6mL)中的溶液中加入Pd/C(10％负载,69mg,0.07mmol)。将反应容器用H₂增压至50PSI。搅拌4小时以后，将反应混合物在上过滤并用甲醇冲洗。将滤液浓缩并将化合物115通过分离为外消旋混合物，用0-10％的甲醇在DCM中的梯度洗脱。化合物115的产量:95mg(29％)。使用手性半-制备型HPLC(250x21mmAD柱,5μm,90/10己烷/EtOH,40mL/min)分离42mg第一洗脱的R-异构体(R_T＝12-14m,>99％ee,化合物115a)和40mg第二洗脱的S-异构体(R_T＝15-18m,>98％ee,化合物115b)。基于Coleman等人.47J.Med.Chem.4834(2004)报告的结构上类似的化合物的洗脱次序，指定R-和S-异构体的身份。

结构28c((R)-3-(6-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶- 3-基)-9-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)壬酸)和31c((R)-3-(1-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙 氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-9-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶- 2-基)壬酸)

向化合物115a(41mg,0.08mmol)和N₃-PEG₄-OTs(61mg,0.16mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中加入碳酸铯(53mg,0.16mmol)。将反应混合物在40℃搅拌1小时。将反应混合物用NaHCO₃水溶液(1mL)淬灭，然后用乙酸乙酯(3x3mL)萃取。将有机相在减压下浓缩。随后将N-和O-烷基化的位置异构体的粗制混合物不经进一步纯化地使用。

向化合物116a和117a(58mg,0.08mmol,9a:10a的4:6混合物)在THF(1.0mL)和去离子水(1.0mL)中的溶液中加入氢氧化锂(6mg,0.25mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，并然后在35℃搅拌2小时。加入氢氧化锂的另一部分(4mg,0.16mmol)，并将反应温度升高至40℃。搅拌3小时以后，加入氢氧化锂的最后部分(4mg,0.25mmol，共16mg,0.66mmol)。将反应混合物在50℃搅拌3小时。将反应混合物用6N HCl水溶液酸化至pH7并在减压下浓缩。通过分离位置异构体化合物118a和119a，用0-5％的甲醇在含有0.5％乙酸的DCM中的梯度洗脱。将化合物118a通过反相HPLC(Thermo Scientific^TM Aquasil^TM C18,250x21.2mm,5μm,20mL/min,0.1％TFA在水/ACN中，梯度洗脱)进一步纯化，产生13mg化合物118a(结构28c)。在相同条件下纯化化合物119a，产生16mg化合物119a(结构31c)。

结构29c((S)-3-(6-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶- 3-基)-9-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)壬酸)和30c((S)-3-(1-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙 氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-9-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶- 2-基)壬酸)

向化合物115b(40mg,0.08mmol)和N₃-PEG₄-OTs(58mg,0.16mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中加入碳酸铯(51mg,0.16mmol)。将反应混合物在40℃搅拌30分钟。将反应混合物用NaHCO₃水溶液(1mL)淬灭，然后用乙酸乙酯(3x3mL)萃取。将有机相在减压下浓缩。随后将N-和O-烷基化的位置异构体的粗制混合物不经进一步纯化地使用。

向化合物116b和117b(56mg,0.08mmol,9a:10a的4:6混合物)在THF(0.75mL)和去离子水(0.75mL)中的溶液中加入氢氧化锂(6mg,0.25mmol)。将反应混合物在45℃搅拌2.5小时。加入氢氧化锂的另一部分(6mg,0.25mmol)并将反应混合物搅拌2.5小时。将反应温度降低至35℃并将混合物搅拌过夜。将反应混合物用6N HCl水溶液酸化至pH＝7并在减压下浓缩。通过CombiFlash分离位置异构体化合物118b和119b，用0-5％的甲醇在含有0.5％乙酸的DCM中的梯度洗脱。将化合物118b通过反相HPLC(Thermo Scientific^TM Aquasil^TMC18,250x21.2mm,5μm,20mL/min,0.1％TFA在水/ACN中，梯度洗脱)进一步纯化，产生14mg化合物118b(结构29c)。在相同条件下纯化化合物119b，产生18mg化合物119b(结构30c)。

结构32c((R)-3-(4-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-氟苯基)-3-(N-甲基-5-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)戊烷酰氨基)丙酸)的合成

向经过筛的化合物120(2.75g,11.94mmol)在甲苯(80mL)中的溶液中加入化合物121(5.79g,47.78mmol)，随后加入PPTS(300mg,1.19mmol)，然后加入AcOH(683uL,11.94mmol)。将反应物回流过夜。在结束后，通过加入饱和碳酸氢钠淬灭反应。将有机层用2体积的乙酸乙酯稀释，分离，并经硫酸钠过滤。将产物在硅胶上分离，用乙酸乙酯(0-30％)在己烷中的梯度洗脱，产生2.054g(54％)。

在-78℃向DIA(2.85mL,20.33mmol)在THF(15mL)中的溶液中逐滴加入2.5M的n-BuLi溶液(7.76mL,19.41mmol)。在-78℃继续搅拌5分钟，并逐滴加入乙酸乙酯(1.81mL,18.48mmol)。在-78℃继续搅拌另外10分钟，并逐滴加入三异丙氧化氯钛(9.27mL,38.381mmol)在THF(10mL)中的溶液。在-78℃继续搅拌另外15分钟，并逐滴加入化合物122(2.054g,6.16mmol)在THF(10mL)中的溶液。在-78℃继续搅拌1.5小时。在结束后，通过加入饱和碳酸氢铵淬灭反应。将悬浮液用6体积的乙酸乙酯稀释并将有机层分离，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将产物在硅胶上分离，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，产生1.043g(53％)。

向搅拌的化合物123(1.043g,2.47mmol)在MeOH(3mL)中的溶液中加入4M的HCl在二氧杂环己烷中的溶液(3.09mL,12.37mmol)。在去保护完全后，将溶液用水(8mL)稀释并用乙醚(6mL)洗涤2次。随后用氢氧化钠将水层调至pH 11。将沉淀物用乙酸乙酯萃取，并将合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，产生0.616g(78.5％)产物124，将其不经进一步纯化地使用。

在0℃向化合物125(92.1mg,0.275mmol)在THF(1.5mL)中的溶液中加入DCC(68.1mg,0.331mmol)。5分钟以后，加入PNP(106.1mg,0.331mmol)，移去冰浴，并继续搅拌1小时。在结束后，将悬浮液冷却至-20℃保持1小时，并通过过滤除去沉淀物。将上清液浓缩，并产生129mg(103％)粗产物126，随后将其不经进一步纯化地使用。

将含有在DMF(2mL)中的化合物124(148.6mg,0.468mmol)和碳酸钾(129mg,0.937mmol)的混合物用碘代甲烷(66.5mg,0.468mmol)处理并在50℃搅拌3小时。在烷基化结束后，除去所有挥发物，并将产物在硅胶上分离，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，各自用1％TEA缓冲，产生94.6mg(61％)。

向化合物127(94.5mg,0.285mmol)在DMF(2mL)中的溶液中加入DIEA(149uL,0.856mmol)，随后加入化合物126(129.9mg,0.285mmol)，并将混合物在80℃搅拌1小时。在结束后，除去所有挥发物，并将粗制物溶解在MeOH中，用10％炭载钯(20mg)处理，并将烧瓶用60PSI的氢充气。在结束后，将悬浮液过滤。将上清液浓缩，并将得到的粗产物随后不经进一步纯化地使用。

将含有在DMF(2mL)中的化合物128(159mg,0.285mmol)、溴-PEG₂-叠氮化合物(74.7mg,0.314mmol)和碳酸铯(204mg,0.627mmol)的混合物加热至60℃保持2小时。在结束后，除去所有挥发物，并将粗制物用4M的HCl在二氧杂环己烷中的溶液(0.5mL,2mmol)处理，并加热至40℃保持3小时。在结束后，除去所有挥发物。将粗制物悬浮于THF(1mL)、MeOH(1.5mL)和H₂O(1.5mL)的混合物中，用氢氧化锂(83.5mg,3.48mmol)处理，并加热至40℃保持16小时。在结束后，用TFA将pH调至3，并将产物通过在C18柱(21.2x250mm,5微米)上分离进行分离，用乙腈在含有0.1％TFA的水中的梯度洗脱，以产生33.1mg(20％)。

结构33c((R)-1-叠氮基-13-(3-氟-4-甲氧基苯基)-12-(5-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)戊酰基)-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十五烷-15-酸)的合成

将含有在甲苯(45mL)中的化合物130(1.5g,9.73mmol)、(R)叔丁基亚磺酰胺(2.36g,19.46mmol)和AcOH(0.14mL)的混合物在配备Dean-Stark分离器的烧瓶中回流16小时。在结束后，通过加入饱和碳酸氢钠淬灭反应。将有机层分离，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将产物通过在硅胶上分离进行分离，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，产生1.714g(68.4％)。

在-78℃向DIA(3.056mL,21.80mmol)在THF(18mL)中的溶液中逐滴加入2.5M的n-BuLi溶液(8.324mL,20.81mmol)。在-78℃继续搅拌5分钟，并逐滴加入乙酸乙酯(1.94mL,19.82mmol)。在-78℃继续搅拌另外10分钟，并逐滴加入三异丙氧化氯钛(9.94mL,41.62mmol)在THF(10mL)中的溶液。在-78℃继续搅拌另外15分钟，并逐滴加入化合物131(1.70g,6.61mmol)在THF(12mL)中的溶液。在-78℃继续搅拌1.5小时。在结束后，通过加入饱和碳酸氢铵淬灭反应。将悬浮液用7体积的乙酸乙酯稀释并将有机层分离，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将产物在硅胶上分离，用乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，产生0.984g(43％)。

在0℃向化合物132(0.975g,2.82mmol)在EtOH(6mL)中的溶液中加入在二氧杂环己烷中的4M HCl(2.12mL,8.47mmol)并搅拌30分钟。在结束后，将反应物用水(15mL)稀释，并用乙醚洗涤。将有机层分离，并用氢氧化钠将水层的pH调至12。将水层用5体积的乙酸乙酯洗涤并将有机层分离，经硫酸钠过滤并浓缩。将产物通过在硅胶上分离进行分离，用乙酸乙酯在含有1％TEA的己烷中的梯度洗脱，以产生0.434g(64％)。

向经过分子筛的在THF(2mL)中的化合物133(0.120g,0.497mmol)和PEG(0.151g,0.696mmol)的混合物中加入STAB-H(0.253g,1.19mmol)，并将悬浮液在室温搅拌16小时。在结束后，通过加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，并将粗制物用三部分的乙酸乙酯萃取。将分离的有机萃取物合并，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。随后将得到的粗制物不经进一步纯化地使用。

将在DMF(2mL)中的化合物134(0.200g,0.597mmol)用HATU(0.227g,0.597mmol)处理并搅拌5分钟。向活化的酯加入DIEA(0.259mL,1.49mmol)，随后加入在DMF(1mL)中的化合物125(0.220g,0.497mmol)，并将得到的混合物搅拌1小时。除去所有挥发物，并将得到的粗制物用纯TFA(3.8mL)处理，并在40℃搅拌3小时。在BOC除去结束后，除去所有挥发物，并将粗制物悬浮于THF(4mL)、水(8mL)和MeOH(8mL)的混合物中。将得到的混合物用LiOH(71.6mg,2.98mmol)处理，并加热至40℃保持16小时。在结束后，用TFA将pH调至3，并将产物通过在c18柱(21.2x250mm,5微米)上分离进行分离，用乙腈在含有0.1％TFA的水中的梯度洗脱，以产生56.2mg(18％,3-步)。

结构34c((S)-1-叠氮基-13-(3-氟-4-甲氧基苯基)-12-(5-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)戊基)-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十五烷-15-酸)的合成

在0℃将在THF(9.0mL)和MeOH(0.5mL)的混合物中的化合物136(0.500g,1.45mmol)用硼氢化锂(94.5mg,4.34mmol)处理。移去冷却并继续搅拌直到气体形成停止。将反应混合物用5体积的EtOAc稀释。将有机层用碳酸氢铵洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。使用乙酸乙酯在己烷中的梯度，将产物通过在硅胶上洗脱进行分离，产生309mg(67％)。

在0℃向含有在DCM(9mL)中的化合物137(0.305g,0.952mmol)的溶液中加入分成几个部分的Martin氏试剂。加入几滴水，移去冷却，并将反应物搅拌3小时。在结束后，将混合物用饱和碳酸氢钠洗涤，然后用饱和硫代硫酸钠洗涤。将分离的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将产物138在硅胶上分离，用MeOH在DCM中的梯度洗脱，产生140mg(46％)。

向经过分子筛的含有在THF(2.5mL)中的化合物1(85.2mg,0.353mmol)和138(134.9mg,0.424mmol)的混合物中加入STAB-H(0.150g,0.706mmol)，并将得到的悬浮液加热至40℃保持16小时。在结束后，将反应物用5体积的乙酸乙酯稀释并用饱和碳酸氢钠处理。将有机层分离，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将产物通过在硅胶上分离进行分离，用MeOH在含有1％TEA的DCM中的梯度洗脱，以产生64mg(33％)。

向经过分子筛的含有在MeOH(1mL)中的化合物140(60mg,0.110mmol)、Ald-PEG₃-N₃(71.9mg,0.331mmol)和AcOH(3μL,0.0276mmol)的混合物中加入氰基硼氢化钠(28.9mg,0.276mmol)，并将反应物在40℃搅拌3小时。在结束后，将混合物冷却至0℃，加入水(0.15mL)，并将溶液使用HCl(4M)在二氧杂环己烷中的溶液酸化至pH7。随后除去所有甲醇，加入4M的HCl(0.138mL,0.552mmol)在二氧杂环己烷中的溶液，并将混合物在40℃搅拌2小时。在BOC除去结束后，除去所有挥发物，并将粗制物悬浮于THF(1mL)、水(2mL)和MeOH(2mL)的混合物中，并用氢氧化锂(26.5mg,1.104mmol)处理。在酯除去结束后，通过加入TFA将pH调至3，并将产物通过在(21.2x250mm)C18柱上分离进行分离，用乙腈在含有0.1％TFA的水中的梯度洗脱，以产生16.4mg(24％,3-步)。

结构36c((S)-3-(4-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-氟苯基)-9-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)壬酸)的合成

在室温向6-氧代庚酸(9.74g,68mmol)在DCM(30mL)和MeOH(75mL)中的溶液中加入浓H₂SO₄(0.18mL,3.4mmol)。将反应混合物回流过夜。然后将反应混合物浓缩成油，再溶解在DCM(150mL)中，并用饱和NaHCO₃水溶液(2x40mL)和盐水(40mL)洗涤。将有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。将产物不经进一步纯化地用于下一步。化合物141的产量:10.2g(95％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.58(s,3H),2.43(t,2H),2.29(t,2H),1.46(m,4H)。

向化合物141(10.2g,65mmol)和2-氨基-3-甲酰基吡啶(7.89g,65mmol)在EtOH(80mL)中的溶液中加入L-脯氨酸(3.72g,32mmol)。将反应混合物回流加热过夜。然后将反应混合物浓缩，溶解在EtOAc(50mL)中，并用水(3x30mL)洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。使用硅胶作为固定相，将残余物通过CombiFlash纯化，并用EtOAc在DCM中的梯度(10-100％)洗脱。化合物142的产量:6.08g(39％)。C₁₄H₁₆N₂O₂[M+H]⁺的计算质量:245.13,实测:245.21。

向化合物142(6.08g,24.9mmol)在MeOH(50mL)中的溶液中加入Pd/C(10％负载,Degussa型,1.99g,1.87mmol)。将反应烧瓶用氮气充气，抽真空，并用氮气回填3次。用氢气重复该过程，并将反应容器最后用氢气充气(1大气压)并在室温搅拌过夜。将反应混合物在上过滤，将垫用MeOH冲洗，并将滤液浓缩。假定100％收率，将产物化合物143不经进一步纯化地用于下一步。C₁₄H₂₀N₂O₂[M+H]⁺的计算质量:249.16,实测:249.08。

通过注射泵在-78℃历时1h向甲基膦酸二甲酯(12.3g,100mmol)在无水THF(120mL)中的溶液中加入n-BuLi溶液(2.5M在己烷中，40mL,100mmol)。将化合物143(6.175g,24.9mmol)在THF(40mL)中的溶液在-78℃历时45分钟加入反应混合物。在-78℃搅拌20分钟以后，将反应混合物用饱和NH₄Cl水溶液(200mL)淬灭，温热至室温，并用EtOAc(400mL)萃取。将有机层用水(200mL)和盐水(200mL)洗涤。将有机相分离,经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。将产物不经进一步纯化地用于下一步。化合物144的产量:7.86g(93％)。C₁₆H₂₅N₂O₄P[M+H]⁺的计算质量:341.17,实测:341.17。

将3-氟-4-(苯基甲氧基)-苯甲醛(0.38g,1.65mmol)、化合物144(0.67g,1.98mmol)和无水碳酸钾(0.547g,3.96mmol)在THF(13.5mL)中的悬浮液回流加热过夜。加入另外的3-氟-4-(苯基甲氧基)-苯甲醛(0.19g,0.83mmol)和碳酸钾(0.23g,1.65mmol)，并将反应混合物回流另外4h。将混合物用EtOAc(100mL)稀释，并用水(30mL)和盐水(30mL)洗涤。将有机相分离，经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。使用硅胶作为固定相，将残余物通过CombiFlash纯化，并用MeOH在DCM中的梯度(0-10％)洗脱。化合物145的产量:446mg(61％)。C₂₈H₂₉FN₂O₂[M+H]⁺的计算质量:445.23,实测:445.41。

R-BINAL的制备：历时10分钟向LAH(0.396g,10.4mmol,0.98当量)在干燥THF(34mL)中的浆中加入EtOH(0.492g,10.65mmol,1.00当量)在THF(3.2mL)中的溶液，同时维持内部温度<35℃。老化30分钟以后，加入R-BINOL(3.05g,10.65mmol,1.00当量)在THF(10mL)中的溶液，维持内部温度<35℃(约10分钟)。在室温搅拌2h以后，将反应混合物在干冰/丙酮浴上冷却至-78℃。

使化合物145(1.18g,2.65mmol)与无水甲苯(50mL)一起共沸干燥，并溶解在无水THF(12mL)中。在-78℃将化合物145的溶液经由注射泵历时45分钟逐滴加入R-BINAL的溶液中。1.5h以后，将反应容器转移至非常大的杜瓦瓶(dewer)，其用干冰/丙酮填充并用铝箔覆盖。将反应混合物在-78℃搅拌过夜。大部分还原发生在前1.5h内，仅少量另外转化过夜。将反应物通过加入饱和NH₄Cl水溶液(150mL)淬灭和温热至室温。使用6N HCl将混合物进一步酸化至pH＝7，然后用EtOAc(2x250mL)萃取。将合并的有机相用水(125mL)和盐水(125mL)洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相并用MeOH在DCM中的梯度(0-5％)洗脱。化合物146的产量：634mg(53％)。通过分析型手性HPLC,Chiralpak AD-H柱4.6x250mm,5微米,EtOH 0.1％二乙胺等度,1.75mL/min，确定手性纯度。第一洗脱的R异构体是86面积％纯的，对应于72％ee。通过手性半-制备型HPLC(Chiralpak AD-H 21.2x250mm,5微米,EtOH 0.1％二乙胺,20mL/min)进一步纯化化合物146。化合物146的最终产量:445mg(98％ee)。C₂₈H₃₁FN₂O₂[M+H]⁺的计算质量:447.25,实测:447.30。

向化合物146(0.325g,0.73mmol)和丙二酸单甲酯(0.103g,0.87mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入DMAP(9mg,0.073mmol)在DCM中的溶液。将混合物冷却至0℃并加入DCC(0.180g,0.87mmol)。除去冷却浴，并将反应物在室温搅拌过夜。然后将反应混合物用DCM(10mL)稀释和过滤。将滤液浓缩并通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相，用MeOH(0-5％)在DCM中的梯度洗脱。化合物147的产量:142mg(37％)。C₃₂H₃₅FN₂O₅[M+H]⁺的计算质量:547.26,实测:547.58。

在室温向化合物147(0.232g,0.42mmol)在NMP(0.5mL)中的溶液中加入N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(0.229g,1.12mmol)。将混合物在60℃加热30分钟。历时5分钟加入分成两份的盐水(58μL)。然后将反应混合物在90℃加热3h，然后在室温过夜。将反应混合物用EtOAc(12mL)稀释，并用水(3mL)洗涤。将水层用EtOAc(12mL)反萃取。将合并的有机层浓缩。将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相并用MeOH在DCM中的梯度洗脱。化合物148的产量：140mg(66％)。C₃₁H₃₅FN₂O₃[M+H]⁺的计算质量:503.27,实测:503.29。

向化合物148(0.169g,0.34mmol)在EtOH(3mL)中的溶液中加入Pd/C(10％负载,36mg,0.034mmol)在EtOH(1mL)中的浆。将反应容器用氢气增压和排气3次。将反应容器重新增压至55psi保持3h。将反应混合物用MeOH(5mL)稀释和过滤。将滤液浓缩，并将产物化合物149不经进一步纯化地用于下一步，假定100％收率。C₂₄H₃₁FN₂O₃[M+H]⁺的计算质量:415.24,实测:415.07。

向化合物149(139mg,0.34mmol)和叠氮基-PEG₄-甲苯磺酸酯(0.188mg,0.50mmol)在DMF(2.5mL)中的溶液中加入碳酸铯(164mg,0.50mmol)。将反应混合物在40℃加热1h，然后用饱和NaHCO₃水溶液(3mL)淬灭。将混合物用EtOAc(3x10mL)萃取。将合并的有机相用水(2x5mL)洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，并不经进一步纯化地用于下一步。C₃₂H₄₆FN₅O₆[M+H]⁺的计算质量:616.35,实测:616.90。

向化合物150(0.207mg,0.34mmol)在THF(1.5mL)和水(1.5mL)中的溶液中加入氢氧化锂(0.040g,1.68mmol)。将反应混合物加热至40℃过夜。次日早晨，将反应混合物用6NHCl酸化至pH＝7并在减压下浓缩。将残余物溶解在35％的ACN/H₂O、0.1％TFA中，并通过RP-HPLC(Thermo Aquasil C18,250x21mm,5μm,20mL/min，ACN在含有0.1％TFA的H₂O中的梯度)纯化。化合物151(SM 36)的产量：125mg(52％，经3步)。C₃₁H₄₄FN₅O₆[M+H]⁺的计算质量:602.34,实测:602.85。

结构37c((S)-3-(4-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-氟苯基)-3-(5-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)戊烷酰氨基)丙酸)的合成

将在DMF(1.5mL)中的化合物169(90mg,0.268mmol)用HATU(112mg,0.295mmol)处理并搅拌5分钟。随后加入含有在DMF(0.5)中的化合物170(94mg,0.295mmol)和DIEA(0.154mL,0.884mmol)的混合物并继续搅拌1小时。在结束后，除去所有挥发物，并通过在硅胶上分离来分离化合物171，用MeOH在DCM中的梯度洗脱，产生123mg(72％)。

将含有在MeOH(2mL)中的10％炭载钯(21mg,0.0194mmol)和化合物171(123mg,0.194mmol)的悬浮液用60PSI氢气充气和搅拌1小时。在结束后，将悬浮液在上过滤并浓缩以产生88mg(83％)粗制物，随后将其不经进一步纯化地使用。

将含有在DMF(1mL)中的化合物172(87mg,0.160mmol)、Br-PEG₃-N₃(50mg,0.176mmol)和碳酸铯(115mg,0.352mmol)的悬浮液加热至60℃并搅拌2小时。在结束后，除去所有挥发物，并通过在硅胶上分离来分离化合物173，用MeOH在DCM中的梯度洗脱，产生91mg(76％)。

将在二氧杂环己烷(0.5mL)中的化合物173(50mg,0.067mmol)用4MHCl(0.671mmol,0.168mL)在二氧杂环己烷中的溶液处理，并在40℃搅拌3小时。在结束后，除去所有挥发物。将粗制物溶解在H₂O(0.4mL)、THF(0.2mL)和MeOH(0.4mL)的混合物中，用LiOH(8mg,0.356mmol)处理，并在40℃搅拌16小时。在结束后，用TFA将pH调至3并将产物通过在Phenomenx Gemini C18柱(21.2x250mm,5微米)上分离进行分离，用乙腈在含有0.1％TFA的水中的梯度洗脱，以产生25mg(60％,2-步)。

结构38c((S)-3-(2-(3-((2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)嘧啶-5-基)-9-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)壬酸)和结构39c((S)-3-(2-(1-叠氮基-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十六烷-16-基)嘧啶-5-基)-9-(5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-2-基)壬酸)的合成

在-78℃向5-溴-2-碘-嘧啶(8.00g,28.1mmol)在无水THF(95mL)中的溶液中加入i-PrMgBr在THF(0.75M,56mL,42.0mmol)中的溶液，同时维持内部温度<-70℃(约15分钟)。然后将得到的溶液搅拌15分钟，然后加入CuCN·2LiCl在THF中的溶液(1M,31mL,31.0mmol)，并然后加入烯丙基溴(5.10g,42mmol)在THF(10mL)中的溶液。将反应混合物温热至室温和搅拌1h。将反应混合物用MeOH(40mL)淬灭并浓缩。将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相并用EtOAc在己烷中的梯度(0-20％)洗脱。化合物152的产量:4.13g(74％)。C₇H₇BrN₂[M+H]⁺的计算质量:198.99,实测:199.05。

在0℃历时30分钟向化合物152(7.70g,38.7mmol)在THF(115mL)中的溶液中加入9-BBN在THF中的溶液(0.5M,131mL,65.8mmol)。将反应混合物温热至室温和搅拌过夜。在0℃向反应混合物中加入NaHCO₃(48.7g,580mmol)在水(100mL)中的浆，随后加入NaBO₃一水合物(46.3g,464mmol)在水(100mL)中的浆。除去冷却浴，并将混合物剧烈搅拌1h。将反应混合物转移至分液漏斗并分离各层。将水层用EtOAc(200mL)萃取。将有机相合并，并用盐水(100mL)洗涤。将盐水层用EtOAc(100mL)反萃取。将合并的有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩以产生约15g粗制的黄色油。将粗制物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相并用EtOAc在己烷中的梯度(50-100％)洗脱。化合物153的产量:3.44g(41％)。C₇H₉BrN₂O[M+H]⁺的计算质量:217.00,实测:216.97。

在0℃向化合物153(3.44g,15.8mmol)在DCM(40mL)中的溶液中加入咪唑(1.73g,25.4mmol)以及TBDPSCl(5.23g,19.0mmol)在DCM(12mL)中的溶液。将反应物温热至室温和搅拌过夜。将反应混合物用DCM(75mL)稀释，并用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相并用EtOAc(0-8％)在己烷中的梯度洗脱。化合物154的产量:5.56g(77％)。C₂₃H₂₇BrN₂OSi[M+H]⁺的计算质量:455.12,实测:455.44。

在-75℃向化合物154(6.07g,13.3mmol)在THF(150mL)中的溶液中逐滴加入nBuLi在THF中的溶液(2.5M,5.6mL,14.0mmol)，维持内部温度<-70℃(约10分钟)。3分钟以后，逐滴加入甲酸乙酯(1.04g,1.13mL,14.0mmol)在THF(5mL)中的溶液，维持内部温度<-70℃。将混合物在-78℃搅拌20分钟，然后用HCl在二氧杂环己烷中的溶液(4M,3.67mL,14.7mmol)淬灭，将其用THF(5mL)进一步稀释，维持内部温度<-65℃。除去冷却浴，并将反应物温热至环境温度并浓缩。将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相并用EtOAc在己烷中的梯度(0-20％)洗脱。化合物155的产量:1.79g(33％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ10.09(s,1H),9.06(s,2H),7.64(m,4H),7.38(m,6H),3.77(t,2H),3.20(t,2H),2.17(q,2H),1.03(s,9H)。

向化合物144(1.68g,4.15mmol)和化合物155(1.70g,4.98mmol)在THF(25mL)中的溶液中加入K₂CO₃(0.861g,6.23mmol)。将反应混合物加热至40℃保持2.5h，然后在50℃保持12h。将反应混合物用EtOAc(100mL)稀释，并用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相并用EtOAc(0-100％)在含有1％三乙胺的己烷中的梯度洗脱。化合物156的产量:2.04g(79％)。C₃₈H₄₆N₄O₂Si[M+H]⁺的计算质量:619.35,实测:619.69。

R-BINAL的制备：将LAH(1.169g,30.8mmol)在干燥THF(90mL)中制浆。向浆中加入EtOH在THF中的溶液(6M,5.2mL,31.4mmol)，保持T_内部<40℃。使混合物在35℃老化40分钟，然后冷却至30℃。加入R-(联萘酚)(9.00g,31.4mmol)在THF(45mL)中的溶液，保持T_内部<40℃。使混合物在50℃老化1h，冷却至环境温度，然后加热至50℃并加入TMEDA(14.1mL,11.0g,94.3mmol)。使混合物在50℃老化1h，冷却至环境温度，然后与化合物156一起使用。

在-78℃历时5分钟向R-BINAL(约0.2M,110mL,22.0mmol)在THF中的溶液中加入化合物16(1.16g,1.88mmol)在THF(12mL)中的溶液。30分钟以后，将反应混合物用饱和NH₄Cl水溶液淬灭，温热至室温，并将产物用EtOAc(3x125mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相并用MeOH(0-5％)在含有1％三乙胺的EtOAc中的梯度洗脱。化合物157的产量:0.96g(82％)。通过分析型手性HPLC(Chiralpak AD-H柱4.6x250mm,5微米,25％EtOH,75％己烷,0.1％二乙胺等度,2mL/min)，确定手性纯度。第二洗脱的R异构体是约95面积％纯的，对应于约90％ee。C₃₈H₄₈N₄O₂Si[M+H]⁺的计算质量:621.36,实测:621.71。

向化合物157(0.925g,1.49mmol)在原乙酸三乙酯(9.25mL)中的溶液中加入丙酸在原乙酸三甲酯中的溶液(0.15M,0.55mL,0.08mmol)。将反应混合物在密封瓶中在140℃加热1.5h。将反应混合物浓缩，并将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相，用EtOAc(0-50％)在含有1％三乙胺的己烷中的梯度洗脱。化合物158的产量:0.898g(87％)。C₄₂H₅₄N₄O₃Si[M+H]⁺的计算质量:691.41,实测:691.93。

向化合物158(0.893g,1.30mmol)在EtOH(10mL)中的溶液中加入Pd/C(负载程度:10重量％,0.138g,0.13mmol)在EtOH(4mL)中的浆。给反应混合物充气50psi H₂和搅拌4.5h。将反应混合物过滤，浓缩，并不经进一步纯化地用于下一步。化合物159的产量:0.885g(99％)。C₄₂H₅₆N₄O₃Si[M+H]⁺的计算质量:693.42,实测:693.82。

将Boc酸酐(0.836g,3.83mmol)在THF(2.5mL)中的溶液加入化合物159(0.885g,1.28mmol)，随后加入DMAP的溶液(20mg/mL在THF中，155uL,0.0031g,0.026mmol)。将混合物加热至60℃保持6h。将反应混合物浓缩并将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相，用EtOAc(0-50％)在己烷中的梯度洗脱。化合物160的产量:0.721g(71％)。C₄₇H₆₄N₄O₅Si[M+H]⁺的计算质量:793.47,实测:794.28。

在0℃向化合物160(0.621g,0.783mmol)在THF(6mL)中的溶液中加入TBAF在THF(1M,1.2mL,1.2mmol)中的溶液。将反应混合物温热至室温和搅拌2h。将反应混合物用EtOAc(30mL)稀释，并用饱和NH₄Cl水溶液(2x10mL)洗涤。将有机层浓缩。将残余物通过CombiFlash纯化，使用硅胶作为固定相并用EtOAc(50-100％)在己烷中的梯度洗脱。化合物21的产量:0.362g(83％)。通过分析型手性HPLC,Chiralpak AD-H柱4.6x250mm,5微米,20％EtOH,80％己烷,0.1％二乙胺,等度,1.5mL/min，确定手性纯度。第二洗脱的R异构体是93％纯的，对应于86％ee。将化合物161通过手性半-制备型HPLC(Chiralpak AD-H 21.2x250mm,5微米,20％EtOH,80％己烷,0.1％二乙胺,60mL/min)进一步纯化。化合物161的最终产量:308mg(99％ee)。C₃₁H₄₆N₄O₅[M+H]⁺的计算质量:555.36,实测:555.72。

在室温向化合物161(0.030g,0.054mmol)在ACN(0.30mL)中的溶液中加入BAIB(0.042g,0.130mmol)和TEMPO(2.5mg,0.016mmol)，随后加入水(0.30mL)。2小时以后，将反应混合物浓缩。将残余物通过RP-HPLC(Phenomenex Gemini C18 21.2x250mm,5微米,0.1％TFA水/ACN,30-80％ACN梯度)纯化。化合物162的产量:0.030g(97％)。C₃₁H₄₄N₄O₆[M+H]⁺的计算质量:569.34,实测:569.68。

在0℃向化合物162(33mg,0.058mmol)和氨基-PEG₂-叠氮化合物(15mg,0.087mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中加入TBTU(32mg,0.099mmol)，然后加入DIEA(35μL,26mg,0.203mmol)。将反应混合物温热至室温和搅拌30分钟。将反应混合物浓缩，并将产物化合物163不经纯化用于下一步。C₃₇H₅₆N₈O₇[M+H]⁺的计算质量:725.44,实测:725.77。

向化合物163(42mg,0.058mmol)在THF(0.30mL)中的溶液中加入1M的LiOH溶液(0.174mL,0.174mmol)。将反应混合物在40℃加热1小时。加入LiOH的另一部分(0.174mL,0.174mmol)。3h以后，反应停止，并加入LiOH的另一部分(0.174mL,0.174mmol)。将反应物搅拌另外2小时(9当量LiOH,共5小时)。将反应混合物使用3N HCl中和至pH＝5并浓缩。将残余物溶解在TFA:水[95:5]中并在室温搅拌2小时。将反应混合物浓缩，并将残余物通过RP-HPLC(Phenomenex Gemini C18 21.2x250mm,5微米,水/含有0.1％TFA的ACN,20-50％ACN梯度)纯化。化合物164的产量(结构38c):23mg(66％)。C₃₀H₄₄N₈O₅[M+H]⁺的计算质量:597.35,实测:597.85。

在0℃向化合物161(30mg,0.054mmol)在THF(150μL)中的溶液中加入二苯基磷酰叠氮(35μL,45mg,0.162mmol)，随后加入DBU(12μL,12mg,0.081mmol)。将反应混合物温热至室温和搅拌过夜。次日早晨，将反应混合物在60℃加热7h。将反应混合物浓缩并通过RP-HPLC(Phenomenex Gemini C18 21.2x250mm,5微米,0.1％TFA水/ACN,32-60％ACN梯度)纯化。化合物165的产量:14mg(44％)。C₃₁H₄₅N₇O₄[M+H]⁺的计算质量:580.36,实测:580.66。

向化合物165(18mg,0.031mmol)在EtOH(100μL)中的溶液中加入Pd/C(10％负载,3.3mg,0.003mmol)在EtOH(170μL)中的浆。将反应容器用H₂充气，然后抽真空3次，并然后用H₂(1大气压)充气。30分钟以后，将反应混合物过滤，浓缩，并不经进一步纯化地用于下一步。化合物166的产量:17mg(99％)。C₃₁H₄₇N₅O₄[M+H]⁺的计算质量:554.37,实测:554.73。

在室温向化合物166(17mg,0.031mmol)和叠氮基-PEG₃-NHS酯(14mg,0.040mmol)在DMF(170μL)中的溶液中加入DIEA(16μL,12mg,0.092mmol)。将反应混合物在室温搅拌1h，浓缩，然后不经纯化用于下一步。C₄₀H₆₂N₈O₈[M+H]⁺的计算质量:783.48,实测:783.84。

向化合物167(24mg,0.031mmol)在THF(180μL)中的溶液中加入1M的LiOH溶液(153μL,0.153mmol)。将反应混合物在40℃加热。1小时以后，加入LiOH的另一部分(153uL,0.153mmol,5当量)。将反应混合物在40℃搅拌3h，然后在室温搅拌过夜。将反应混合物使用3N HCl中和至pH＝5并浓缩。将残余物溶解在TFA:水[95:5]中并在室温搅拌3小时。将反应混合物浓缩，并将残余物通过RP-HPLC(Phenomenex Gemini C18 21.2x250mm,5微米,水/含有0.1％TFA的ACN,15-45％ACN梯度)纯化。化合物168(结构39c)的产量:9.8mg(49％)。C₃₃H₅₀N₈O₆[M+H]⁺的计算质量:655.40,实测:656.01。

药代动力学增强剂的合成

Mal-C22-二酸

将化合物1(0.200g)与TBTU(0.182g)在2mL DMF中混合。逐滴加入DIPEA(0.207mL)。然后，在5分钟以后加入化合物2(0.227g)。将混合物搅拌1小时。然后将混合物用40mL DCM稀释，并用5％柠檬酸(4x30mL)洗涤和经Na₂SO₄干燥,过滤并浓缩。将产物在旋转蒸发器上和在高真空下干燥。将得到的固体干燥加载到在上的12GRf柱上，用Hex:EtOAc 0＝>80％历时30分钟。产量：53mg(39.2％)。

将化合物1与甲苯、20％的哌啶在DMF中的溶液和Et₃N混合物一起共沸蒸馏2次。产量为50mg。

将化合物1(0.0350g)和2(0.105g)组合在DMF中并加入Et₃N(0.095mL)。反应在1小时以后结束。然后将混合物用DCM稀释，并用5％柠檬酸(3x8mL)洗涤和用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将产物溶解在1mL甲苯中并加载到在上的4G Redi-Sep Rf柱上，用Hex:EtOAc0＝>100％EtOAc历时15分钟。然后将流动相切换为DCM:含有20％MeOH的DCM 0＝>100％历时20分钟。产量：12mg(24.9％)。

将化合物1(0.012g)溶解在1mL的DCM/TFA的1:1混合物中。将反应物搅拌3小时。将产物在旋转蒸发器上在高真空下干燥。产量：0.0110g(99.6％)。

C18-二酸-N3

将化合物1(0.500g,Asta Tech.#64704)和化合物2(0.454g,Chem-Impex#16167)溶解在DMF中并加入TBTU(0.442g)和DIPEA(0.586mL)。将混合物搅拌2小时。然后将混合物用DCM(40mL)稀释，并用H₂O(4x40mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将产物溶解在2mL DCM中并加载到在上的Redi-Sep Rf柱(流动相DCM:含有20％MeOH的DCM0＝>20％历时25分钟)。将产物在高真空下浓缩。产量：740mg(85％)。

将化合物1(0.720g)溶解在烧瓶内的5mL MeOH中。将隔膜放在烧瓶上并将大气压抽真空和用氮气替换2次。然后，通过称重纸加入Pd/C30％(0.200g)。将隔膜替换，然后将大气压抽真空并用氢气替换2次。将反应物在室温搅拌1小时。将混合物过滤，并将滤液在旋转蒸发器上在高真空下干燥。产量：665mg。

将化合物1(0.150g)和化合物2(0.0618g)溶解在DMF中并将TBTU(0.0884g)和DIPEA(0.117mL)加入混合物。将反应物在室温搅拌1小时。然后将混合物用DCM(12mL)稀释，用水(4x8mL)洗涤,经Na₂SO₄干燥,过滤并在高真空下浓缩。将产物溶解在DCM(1mL)中并加载到在上的4G Redi-Sep Rf柱上(流动相DCM:含有20％甲醇的DCM 0＝>50％历时25分钟)。产量：162mg(79％)。

将化合物1(0.155g)溶解在DCM:TFA的1:1混合物中。将反应物在室温搅拌2小时。将产物在旋转蒸发器上浓缩并置于高真空下。产量：129mg(97％)。

Mal-C18-二酸(D-形式)

将化合物1(0.500g)和化合物2(0.4539g)溶解在DMF中并将TBTU(0.4418g)和DIPEA(0.586mL)加入混合物中。将反应物在室温搅拌2小时。然后将混合物用DCM(40mL)稀释，用水(4x40mL)洗涤,经Na₂SO₄干燥,过滤并在高真空下浓缩。将产物溶解在DCM(2mL)中并加载到在上的4G Redi-Sep Rf柱上(流动相DCM:含有20％甲醇的DCM 0＝>50％历时25分钟)。产量：740mg(85％)。

将化合物1(0.720g)溶解在5mL MeOH中，然后将隔膜放在烧瓶上并施加N₂ 2次。然后，通过称重纸加入Pd/C(0.200g)，然后将隔膜替换，并先后施加真空和H₂ 2次。将反应物在室温搅拌1小时。将产物过滤并将滤液在旋转蒸发器上和高真空下干燥。产量：655mg。

将化合物1(0.100g)和化合物2(0.0318g)溶解在DMF中并将TBTU(0.0589g)和DIPEA(0.078mL)加入混合物中。将反应物在室温搅拌1小时。然后将混合物用DCM(10mL)稀释，用水(4x7mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并在高真空下浓缩。将产物溶解在DCM(0.5mL)中并加载到在上的4G Redi-Sep Rf柱上(流动相DCM:含有20％甲醇的DCM 0＝>50％历时25分钟)。产量：100mg(82％)。

将化合物1(96mg)溶解在TFA:DCM的1:1混合物中。将反应物在室温搅拌2小时。将产物浓缩并置于高真空下。产量80mg(99％)。

Mal-C18-甲基-三酸

在0℃将化合物2(#254487,0.405g)在1mL THF中的溶液加入到NaH在THF(3.5mL)中的悬浮液中。将反应物温热至室温并搅拌20分钟。将反应物混合直到它变澄清。然后，在0℃逐滴加入化合物1(#684511,0.436g)在2mL THF中的溶液并搅拌0.5h。然后移去冰浴并将反应物在室温搅拌过夜。然后将反应物用DCM(35mL)稀释，并用NH₄Cl溶液(1x8mL)洗涤。将有机物用DCM(1x8mL)反萃取。将有机物合并，并用H₂O(2x8mL)洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥,过滤并浓缩。将产物通过色谱法纯化，在甲苯(1mL)中湿加载到12G RediSep Rf Gold上，流动相己烷:含有10％EA的己烷＝>0＝>50％历时25分钟)。产量：390mg(64.5％)。

在0℃将化合物1(0.100g在0.5mL THF中)加入NaH在0.75mL THF中的悬浮液中。将反应物温热至室温并搅拌20分钟。反应混合物变澄清。然后在0℃逐滴加入化合物2(67692,0.016mL在0.5mL THF中)并搅拌0.5h。移去冰浴并将反应物在室温搅拌过夜。将反应物用DCM(20mL)稀释，并用NH₄Cl(1x5mL)洗涤。将有机层用DCM(1x5mL)反萃取。将有机物合并，并用H₂O(2x5mL)洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥,过滤并浓缩。将产物通过色谱法纯化，在甲苯(1mL)中湿加载到12GRediSep Rf Gold上，流动相己烷:含有10％EA的己烷0＝>50％历时25分钟)。产量：30mg(29.2％)。

将化合物1(0.0300g)溶解在0.4mL THF中。然后加入LiOH(480mg在10mL THF中)。将反应物搅拌16小时。将反应物用柠檬酸酸化至pH＝3。将有机层用2x6mL DCM萃取，并将有机物合并和经Na₂SO₄干燥,过滤并浓缩。产量：25mg(85.7％)。

将化合物1(0.0250g)和化合物2(Chem#30487,0.0238g)溶解在DMF中，并将TBTU(0.0190g)和DIPEA(0.022mL)加入混合物中。将反应物在室温搅拌1小时。然后将混合物用DCM稀释至9mL，用水(3x7mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并在高真空下浓缩。将产物溶解在DCM(0.5mL)中并加载到在上的4G Redi-Sep Rf柱上(流动相DCM:含有20％甲醇的DCM 0＝>25％历时15分钟)。产量：37.1mg(84.7％)。

将化合物1(0.0320g)溶解在0.5mL的20％的哌啶在DMF中的溶液中。将反应物在室温搅拌1小时。将产物在高真空下浓缩，然后溶解在甲苯中并在高真空下浓缩。将产物溶解在0.5mL的DCM(含有2x0.25mL洗液)中并湿加载到在上的预平衡的4gRediSep Gold Rf柱上(流动相DCM＝>含有20％MeOH的DCM 0＝>50％历时20分钟)。产量：0.020g(84.7％)。

将化合物1(0.0200g)加入Et3N(0.022mL)在DMF(0.4mL)中的溶液中。然后加入化合物2(Asta#24961,0.0246g)。将反应物在室温搅拌1小时。将反应物用DCM稀释至10mL，并用5％的柠檬酸在水中的溶液(3x5mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并在高真空下浓缩。将产物在0.5mL DCM(含有2x0.3mL洗液)中湿加载到预平衡的4g Redi Sep Gold Rf柱上(流动相DCM＝>20％MeOH/DCM 0＝>30％历时20分钟)。产量：20mg。

然后将产物溶解在2mL的TFA:DCM的1:1混合物中并搅拌2小时。将产物在旋转蒸发器上在高真空下浓缩。产量：13mg。

Mal-C₁₇-氟-PO₃单酸

将化合物1(#177490,5.00g)溶解在70mL THF和20mL DMF的混合物中。然后加入戴斯-马丁(Dess-Martin)过碘烷(#274623,11.7g)。将反应物搅拌3小时。将混合物在旋转蒸发器上在高真空下浓缩，然后干燥加载到在上的120gRedi-Sep Gold Rf柱上，流动相为含有10％DCM的己烷:EtOAc,0＝>30％历时30分钟。产量：2.86g。

将化合物1(2.85g)和苯甲醇(1.36mL)在50mL DCM中混合，并冷却至0℃。然后依次加入EDC(2.53g)和DMAP(0.257g)。使反应物温热至室温，然后搅拌2小时，同时通过TLC监测。将混合物用NH₄Cl(1x50mL)溶液和DCM萃取。将有机相经Na₂SO₄干燥，浓缩并干燥加载到80g RediSep Gold Rf柱上,流动相乙酸乙酯:己烷,0＝>15％历时30分钟。产量：2.31g(61.0％)。

将NaH(60％在油中，0.047mL)加入烧瓶中并给烧瓶加载15mL THF。将烧瓶冷却至0℃，并逐滴加入化合物1(AK Scientific#J91196,0.500g)在2mL THF中的溶液。将反应物搅拌5分钟，然后移去冰并将反应物在室温搅拌15分钟。将反应物冷却至0℃，并加入作为一个固体部分的化合物2(Tokyo Chemical Industry Co.#f0358,0.768g)。然后加入0.3mL无水DMF，随后除去冰浴。将反应物在室温搅拌过夜。然后将反应物用DCM(50mL)稀释，并用饱和的NH₄Cl(1x12mL)洗涤。将水层用DCM(1x10mL)洗涤。将有机物合并，并用H₂O(2x10mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥,过滤并在旋转蒸发器上在高真空下浓缩。将产物在1.5mL DCM中加载到在CombiFlash上的4G Redi-Sep Gold Rf柱上，流动相DCM:含有20％MeOH的DCM,0＝>30％历时20分钟。产量157mg(36.2％)。

在0℃将化合物2(0.149g在0.5mL THF中)加入NaH在THF(0.75mL)中的悬浮液中。将反应物温热至室温和搅拌20分钟。在0℃逐渐加入化合物1(0.140g)在1.25mL THF中的溶液并搅拌0.5h。然后将反应物用DCM(20mL)稀释，并用饱和NH₄Cl(1x5mL)洗涤。将产物用DCM(1x5mL)反萃取。将合并的有机层用H₂O(2x5mL)洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥,过滤并浓缩。将产物干燥加载上1g硅胶,4G RediSep Rf Gold,流动相己烷:EtOAc 0＝>50％。产量67mg(33.7％)。

将化合物1(0.0530g)溶解在2mL MeOH中，然后将隔膜放在烧瓶上并施加N₂ 2次。然后，通过称重纸加入Pd/C(0.0250g)，然后将隔膜替换，并先后施加真空和H₂ 2次。将反应物在室温搅拌2小时。将产物用注射器式滤器过滤，并将滤液在旋转蒸发器上和高真空下干燥。产量：36mg(82.0％)。

将化合物1(0.0200g)溶解在0.3mL DMF中，然后加入TBTU(0.0174g)，再加入DIPEA(0.021mL)。将混合物搅拌5分钟，然后加入化合物2(Chem#30487,0.0217g)。将反应物在室温搅拌1小时。然后将混合物用6mL DCM稀释，并用H₂O(3x3mL)洗涤，并经Na₂SO₄干燥，过滤并在旋转蒸发器上在高真空下浓缩。将产物在1mL DCM中加载到在上的RediSep 4G Gold Rf柱上,流动相DCM:含有20％MeOH的DCM,0＝>30％历时15分钟。产量10mg(88.8％)。

将化合物1(0.0330g)溶解在0.5mL含有20％哌啶的DMF中。将反应物在室温搅拌1小时。将反应物在旋转蒸发器上在高真空下浓缩。将产物在1mL DCM中加载到在CombiFlash上的4G RediSep Gold Rf柱上，流动相DCM:含有20％MeOH的DCM,0＝>50％历时20分钟。产量：11.5mg(48.5％)。

将化合物1(0.0115g)溶解在0.3mL DMF中，并加入化合物2(Asta#24961,0.0156g)和Et₃N(0.014mL)。将反应物在室温搅拌过夜。然后将反应物用DCM(6mL)稀释，并用5％柠檬酸(3x3mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥,过滤并浓缩。将产物在1mL DCM中加载到在CombiFlash上的4G RediSep Gold Rf柱上,流动相DCM:含有20％MeOH的DCM，从0＝>35％历时20分钟。产量：10mg(64.9％)。

将化合物1(0.0100g)溶解在0.3mL DCM中并将混合物冷却至0℃。然后加入0.051mL TMS-Br并将反应物在0℃搅拌4小时，随后在室温搅拌3小时。将反应物干燥并加入1mL MeOH。将反应物搅拌过夜。将产物在旋转蒸发器上在高真空下通过与甲苯共沸(3x1mL)进行干燥。然后将反应物溶解在DCM:TFA 1:1(1mL)中并在室温搅拌。1.5h以后，将反应物在旋转蒸发器上在高真空下浓缩。产量：8.5mg(99％)。

Mal-C₁₇-氟-PO₃

将化合物1(0.0150g)溶解在0.25mL DMF中。然后将TBTU(0.0125)加入混合物，随后加入DIEA(0.015mL)，并将混合物搅拌5分钟。然后，将化合物2(0.0062g)加入混合物，并将反应物在室温搅拌1小时。然后将反应物用DCM(6mL)稀释，并用H₂O(3x3mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥,过滤并在旋转蒸发器上在高真空下浓缩。将产物在1mL DCM中加载到在CombiFlash上的4G RediSep Gold Rf柱上,流动相DCM:含有20％MeOH的DCM，从0＝>30％历时15分钟。产量：12.5mg(64.7％)。

将化合物1(0.0125g)在0.4mL DCM中的溶液冷却至0℃并逐滴加入TMSBr。将反应物在0℃搅拌3小时。通过旋转蒸发器和高真空完全除去挥发物。将残余物与MeOH一起搅拌2小时以除去TMS。将混合物在旋转蒸发器上在高真空下干燥。产量：11.5mg(98.8％)。

Mal-C18-二酸和有关化合物的合成

步骤1:将化合物1(分子量＝370.57,0.741g,2mmol)溶解在10mL DMF中。依次加入TBTU(分子量＝321,0.642g,2mmol)和DIPEA(分子量＝129,0.87ml,5mmol)，并将混合物搅拌5分钟。加入化合物2(分子量＝418.9,0.838g,2mmol)。将溶液搅拌1小时。将溶液用40mlDCM稀释，并用水洗涤3次(每次40mL)。将有机相蒸发并使用柱色谱法(EA:HEX＝0％-100％)纯化以得到化合物3(80％收率)。(观察的质量,M+1＝736)。

步骤2:将化合物3用20％的哌啶在DMF中的溶液处理半小时。将溶剂蒸发并将残余物通过色谱法(MeOH:DCM＝0％-10％)纯化。(观察的质量,M+1＝514)。(观察的质量,M+1＝707)。

步骤3:将化合物4(分子量＝513,50mg,0.0975mmol)溶解在1ml DMF中。加入化合物5(分子量＝308,36mg,1.2当量)和TEA(0.041ml,3当量)。将反应物搅拌2小时。将溶液用DCM稀释，并用水洗涤3次。将有机相蒸发并通过色谱法(EA:HEX＝0％-100％)纯化以得到化合物6(观察的质量,M+1＝594)。

步骤4:将化合物6用50％的TFA在DCM中的溶液处理2小时。将溶剂蒸发以得到化合物7(Mal-C18-二酸)(观察的质量,M+1＝594.)

Mal-C18-三酸

步骤1:在0℃将化合物9(1.2当量)加入NaH(1.2当量)在3ml THF中的溶液中，在室温搅拌0.5小时。然后在0℃将化合物8(1mmol,1当量)在1ml THF中的溶液逐滴加入混合物。将混合物在0℃搅拌0.5h，直到溶液为澄清。然后将溶液升高至室温，并且溶液缓慢地变成浆。5h以后，用NH₄Cl淬灭反应，并用DCM萃取。将产物在柱(Hex:10％EtOAc在己烷中)上纯化，峰出现在约0％-3％的EtOAc(42％收率,200mg)(观察的质量,M+1＝486)。

步骤2:将化合物10溶解在THF(3mL)中并加入1M LiOH(3mL)。将反应物在25℃搅拌16小时。然后，将溶液用柠檬酸酸化至pH＝3，并用DCM(3x10mL)萃取。将有机相合并和在真空中浓缩，不进一步纯化。(观察的质量,M+1＝472)。

通过在关于Mal-C18-二酸描述的相同合成中使用化合物11替代化合物1，合成Mal-C18-三酸(观察的质量,M+1＝638)。

Mal-C₁₈-二酸-PO₃

步骤1:将化合物12(2.64mmol,1当量)和化合物13(2.909mmol,1.1当量)在DCM中一起混合，并将混合物冷却至0℃。依次加入EDC(1.1当量)和DMAP(0.2当量)。将反应物温热至室温。将反应物搅拌2小时并通过TLC己烷:EtOAc 8:2监测。将有机物用NH₄Cl溶液和DCM萃取。将有机相经Na₂SO₄干燥，浓缩，并使用色谱法(EA:HEX＝0％至10％)纯化。产物斑点出现在约2％的EA.(观察的质量,M+1＝426)。

步骤2:在0℃将化合物15(1.2当量)加入NaH(1.2当量)在3mL THF中的溶液中，且在室温搅拌0.5小时。在0℃将化合物14(0.470mmol,1当量)在1ml THF中的溶液逐滴加入混合物。将反应物在0℃搅拌0.5h，且溶液为澄清。然后将混合物升高至室温，并且溶液缓慢地变成浆。5h以后，用NH₄Cl淬灭反应，并用DCM萃取。柱(Hex:10％EtOAc在己烷中),峰出现在约3％的EtOAc.(16％收率,45mg)(观察的质量,M+1＝598)。

步骤3:将化合物16(0.0519mmol,1当量)溶解在MeOH中。然后将Pd/C(60mg)加入反应物，并用H₂进行几个净化和重新填充循环。将反应物在25℃搅拌12小时。将混合物穿过硅胶过滤并在真空中浓缩以得到产物(24mg,92％收率)(观察的质量,M+1＝508)。

通过在Mal-C18-二酸的合成中用化合物17替代化合物1，以与Mal-C18-二酸相同的方式合成Mal-C₁₈-二酸-PO₃(观察的质量,M+1＝674)。

Mal-C6-PEG2-C18-二酸

步骤1:将化合物1(1当量，2mmol)溶解在10mL DMF中。依次加入TBTU(1当量，2mmol)和DIPEA(2.5当量，5mmol)，并将混合物搅拌5分钟。加入化合物2(1当量，2mmol)。将溶液搅拌1小时。将溶液用40mL DCM稀释，并用水洗涤3次(每次40mL)。将有机相蒸发并通过色谱法(DCM:含有20％MeOH的DCM＝0％-25％)纯化以得到化合物3(80％收率)。(观察的质量,M+1＝647)。(观察的质量,M+1＝767.)

步骤2:将化合物3(1.6mmol,1当量)溶解在MeOH中。将Pd/C(150mg)加入反应物，并用H₂进行几个净化和重新填充循环。将反应物在25℃搅拌12小时。将反应物穿过硅胶过滤并在真空中浓缩以得到产物(1.5mmol,94％收率)(观察的质量,M+1＝557)。

步骤3:将化合物4(1当量，1.5mmol)溶解在10ml DMF中。依次加入TBTU(1当量)和DIPEA(2.5当量)并将混合物搅拌5分钟。加入化合物5(1当量，1.5mmol)。将溶液搅拌1小时。将溶液用40mL DCM稀释，并用水洗涤3次(每次40mL)。将有机相蒸发和色谱分离(DCM:含有20％MeOH的DCM＝0％-25％)以得到化合物6(80％收率)。(观察的质量,M+1＝909)。

步骤4:将化合物6(1当量，1.2mmol)用20％的哌啶在DMF中的溶液处理30分钟。将溶剂蒸发并将残余物通过色谱法(DCM:含有20％MeOH的DCM＝0％-30％)纯化以得到化合物7(0.984mmol,82％收率)(观察的质量,M+1＝687)。

步骤5:将化合物7(1当量，0.984mmol)溶解在1mL DMF中。加入化合物8(1.2当量，1.18mmol)和TEA(3当量，2.952mmol)。将反应物搅拌2小时。将溶液用DCM(30mL)稀释，并用水洗涤3次(每次15mL)。将有机相蒸发和色谱分离(DCM:含有20％MeoH的DCM＝0％-30％)以得到化合物9(0.738mmol,75％收率)。(观察的质量,M+1＝880)。

步骤6:将化合物9用50％的TFA在DCM中的溶液处理2小时。将混合物在真空中浓缩以得到化合物10.(观察的质量,M+1＝768)。

Mal-C6-PEG4-C18-二酸

以与Mal-C18-二酸相同的方式合成Mal-C6-PEG4-C18-二酸，但是对化合物7进行用NHFmoc-PEG₂-NH₂的处理。如在步骤4中所述用20％哌啶去保护除去Fmoc保护基，然后如上所述重复步骤5和6(观察的质量,M+1＝912.)

Mal-二C18-二酸

步骤1和2：如上面在Mal-C18-二酸的合成中所述，合成化合物4。

步骤3:将化合物5(1.0mmol,1当量)、化合物6(1.3当量)和TEA(5.0当量)在3mLDMF中充分混合。将反应物搅拌过夜。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并通过柱色谱法纯化。产物洗脱在约4％MeOH在含1％HOAc的DCM中。LC-MS显示含有杂质的期望峰。终产物是170mg，具有45％收率。

步骤4:将化合物7(0.12mmol，1当量)、化合物8(2.4当量)、TBTU(2.4当量)和DIPEA(5.0当量)在1mL DMF中充分混合。将反应物搅拌过夜。LC-MS显示产物以及一种主要副产物(比产物更多)和三种少量杂质。将混合物通过旋转蒸发器浓缩并在柱上通过DCM/MeOH纯化。产物洗脱在约6-12％的MeOH。得到78mg终产物(油)，具有42％收率。

步骤5:将化合物9(0.05mmol)溶解在2mL DCM/TFA(1/1,v/v)中。将反应物搅拌1小时。蒸发溶剂以得到72mg化合物10，具有99％收率。

步骤6:将化合物10(0.05mmol,1当量)、化合物4(2.2当量)、TBTU(2.2当量)和DIPEA(8.0当量)在0.5mL DMF中充分混合。将反应物搅拌1h。LC-MS显示产物以及一种主要副产物(非极性TFA方法)。将混合物通过旋转蒸发器浓缩并在柱上通过DCM/MeOH纯化。产物洗脱在约8-12％的MeOH。得到60mg化合物11，具有49％收率。

步骤7:将化合物11(0.025mmol)溶解在0.5mL DCM/TFA(1/1,v/v)中。将反应物搅拌1小时。蒸发溶剂以得到53mg化合物12，具有97％收率。

Mal-C18-酸和有关化合物的合成

步骤1:将化合物1(0.27mmol,1当量)溶解在1mL DMF中。依次加入TBTU(1当量)和DIPEA(2.5当量)并将混合物搅拌5分钟。加入化合物2(1当量)。将溶液搅拌1小时。将溶液用40ml DCM稀释，并用水洗涤3次(每次40mL)。将有机相使用旋转蒸发器浓缩并使用柱色谱法(EA:HEX＝0％-100％)纯化以得到化合物3(观察的质量,M+1＝494)。

步骤2:将化合物3用50％的TFA在DCM中的溶液处理2小时。将产物使用旋转蒸发器浓缩以得到化合物4(观察的质量,M+1＝437)。

Mal-C₂₀-酸

使用商购可得的C₂₀起始原料替代化合物1，以与Mal-C18-酸相同的方式合成Mal-C₂₀-酸(观察的质量,M+1＝465)。

Mal-C₁₇-PO₃

步骤1:将DMP(1.3当量，4.78mmol)和化合物5(1当量，3.68mmol)在DMF(15mL)中混合。2小时以后，反应结束，如TLC所证实的。形成一些固体沉淀物。后处理：过滤以除去固体，用DCM冲洗。将产物在真空中浓缩并使用色谱法(含有10％DCM的Hex:EtOAC＝>0％-20％)纯化，产物洗脱在5％-10％.(0.8136mmol,22％收率)(观察的质量,M+1＝271)。

步骤2:将化合物6(1当量，0.8136mmol)和化合物7(1.1当量，0.8949mmol)在DCM(5mL)中混合，冷却至0℃。依次加入EDC(1.1当量)和DMAP(0.2当量)。将反应物温热至室温。将反应物搅拌2小时并通过TLC(己烷:EtOAc 8:2)监测。将产物用NH₄Cl溶液和DCM萃取。将有机相经Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过色谱法(Hex:EtOAC＝0％至10％)纯化。产物斑点出现在4％的EtOAc(0.4438mmol,54.5％收率)。(观察的质量,M+1＝361)。

步骤3:在0℃将化合物9(1.4当量)加入NaH(1.2当量)在1.5ml THF中的溶液中并在室温搅拌0.5小时。在0℃将化合物8(1当量，0.4438mmol)在1ml THF中的溶液逐滴加入混合物。将反应物在0℃搅拌0.5h，且溶液为澄清。将混合物温热至室温，并且溶液缓慢地变成浆。5h以后，用NH₄Cl淬灭反应，并用DCM萃取。柱(Hex:EtOAc＝>0％至50％)，产物出现在35％的EtOAc(0.2020mmol,45.5％收率)(观察的质量,M+1＝496)。

步骤4:将化合物10(1当量，0.2020mmol)溶解在MeOH、THF和1M LiOH的1:1:1的混合物(3mL总溶液)中。将混合物在25℃搅拌2小时。将反应物用柠檬酸酸化至pH＝3，并用DCM(3x10mL)萃取。将有机相合并，经Na₂SO₄干燥，过滤并在真空中浓缩。没有必要进一步纯化(观察的质量,M+1＝405)。

步骤5:将化合物11(1当量，0.0938mmol)溶解在1mL DMF中。依次加入TBTU(1当量)和DIPEA(2.5当量)并将混合物搅拌5分钟。加入化合物2(1当量)。将溶液搅拌1小时。将溶液用10mL DCM稀释，并用水洗涤3次(每次5mL)。将有机相蒸发并通过色谱法(DCM:含有20％MeOH的DCM＝0％-30％)纯化以得到化合物12(0.0683,73％收率)(观察的质量,M+1＝528)。

步骤6:将化合物12在DCM中的溶液冷却至0℃并逐滴加入TMS-Br。将反应物在0℃搅拌并通过LC-MS监测。反应在2.5小时内结束。通过旋转蒸发器和高真空完全除去挥发物(以完全除去酸)。将残余物与MeOH一起搅拌2小时以除去TMS。将产物在真空中浓缩以得到期望的产物(假定100％收率)(观察的质量,M+1＝471)。

Mal-C₁₈-二酸(L-形式)

以与Mal-C18-酸Mal-C18-Glu(L)-二酸相同的方式合成Mal-C18-二酸(L-形式)，但是使用Glu(D)替代Glu(L)(观察的质量,M+1＝567)

Mal-C6-C12-PEG2-C18二酸和有关化合物的合成

步骤1和2:如在上面Mal-C18-二酸的合成中所述合成化合物4。

步骤3:将化合物5(1mmol,1当量)用3mL 20％的哌啶在DMF中的溶液处理20分钟。然后将树脂用DMF冲洗3次，并不经进一步纯化地用于下一步。

步骤4:向化合物6中加入TBTU(2当量)、化合物7(2当量)、DIPEA(6当量)在3mL DMF中的混合物，并搅拌1小时。在真空下除去溶剂，并将树脂用3mL DMF冲洗3次。

步骤5:将化合物8用3ml 20％的哌啶在DMF中的溶液处理20分钟。然后将树脂用DMF冲洗3次，并不经进一步纯化地用于下一步。

步骤6:向化合物9中加入化合物10(2当量)和DIPEA(6当量)在3mL DMF中的混合物并搅拌过夜。在真空下除去溶剂并将树脂用3mL DMF冲洗3次。

步骤7:将化合物11用3ml 30％的HFIP在DCM中的溶液处理30分钟。将溶液过滤，并将滤液收集和蒸发以得到化合物12。

步骤8:向化合物10(1当量)在DCM中的溶液中加入EDC(1当量)，随后加入HOBt(1当量)和搅拌15分钟。然后加入化合物4，并将反应物进一步搅拌另外4小时。将溶剂蒸发，并将粗制物质通过在DCM和MeOH中的色谱法纯化。

步骤9:将化合物13用3ml 50％的TFA在DCM中的溶液处理1小时。蒸发溶剂以得到化合物14。Mal-C6-C12-Peg2-C18二酸(观察的质量,M+1＝979)。

Mal-C6-C12-C12-PEG2-C18-二酸

使用与Mal-C6-C12-PEG2-C18二酸相同的规程合成Mal-C6-C12-C12-PEG2-C18-二酸，但是在继续其它步骤之前对化合物9进行步骤4和5的反应(观察的质量,M+1＝1204)。

Mal-C6-C12-C12-C12-PEG2-C18二酸

使用与Mal-C6-C12-PEG2-C18二酸相同的规程合成Mal-C6-C12-C12-C12-PEG2-C18二酸，但是在继续其它步骤之前对化合物9进行步骤4和5的反应2次(观察的质量,M+1＝1429.)

Mal-C6-C12-C12-C12-PEG2-C12酸

使用与Mal-C6-C12-PEG2-C18二酸相同的规程合成Mal-C6-C12-C12-C12-PEG2-C12酸，但是在继续其它步骤之前对化合物9进行步骤4和5的反应2次，然后使用商购可得的化合物4的C12类似物(观察的质量,M+1＝1245)。

实施例2.使用人A-498细胞的常位透明细胞肾细胞癌(ccRCC)荷瘤小鼠模型.

表达SEAP的透明细胞肾细胞癌(ccRCC)A498细胞的产生.通过从Clontech的pSEAP2-基本载体PCR扩增的SEAP编码序列的定向克隆，制备在CMV启动子下表达报道基因分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的pCR3.1表达载体。将方便的限制位点添加到用于扩增SEAP编码序列的引物上，所述SEAP编码序列用于克隆到pCR3.1载体(Invitrogen)中。得到的构建体pCR3-SEAP用于产生表达SEAP的A498 ccRCC细胞系。简而言之，按照制造商的推荐通过电穿孔将pCR3-SEAP质粒转染到A498 ccRCC细胞中。通过G418抗性选择稳定的转染子。评价选择的A498-SEAP克隆的SEAP表达和整合稳定性。

表达SEAP的透明细胞肾细胞癌(ccRCC)A498细胞的植入.将雌性无胸腺(免疫缺陷型)裸鼠用约3％异氟烷麻醉和以右侧卧位放置。在左胁腹中产生0.5-1cm的腹部纵向小切口。使用潮湿的棉头拭子，将左肾提高到腹膜外并轻轻稳定。在即将注射前，向1.0ml注射器中填充细胞/基质胶混合物并将27号针导管连接到注射器尖端。然后将填充的注射器连接到注射泵(Harvard Apparatus,PHD2000型)和准备以除去空气。连接到注射器的27-号针导管的尖端在肾囊下方紧邻处在尾极附近插入，并然后将针的尖端小心沿囊向头侧推进3-4mm。使用注射泵将含有约300,000个细胞的2:1(体积:体积)细胞/基质胶混合物的10μl等分试样缓慢注入肾实质中。将针留在肾中15-20秒以确保注射完成。然后从肾移出针并将棉头拭子放置在注射位点上30秒以防止细胞渗漏或出血。然后轻轻把肾放回到腹腔内并关闭腹壁。在植入后每7-14天收集血清以使用市售的SEAP测定试剂盒监测肿瘤生长。对于大多数研究，在植入后5-6周使用肿瘤小鼠，此时肿瘤测量通常为约4-8mm。

HIF2 mRNA表达的确定.对于在本文实施例中报告的研究，在注射后的确定一天将小鼠安乐死并使用Trizol试剂按照制造商的推荐从肾肿瘤分离总RNA。如下文所述通过RT-qPCR测定相对HiF2αmRNA水平，并与仅用递送缓冲液(等渗葡萄糖)处理的小鼠对比。在定量PCR的准备中，按照制造商的方案从在TriReagent(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)中均质化的组织样品分离总RNA。使用高Capacity cDNA ReverseTranscription Kit(Life Technologies)反转录大约500ng RNA。对于人(肿瘤)Hif2α(EPAS1)表达，使用TaqMan Gene Expression Master Mix(Life Technologies)或VeriQuest Probe Master Mix(Affymetrix)将用于人Hif2α(目录号4331182)和CycA(PPIA)目录号:4326316E)的预制造的TaqMan基因表达测定在二重反应中一式三份使用。使用7500Fast或StepOnePlus Real-Time PCR系统(Life Technologies)进行定量PCR。将ΔΔC_T方法用于计算相对基因表达。

实施例3.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据包括以下内容的定量施用组，通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表8.实施例3中荷瘤小鼠的定量施用组.

在组5和6中，通过还原二硫键和进行迈克尔加成反应以连接PK增强剂化合物的马来酰亚胺反应基团，将具有以下结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部：

，其中指示在表4.3所示的C6-S基团处与RNAi试剂的连接点(也参见实施例1)。

在组4和6中，通过偶联至官能化的胺接头(NH2-C6)，将三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)连接至有义链的5’末端端部：

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表9.在实施例3中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

如在上面表9中所示，对于组2(AD04545，显示与媒介物对照相比大约0％敲低(1.030))仅观察到最小敲低，其为没有连接至靶向配体或PK增强剂的HIF-2αRNAi试剂。与不存在靶向配体的构建体相比，组4和6(其各自包括三齿靶向基团)显示出更大的活性，从而指示靶向配体依赖性。此外，在包括靶向配体和PK增强剂的组中观察到额外抑制活性(参见，例如，组4(显示大约70％敲低(0.308)和组6(显示大约55％敲低(0.456))。

实施例4.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据包括以下内容的定量施用组，通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射:

表10.实施例4中荷瘤小鼠的定量施用组.

在组3-9中，将具有以下结构的各种PK增强剂连接至有义链的3’末端端部：

组3:

组4:

组5:

组6:

组7:

组8：

组9：

，其中指示在表4.3所示的C6-S基团处与RNAi试剂的连接点。

在组2-9中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表11.在实施例4中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

如在上面表11中所示，连接至三齿靶向基团的每种HIF-2αRNAi试剂(组2至9)显示与对照相比的实质抑制活性。

实施例5.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据下面表12中的下述定量施用组，通过尾静脉静脉内(IV)注射给在本文列出的组1至6中的小鼠施用大约300微升体积的注射。另外，通过在皮肤和肌肉之间皮下(SQ)注射进颈和肩区域上的松弛皮肤中，施用给在本文列出的组7中的小鼠。施用组包括以下：

表12.在实施例5中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2-5和7中，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。

在组2和5-7中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。在组3中，将三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-6具有亲和力的结构6.1-avb6的结构的整联蛋白配体)通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部，且在组4中，将三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-6具有亲和力的结构14-avb6的结构的整联蛋白配体)通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部。下面显示了包括整联蛋白靶向配体结构6.1-avb6和结构14-avb6的三齿靶向基团的结构：

结构6.1-avb6的靶向基团，

结构14-avb6的靶向基团，

其中指示与官能化的胺接头的连接点。

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表13.在实施例5中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

如在上面表13中所示，连接一种或多种靶向配体和PK增强剂的偏好显示出在沉默HIF-2α表达方面改善的效能(参见，例如，组6(没有PK增强剂)仅实现了大约25％敲低(0.751)。此外，数据显示与对α-v-β-6具有亲和力的靶向配体相比，包括对整联蛋白α-v-β-3具有亲和力的靶向配体的靶向基团的偏好(将组3(使用α-v-β-6配体的大约31％敲低(0.691))和组4(使用α-v-β-6配体的大约42％敲低(0.582))与组2(使用α-v-β-3配体的大约56％敲低(0.437))和组5(使用α-v-β-3配体的大约58％敲低(0.413))对比)。另外，如在组7和2中所示，使用C18-二酸(C18二酸)的PK增强剂，IV和SQ定量施用可以实现相当的效力。

实施例6.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射:

表14.在实施例6中荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2、4-7中，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。组3包括连接至以下结构的有义链的3’末端端部的PK增强剂：

其中指示在表4.3所示的C6-S基团处与RNAi试剂的连接点。

组10包括连接至以下结构的有义链的3’末端端部的PK增强剂：

其中指示在表4.3所示的C6-S基团处与RNAi试剂的连接点。

组11包括连接至以下结构的有义链的3’末端端部的PK增强剂:

，其中指示在表4.3所示的C6-S基团处与RNAi试剂的连接点。

在组5-7中，将PK增强剂缀合至内部核苷酸。指定核苷酸包括2’-O-炔丙基，并添加含有叠氮化合物的PK增强剂(C18-二酸-N₃)以形成三唑。组5-7包括以下结构的PK增强剂：

其中指示在指定核苷酸的2’位置处与RNAi试剂的连接点。

在组2-11中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表15.在实施例6中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

如在上面表15中所示，连接至三齿靶向基团(组2至11)的每种HIF-2αRNAi试剂显示与对照相比的实质抑制活性。

实施例7.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射，其包括以下定量施用组:

表16.在实施例7中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2-4、9和10中，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。

组6包括在有义链的3’末端上具有以下结构的PK增强剂：

其中指示在表4.3所示的C6-S基团处与RNAi试剂的连接点。

组7包括在有义链的3’末端上具有以下结构的PK增强剂：

其中指示在表4.3所示的C6-S基团处与RNAi试剂的连接点。

组8包括如在实施例6中所示通过Mal-C₁₈-三酸与包含二硫化物的有义链的3’末端的迈克尔加成而形成的PK增强剂。

在组2、4-8和10中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。组9包括通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-6具有亲和力的结构10-avb6的结构的整联蛋白配体)，其结构显示在下面：

组10包括通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-6具有亲和力的结构26-avb6的结构的整联蛋白配体)，其结构显示在下面：

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表17.在实施例7中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

如在上面表17中所示，组4(其在HIF-2αRNAi试剂的有义链上包括四(4)个位于内部的结构2a-avb3配体)表现出huHIF-2αmRNA(0.228)的大约78％敲低。

实施例8.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表18.在实施例8中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2、3和5-8中，通过还原二硫键和进行迈克尔加成反应而连接马来酰亚胺反应基团，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。组4和9包括具有在实施例6中指出的结构的PK增强剂。组10包括具有在实施例7中指出的结构的PK增强剂。组11包括在有义链的3’末端上具有以下结构的PK增强剂：

其中指示在表4.3所示的C6-S基团处与RNAi试剂的连接点。

在组2、4-5和8-11中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。在组2中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)将单个结构2a-avb3靶向配体连接至有义链的5’末端端部。在组7中，将PK增强剂C18-二酸连接至位于有义链的5’末端端部的(C6-SS-C6)二硫键接头以及有义链的3’末端端部。

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表19.在实施例8中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

如在上面表19中所示，位于HIF-2αRNAi试剂的有义链上的内部靶向配体的包含显示出敲低的额外改善(参见，例如，组2(显示出大约82％敲低(0.183)的四(4)个位于内部的靶向配体)，和组8(显示出大约49％敲低(0.516)的没有位于内部的靶向配体)。

实施例9.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表20.在实施例9中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2-13中，通过还原二硫键和进行迈克尔加成反应而连接马来酰亚胺反应基团，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。

在组2-13中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表21.在实施例9中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

在实施例9中检查的每种HIF-2αRNAi试剂包括至少2个内部核苷酸，其包括连接在核苷酸的2’位置的avb3整联蛋白靶向配体，且如在上面表21中所示，试验的每种HIF-2αRNAi试剂表现出与媒介物对照相比接近50％或更大的HIF-2α敲低。组2(具有4个内部配体，大约74％敲低)和13(具有8个内部配体，大约86％敲低)显示出huHIF-2αmRNA表达的特别高的减少。

实施例10.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表22.在实施例10中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2-13中，通过还原二硫键和进行迈克尔加成反应而连接马来酰亚胺反应基团，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。

在组2-13中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表23.在实施例10中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

实施例11.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表24.在实施例11中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2-9中，通过还原二硫键和进行迈克尔加成反应而连接马来酰亚胺反应基团，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。

在组2-9中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。

除了在其中施用仅两(2)只小鼠的组2以外，在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表25.在实施例11中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

实施例12.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表26.在实施例12中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2-11中，通过还原二硫键和进行迈克尔加成反应而连接马来酰亚胺反应基团，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。

在组2-11中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。

除了在其中施用仅两(2)只小鼠的组6以外，在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表27.在实施例12中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

实施例13.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表28.在实施例13中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2-10中，通过还原二硫键和进行迈克尔加成反应而连接马来酰亚胺反应基团，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。

在组2-10中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表29.在实施例13中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

实施例14.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表30.在实施例14中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2-7中，通过还原二硫键和进行迈克尔加成反应而连接马来酰亚胺反应基团，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。

在组2-7中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。

在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表31.在实施例14中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

在实施例14中的每种HIF-2αRNAi试剂包括有义链，其包含：(i)包含三个靶向配体的三齿靶向基团，其位于有义链的5’末端端部处；(ii)共四个额外的内部靶向配体，其在2’位置连接至从与反义链形成碱基对的第一个核苷酸开始位于位置2、4、6和8处的每个核苷酸；和(iii)PK增强剂，其连接至有义链的3’末端端部。如在上面表31中所示，以2.0mg/kg和5.0mg/kg施用的每种RNAi试剂表现出与媒介物对照相比huHIF-2αmRNA的实质减少。

实施例15.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1天，通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射，其包括以下定量施用组：

表32.在实施例15中的荷瘤小鼠的定量施用组.

在组2-4中，通过还原二硫键和进行迈克尔加成反应而连接马来酰亚胺反应基团，将具有在以前实施例中关于Mal-C₁₈-二酸指出的结构的PK增强剂连接至有义链的3’末端端部。

在组2-4中，通过偶联至官能化的胺反应基团接头(NH2-C6)连接至有义链的5’末端端部的三齿整联蛋白靶向基团(其包括3个对α-v-β-3具有亲和力的结构2a-avb3的结构的整联蛋白配体)具有在上面实施例3中所述的结构。

除了仅具有2只小鼠的媒介物对照组(组1)以外，在每组中施用三只(3)小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表33.在实施例15中在处死时(第8天)的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

实施例16.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。在研究第1、2、8、9、15、22和29天，通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的5.0mg/kg三-结构2a-avb3-AD05971-(内部结构2a-avb3)₄-C18-二酸或不含RNAi试剂的等渗葡萄糖的注射。

每组施用六(6)只小鼠。在研究第36天处死小鼠，收获肾肿瘤。图4A显示了未经治疗的对照组中小鼠的肾，肿瘤肾显示在图像的右侧，而对侧肾显示在左侧。图4B显示了用RNAi试剂治疗的组中小鼠的肾，也在该图像的右侧显示肿瘤肾，在左侧显示对侧肾。从图像中显而易见并通过肿瘤重量证实，HIF-2αRNAi试剂组抑制了肿瘤生长。另外，如在图5A中所示，对照组中荷瘤小鼠的细胞的免疫组织化学(IHC)染色证实了HIF-2α蛋白的存在，如黑点所示，而在显示用HIF-2αRNAi试剂治疗的荷瘤小鼠的细胞的图5B的图像上则没有明显的这样的黑点。

实施例17.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。根据下述定量施用组，通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表34.在实施例17中的荷瘤小鼠的定量施用组.

每组施用四(4)只小鼠。在上面表34指出的计划的处死日期，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表35.在实施例17中在处死时的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

实施例18.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。根据下述定量施用组，通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表36.在实施例18中的荷瘤小鼠的定量施用组.

每组施用四(4)只小鼠。在研究第8天处死小鼠，收获肾肿瘤，并在收集和匀浆化以后分离肾肿瘤中的总人HIF-2mRNA。通过基于探针的定量PCR量化HIF-2α(huHIF-2α)mRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表37.在实施例18中在处死时的平均相对huHIF-2αmRNA表达.

实施例19.HIF-2αRNAi试剂在ccRCC荷瘤小鼠中的体内施用.

使用实施例2的荷瘤小鼠模型在体内评价HIF-2αRNAi试剂。根据下述定量施用组，通过尾静脉静脉内(IV)注射给小鼠施用大约300微升体积的注射：

表38.在实施例19中的荷瘤小鼠的定量施用组.

每组施用十五(15)只小鼠，并通过每周触诊和测径仪估计来监测体重和肿瘤生长。在第21天发现组4中的一只动物死亡。图6显示了直至研究第34天对肿瘤生长的影响。如图6所示，数据显示，与盐水媒介物对照相比，当施用HIF-2αRNAi试剂时，肿瘤大小减少的总体改善。

实施例20.缀合至靶向HIF-2α的RNAi试剂的整联蛋白靶向配体在携带肾肿瘤的小 鼠中的体内施用.

如本文实施例1所述，根据本领域已知的和在寡核苷酸合成中常用的一般规程，根据亚磷酰胺技术在固相上合成了包括有义链和反义链的RNAi试剂。RNAi试剂具有本文实施例2中列出的各种修饰的核苷酸序列，并被设计为靶向Hif2α(EPAS1)。

在研究第1天，根据下述定量施用组，通过尾静脉注射施用给携带肾肿瘤的小鼠：

表39.在实施例20中小鼠的定量施用组.

每组施用三(3)只荷瘤小鼠(n＝3)。在注射后在研究第8天处死小鼠，并从肾肿瘤分离总RNA。然后通过基于探针的定量PCR(RT-qPCR)量化相对人HIF2αmRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(等渗葡萄糖)(几何平均值，±95％置信区间)。

表40.在实施例20中在处死时的平均相对Hif2αmRNA表达.

如在上面表40中所示，与对照相比，每种Hif2αRNAi试剂-整联蛋白靶向配体缀合物在小鼠中显示出mRNA表达的降低。

实施例21.缀合至靶向HIF-2α的RNAi试剂的整联蛋白靶向配体在携带肾肿瘤的小 鼠中的体内施用.

如本文实施例1所述，根据本领域已知的和在寡核苷酸合成中常用的一般规程，根据亚磷酰胺技术在固相上合成了包括有义链和反义链的RNAi试剂。RNAi试剂具有本文所述的各种修饰的核苷酸序列，并被设计为靶向Hif2α(EPAS1)。

在研究第1天，根据下述定量施用组，通过尾静脉注射施用给携带肾肿瘤的小鼠(参见实施例4)：

表41.在实施例21中的小鼠的定量施用组.

每组施用三(3)只荷瘤小鼠(n＝3)。在注射后在研究第8天处死小鼠，并从肾肿瘤分离总RNA。然后通过基于探针的定量PCR(RT-qPCR)量化相对人HIF2αmRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组的分数(等渗葡萄糖)(几何平均值，±95％置信区间)。

表42.在实施例21中在处死时的平均相对Hif2αmRNA表达.

如在上面表42中所示，与对照相比，每种Hif2αRNAi试剂-整联蛋白靶向配体缀合物在小鼠中显示出mRNA表达的降低。

实施例22.缀合至靶向HIF-2α的RNAi试剂的整联蛋白靶向配体在携带肾肿瘤的小 鼠中的体内施用.

如本文实施例1所述，根据本领域已知的和在寡核苷酸合成中常用的一般规程，根据亚磷酰胺技术在固相上合成了包括有义链和反义链的RNAi试剂。RNAi试剂具有本文所述的各种修饰的核苷酸序列，并被设计为靶向Hif2α(EPAS1)。

在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉注射施用给携带肾肿瘤的小鼠：

表43.在实施例22中的小鼠的定量施用组.

每组施用三(3)只荷瘤小鼠(n＝3)。在注射后在研究第8天处死小鼠，并根据在实施例4中所述的规程从肾肿瘤分离总RNA。然后通过基于探针的定量PCR(RT-qPCR)量化相对人HIF2αmRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组(等渗葡萄糖)的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表44.在实施例22中在处死时的平均相对Hif2αmRNA表达.

如在上面表44中所示，与对照相比，每种Hif2αRNAi试剂-整联蛋白靶向配体缀合物在小鼠中显示出mRNA表达的降低。

实施例23.缀合至靶向HIF-2α的RNAi试剂的整联蛋白靶向配体在携带肾肿瘤的小 鼠中的体内施用.

如本文实施例1所述，根据本领域已知的和在寡核苷酸合成中常用的一般规程，根据亚磷酰胺技术在固相上合成了包括有义链和反义链的RNAi试剂。RNAi试剂具有在本文实施例2中所述的各种修饰的核苷酸序列，并被设计为靶向Hif2α(EPAS1)。

在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉注射施用给携带肾肿瘤的小鼠：

表45.在实施例23中的小鼠的定量施用组.

除了仅具有三只(3)小鼠(因为一只小鼠被认为具有错误注射)的组4以外，每组施用四(4)只荷瘤小鼠(n＝4)。在注射后在研究第8天处死小鼠，并根据在实施例4中所述的规程从肾肿瘤分离总RNA。然后通过基于探针的定量PCR(RT-qPCR)量化相对人HIF2αmRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组(等渗葡萄糖)的分数(几何平均值，±95％置信区间)。

表46.在实施例23中在处死时的平均相对Hif2αmRNA表达.

如在上面表46中所示，与对照相比，每种Hif2αRNAi试剂-整联蛋白靶向配体缀合物在小鼠中显示出mRNA表达的降低。

实施例24.缀合至靶向HIF-2α的RNAi试剂的整联蛋白靶向配体在携带肾肿瘤的小 鼠中的体内施用.

如在本文实施例2中所述，根据本领域已知的和在寡核苷酸合成中常用的一般规程，根据亚磷酰胺技术在固相上合成了包括有义链和反义链的RNAi试剂。RNAi试剂具有在本文实施例2中所述的各种修饰的核苷酸序列，并被设计为靶向Hif2α(EPAS1)。

在研究第1天，根据下述定量施用组通过尾静脉注射施用给携带肾肿瘤的小鼠：

表47.在实施例24中的小鼠的定量施用组.

合成了RNAi试剂，其具有旨在靶向人Hif2α基因的核苷酸序列，且包括在有义链的5′末端端部处的官能化的胺反应基团(NH₂-C₆)以促进与整联蛋白靶向配体的缀合。

每组施用三(3)只荷瘤小鼠(n＝3)。在注射后在研究第8天处死小鼠，并根据在实施例4中所述的规程从肾肿瘤分离总RNA。然后通过基于探针的定量PCR(RT-qPCR)量化相对人HIF2αmRNA表达，归一化至人亲环蛋白A(PPIA)表达并表达为媒介物对照组(等渗葡萄糖)的分数(几何平均值，±95％置信区间)，如在实施例4中解释的。

表48.在实施例24中在处死时的平均相对Hif2αmRNA表达.

如在上面表48中所示，与对照相比，每种Hif2αRNAi试剂-整联蛋白靶向配体缀合物表现出mRNA表达的降低。

实施方案

实施方案1.用于抑制HIF-2α(EPAS1)基因的表达的RNAi试剂，其包含：

(i)包含至少17个邻接核苷酸的反义链，其与在表3中提供的任一个序列相差0或1个核苷酸；

(ii)有义链，其包含与所述反义链至少部分地互补的核苷酸序列；和

(iii)一个或多个靶向配体。

实施方案2.实施方案1的RNAi试剂，其中所述反义链包含在表3中提供的任一个序列的核苷酸2-18。

实施方案3.实施方案1或实施方案2的RNAi试剂，其中所述有义链包含与在表4、4.1、4.2或4.3中提供的有义链序列中的任一个相差0或1个核苷酸的至少17个邻接核苷酸的核苷酸序列，且其中所述有义链含有在所述17个邻接核苷酸上与所述反义链具有至少85％互补性的区域。

实施方案4.实施方案1-3中的任一个的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂的有义链的所有的或基本上所有的核苷酸、所述RNAi试剂的反义链、或所述RNAi试剂的有义链和反义链二者是修饰的核苷酸。

实施方案5.实施方案4的RNAi试剂，其中至少一个修饰的核苷酸选自：2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸、2′-脱氧核苷酸、2′、3′-开环核苷酸模仿物、锁定核苷酸、2'-F-阿拉伯糖核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、脱碱基核苷酸、核糖醇、倒置核苷酸、倒置2′-O-甲基核苷酸、倒置2′-脱氧核苷酸、2′-氨基-修饰的核苷酸、2′-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、2′-O-炔丙基-修饰的核苷酸、2′-O-三唑-修饰的核苷酸和3′-O-甲基核苷酸。

实施方案6.实施方案5的RNAi试剂，其中每个修饰的核苷酸独立地选自：2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸和2′-O-三唑-修饰的核苷酸。

实施方案7.实施方案1-6中的任一个的RNAi试剂，其中所述反义链包含在表3中提供的修饰的反义链序列中的任一个的核苷酸序列。

实施方案8.实施方案1-7中的任一个的RNAi试剂，其中所述有义链包含在表4中提供的修饰的有义链序列中的任一个的核苷酸序列。

实施方案9.实施方案1-8中的任一个的RNAi试剂，其中所述反义链包含在表3中提供的任一个修饰的序列的核苷酸序列，且所述有义链包含在表4、表4.1、表4.2或表4.3中提供的任一个修饰的序列的核苷酸序列。

实施方案10.实施方案1-9中的任一个的RNAi试剂，其中所述反义链包含usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg(SEQ ID NO:30)的核苷酸2-18，其中a、c、g和u分别代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷；Af、Cf、Gf和Uf分别代表2′-氟腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷。

实施方案11.实施方案10的RNAi试剂，其中所述反义链包含usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg(SEQ ID NO:30)的序列，其中a、c、g和u分别代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷；Af、Cf、Gf和Uf分别代表2′-氟腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷。

实施方案12.实施方案1的RNAi试剂，其中所述有义链包含CAACGUAACGAUUUCAUGAAA(SEQ ID NO:428)的序列的核苷酸2-18。

实施方案13.实施方案1的RNAi试剂，其中所述有义链包含Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuu^Zca^Zug^Zaa^Zsa(invAb)(6-S)-X(SEQ ID NO:761)的序列，其中a、c、g和u分别代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷；Af、Cf、Gf和Uf分别代表2′-氟腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷，且每个Z独立地代表药理学部分，Y-(NH-C6)s代表:(invAb)代表:且(6-S)代表:

实施方案14.实施方案12或13中的任一个的RNAi试剂，其中所述反义链与所述有义链是至少基本上互补的。

实施方案15.实施方案1-14中的任一个的RNAi试剂，其中所述有义链的核苷酸由Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuu^Zca^Zug^Zaa^Zsa(invAb)(6-S)-X(SEQ ID NO:761)的序列组成，其中a、c、g和u分别代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷；Af、Cf、Gf和Uf分别代表2′-氟腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷，且每个Z独立地代表药理学部分，Y-(NH-C6)s代表:(invAb)代表:且(6-S)代表:

实施方案16.实施方案15的RNAi试剂，其中所述反义链的核苷酸由usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg(SEQ ID NO:30)的序列组成，其中a、c、g和u分别代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷；Af、Cf、Gf和Uf分别代表2′-氟腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷。

实施方案17.实施方案1-16中的任一个的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂的有义链连接至至少一个靶向配体。

实施方案18.实施方案17的RNAi试剂，其中所述靶向配体包含对整联蛋白具有亲和力的化合物。

实施方案19.实施方案18的RNAi试剂，其中所述靶向配体包含对整联蛋白α-v-β-3、α-v-β-5、或α-v-β-3和α-v-β-5二者具有亲和力的化合物。

实施方案20.实施方案19的RNAi试剂，其中所述靶向配体是下式的化合物：

其中，

X是-C(R³)₂-、-NR³-、

Y是任选地被取代的亚烷基，其中在亚烷基链中具有1-8个碳原子；

Z是O、NR³或S；

R¹是任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的杂环基、任选地被取代的环烷基，或R¹包含RNAi试剂；

R²是H、任选地被取代的烷基，或R²包含RNAi试剂；

R³的每个实例独立地选自H和任选地被取代的烷基，或R³包含RNAi试剂；

R⁴是H或任选地被取代的烷基；且

其中Y、R¹、R²中的至少一个、R³的任何实例和R⁴包含RNAi试剂。

实施方案21.实施方案20的RNAi试剂，其中所述靶向配体选自：

其中指示与HIF-2αRNAi试剂的连接点。

实施方案22.实施方案1-21中的任一个的RNAi试剂，其中所述靶向配体具有以下结构：

实施方案23.实施方案1-22中的任一个的RNAi试剂，所述试剂进一步包含药代动力学(PK)增强剂。

实施方案24.实施方案23的RNAi试剂，其中所述PK增强剂包含下式：

其中Y是任选地被取代的饱和的或不饱和的脂族链且n是5-25的整数。

实施方案25.实施方案24的RNAi试剂，其中所述PK增强剂包含

实施方案26.实施方案23的RNAi试剂，其中所述PK增强剂选自：

其中指示与RNAi试剂的连接点。

实施方案27.实施方案1-26中的任一个的RNAi试剂，其中所述靶向配体连接至所述有义链。

实施方案28.实施方案23-27中的任一个的RNAi试剂，其中所述PK增强剂连接至所述有义链。

实施方案29.实施方案1-28中的任一个的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂连接至2-10个靶向配体。

实施方案30.实施方案1-29中的任一个的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂在所述有义链的5’末端端部处连接至包含2个或更多个靶向配体的靶向基团。

实施方案31.实施方案1-30中的任一个的RNAi试剂，其中至少一个靶向配体连接至所述有义链的5’末端端部，且至少一个靶向配体连接至所述有义链的非末端核苷酸。

实施方案32.连接至两个或更多个靶向配体的实施方案1-31中的任一个的RNAi试剂，其中所述2个或更多个靶向配体在分支点处连接以形成靶向基团。

实施方案33.实施方案32的RNAi试剂，其中所述靶向基团包含三个靶向配体且所述靶向基团具有下式：

其中，

L¹、L²和L³各自独立地是包含任选地被取代的亚烷基的接头；

L⁴是包含任选地被取代的亚烷基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的环烷基的接头；

R⁵是H或任选地被取代的烷基；

TL是靶向配体；且

Y是O或S。

实施方案34.实施方案33的RNAi试剂，其中所述靶向基团具有下式：

实施方案35.实施方案1-34中的任一个的RNAi试剂，其中三齿靶向基团连接至所述有义链的5’末端端部，且其中至少两个额外靶向配体连接至所述有义链的一个或多个核苷酸。

实施方案36.实施方案31或35的RNAi试剂，其中至少10个核苷酸定位在位于所述有义链的5’末端上的靶向基团和位于所述有义链上的靶向配体之间。

实施方案37.实施方案1-36中的任一个的RNAi试剂，其中至少一个靶向配体连接至所述RNAi试剂的有义链的核苷酸的2’位置。

实施方案38.实施方案23-37中的任一个的RNAi试剂，其中所述PK增强剂连接至所述有义链的3’末端端部。

实施方案39.实施方案1-38中的任一个的RNAi试剂，其中5-8个靶向配体连接至所述有义链。

实施方案40.实施方案39的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂的有义链连接至至少一个三齿靶向基团，且至少两个靶向配体连接至所述有义链的一个或多个核苷酸。

实施方案41.实施方案40的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂的有义链连接至(i)在所述有义链的5’末端端部处的三齿靶向基团，和(ii)连接至所述有义链的除了5’末端核苷酸以外的核苷酸的2-4个靶向配体。

实施方案42.实施方案29-41中的任一个的RNAi试剂，其中所述靶向配体如下连接至所述有义链：(i)包含3个单独靶向配体的三齿靶向基团位于有义链的5’末端端部；和(ii)额外靶向配体是连接至所述有义链的单个核苷酸的单个靶向配体，所述单个核苷酸距离所述有义链的5’末端端部至少10个核苷酸。

实施方案43.实施方案42的RNAi试剂，其中所述靶向配体连接至有义链核苷酸，所述有义链核苷酸位于从与所述反义链的5’末端核苷酸形成碱基对的3’末端核碱基开始的位置2、4、6和8(3’→5’)。

实施方案44.实施方案43的RNAi试剂，其中至少一个靶向配体连接至在核糖环的2’位置、核糖环的3’位置、核糖环的1’位置或核苷酸的核碱基、核糖环的4’位置或核苷酸的5’位置的单个核苷酸。

实施方案45.实施方案44的RNAi试剂，其中至少一个靶向配体连接至单个核苷酸的核糖环的2’位置。

实施方案46.实施方案1-45中的任一个的RNAi试剂，其中所述有义链是18-49个核苷酸之间的长度，且所述反义链是18-49个核苷酸之间的长度。

实施方案47.实施方案46的RNAi试剂，其中所述有义链和所述反义链各自具有18-27个核苷酸之间的长度。

实施方案48.实施方案47的RNAi试剂，其中所述有义链和所述反义链各自具有18-24个核苷酸之间的长度。

实施方案49.实施方案48的RNAi试剂，其中所述有义链和所述反义链各自是21个核苷酸的长度。

实施方案50.实施方案46-49中的任一个的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂具有两个平头末端。

实施方案51.实施方案1-50中的任一个的RNAi试剂，其中所述有义链包含1或2个末端帽。

实施方案52.实施方案1-51中的任一个的RNAi试剂，其中所述有义链包含1或2个倒置脱碱基残基。

实施方案53.实施方案1-52中的任一个的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂包含形成双链体的有义链和反义链，所述双链体具有表5中的任一种双链体的结构。

实施方案54.实施方案51-53中的任一个的RNAi试剂，其中所述有义链进一步包括在核苷酸序列的3’末端处、在核苷酸序列的5’末端处、或在核苷酸序列的3’末端和5’末端二者处的倒置脱碱基残基。

实施方案55.一种HIF-2αRNAi试剂，其包含：

(i)包含至少17个邻接核苷酸的反义链，其与在表3中提供的任一个序列相差0或1个核苷酸；和

(ii)有义链，其包含与所述反义链至少部分地互补的核苷酸序列。

实施方案56.一种能够抑制HIF-2α(EPAS1)基因的表达的RNAi试剂，其包含：

(i)具有18-49个核苷酸之间的长度的反义链，其与HIF-2α(EPAS1)基因(SEQ IDNO:1)至少部分地互补；

(ii)与所述反义链至少部分地互补的有义链；

(iii)连接至所述有义链的靶向配体；和

(iv)连接至所述有义链的PK增强剂。

实施方案57.实施方案56的RNAi试剂，其中所述靶向配体连接至所述有义链的5’末端端部。

实施方案58.实施方案56或57的RNAi试剂，其中所述PK增强剂连接至所述有义链的3’末端端部。

实施方案59.实施方案56-58中的任一个的RNAi试剂，其中一种或多种靶向配体连接至所述有义链的一个或多个核苷酸。

实施方案60.实施方案59的RNAi试剂，其中2-12个靶向配体连接至所述有义链的核苷酸。

实施方案61.实施方案56-60中的任一个的RNAi试剂，其中包含三个靶向配体的三齿靶向基团连接至所述有义链的5’末端端部；PK增强剂连接至所述有义链的3’末端端部；且2-12个靶向配体连接至所述有义链的单个核苷酸。

实施方案62.实施方案61的RNAi试剂，其中连接至所述有义链的单个核苷酸的靶向配体是连接在每个相应核苷酸的2’位置。

实施方案63.实施方案56-62中的任一个的RNAi试剂，其中靶向配体连接至从与反义链形成碱基对的第一个核苷酸开始位于位置2、6、15和19(3’→5’)处的核苷酸。

实施方案64.实施方案56-62中的任一个的RNAi试剂，其中靶向配体连接至从与反义链形成碱基对的第一个核苷酸开始位于位置2、4、6和8(3’→5’)处的核苷酸。

实施方案65.实施方案56-62中的任一个的RNAi试剂，其中靶向配体连接至在反义链的核苷酸2、4、6和8(5’→3’)对面的有义链的核苷酸。

实施方案66.实施方案56-65中的任一个的RNAi试剂，其中包含三个靶向配体的三齿靶向基团位于有义链的5’末端端部，所述有义链进一步包括2-4个连接至有义链的核苷酸的靶向配体，且存在将在有义链的5’末端端部处的三齿靶向基团与附着于核苷酸的下一个最近靶向配体隔开的至少10个核苷酸。

实施方案67.实施方案66的RNAi试剂，其中四个靶向配体连接至所述有义链的单个核苷酸。

实施方案68.实施方案56-67中的任一个的RNAi试剂，其中所述靶向配体是整联蛋白靶向配体，其包括对整联蛋白α-v-β-3具有亲和力的化合物。

实施方案69.实施方案56-68中的任一个的RNAi试剂，其中所述PK增强剂具有下式：

其中Y是任选地被取代的饱和的或不饱和的脂族链且n是5-25的整数。

实施方案70.一种RNAi试剂，其包含含有序列usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg(SEQ ID NO:30)的反义链、含有序列Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuu^Zca^Zug^Zaa^Zsa(invAb)(6-S)-X(SEQ ID NO:761)的有义链，其中a、c、g和u分别代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷；Af、Cf、Gf和Uf分别代表2′-氟腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷；u^Z、a^Z、g^Z和c^Z分别代表尿苷、腺苷、鸟苷和胞苷，其中包含Z的药理学部分连接在核苷酸的2′位置；Y-(NH-C6)s代表:(invAb)代表:(6-S)代表:且每个X、Y和Z独立地代表：

(i)包含一个或多个向配体的靶向基团，其中所述靶向配体选自：结构2a、结构2.11a、结构29a和结构32a；

(ii)具有选自以下的结构的靶向配体：结构2a、结构2.11a、结构29a和结构32a；或

(iii)具有选自以下的结构的PK增强剂：C-18二酸、C-18三酸、Mal-C₁₇-乙烯基-PO₃和C20酸。

实施方案71.实施方案70的RNAi试剂，其中每个Z是具有结构2a的结构的靶向配体：其中指示连接点。

实施方案72.实施方案70的RNAi试剂，其中每个Z是具有结构2.11a的结构的靶向配体:其中指示连接点。

实施方案73.实施方案70的RNAi试剂，其中每个Z是具有结构29a的结构的靶向配体:其中指示连接点。

实施方案74.实施方案70的RNAi试剂，其中每个Z是具有结构32a的结构的靶向配体:其中指示连接点。

实施方案75.实施方案70-74中的任一个的RNAi试剂，其中X是具有C-18二酸的结构的PK增强剂:其中指示连接点。

实施方案76.实施方案70-74中的任一个的RNAi试剂，其中X是具有Mal-C-18三酸的结构的PK增强剂:其中指示连接点。

实施方案77.实施方案70-74中的任一个的RNAi试剂，其中X是具有Mal-C17-乙烯基PO3的结构的PK增强剂:其中指示连接点。

实施方案78.实施方案70-74中的任一个的RNAi试剂，其中X是具有Mal-C20酸的结构的PK增强剂:其中指示连接点。

实施方案79.实施方案70-78中的任一个的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂包括2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶向配体。

实施方案80.实施方案79的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂包括7个靶向配体。

实施方案81.实施方案80的RNAi试剂，其中Y是具有以下结构的靶向基团：TriAlk14:或TriAlk 14s:其中TL包含选自以下的靶向配体：结构2a、结构2.11a、结构29a和结构32a。

实施方案82.实施方案81的RNAi试剂，其中每个TL包含结构2a:其中指示连接点。

实施方案83.实施方案81的RNAi试剂，其中每个TL包含结构2.11a:其中指示连接点。

实施方案84.实施方案81的RNAi试剂，其中每个TL包含结构29a:其中指示连接点。

实施方案85.实施方案81的RNAi试剂，其中每个TL包含结构32a:其中指示连接点。

实施方案86.实施方案70-81中的任一个的RNAi试剂，其中所述反义链的核苷酸由SEQ ID NO:30的核苷酸组成。

实施方案87.实施方案70-82中的任一个的RNAi试剂，其中所述有义链的核苷酸由SEQ ID NO:761的核苷酸组成。

实施方案88.包含实施方案1-88中的任一个的RNAi试剂的组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。

实施方案89.实施方案88的组合物，其进一步包含用于抑制HIF-2α的表达的第二种RNAi试剂。

实施方案90.实施方案88或89的组合物，其进一步包含一种或多种另外的治疗剂。

实施方案91.一种用于抑制细胞中HIF-2α(EPAS1)基因的表达的方法，所述方法包括向细胞中引入有效量的实施方案1-88中的任一个的RNAi试剂或实施方案88-90中的任一个的组合物。

实施方案92.实施方案91的方法，其中所述细胞是在受试者体内。

实施方案93.实施方案92的方法，其中所述受试者是人受试者。

实施方案94.实施方案91-94中的任一个的方法，其中所述HIF2-α基因表达被抑制了至少约30％。

实施方案95.一种治疗HIF2-α相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括给有此需要的人受试者施用治疗有效量的实施方案88-90中的任一个的组合物。

实施方案96.实施方案95的方法，其中所述疾病或障碍是癌症、肾癌、透明细胞肾细胞癌、非小细胞肺癌、星形细胞瘤(脑癌)、膀胱癌、乳腺癌、软骨肉瘤、结肠直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头和颈鳞状细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、神经母细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、直肠癌、转移、牙龈炎、银屑病、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒、先兆子痫、炎症、慢性炎症、新生血管疾病或类风湿性关节炎。

实施方案97.实施方案95或96的方法，其中所述疾病是透明细胞肾细胞癌(ccRCC)。

实施方案98.实施方案91-97中的任一个的方法，其中以约3mg/kg至约80mg/kg人受试者体重的剂量施用所述RNAi试剂。

实施方案99.实施方案98的方法，其中以约5mg/kg至约20mg/kg人受试者体重的剂量施用所述RNAi试剂。

实施方案100.实施方案98或99的方法，其中以分次剂量施用所述RNAi试剂，其中在初次施用中施用期望的每日量的约一半，并在初次施用后大约4小时施用期望的每日量的剩余约一半。

实施方案101.实施方案98-100中的任一个的方法，其中每周1次施用所述RNAi试剂的一个或多个剂量。

实施方案102.实施方案99-101中的任一个的方法，其中每2周1次(隔周一次)施用所述RNAi试剂的剂量或分次剂量。

实施方案103.实施方案1-88中的任一个的RNAi试剂或根据实施方案88-90中的任一个的组合物用于治疗至少部分地由HIF-2α(EPAS1)基因表达介导的疾病、障碍或症状的用途。

实施方案104.根据实施方案103所述的用途，其中所述疾病是ccRCC。

实施方案105.实施方案1-88中的任一个的RNAi试剂或根据实施方案88-90中的任一个的组合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗至少部分地由HIF-2α(EPAS1)基因表达介导的疾病、障碍或症状。

实施方案106.实施方案105所述的用途，其中所述疾病是ccRCC。

其它实施方案

应当理解，尽管已经结合其详细说明描述了本发明，但是前述说明书意在只是说明性的，并且不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和改变是在所附权利要求的范围内。