阅读说明：本技术 一种检测miRNA-141的生物传感器及其制备方法与应用 (Biosensor for detecting miRNA-141 and preparation method and application thereof ) 是由 王玉 孙文玉 刘素 黄加栋 王业茹 江龙 张曼茹 李莎莎 张雪 于 2020-04-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物传感器技术领域,特别涉及基于荧光强度变化与链置换反应与杂交链式反应辅助的循环放大的生物传感器。为了解决以上现有技术中检测miRNA-141的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题。一种基于荧光检测miRNA-141的生物传感器,将荧光强度变化与链置换反应与杂交链式反应辅助的循环放大相结合,均相反应混合液。制备方法：合成银簇；miRNA-141、S4、S、AgNCs-DNA、H1、H2在均相体系中混合反应。利用链置换反应辅助的循环放大,实现Trigger的循环利用,起到了信号放大的作用。(The invention relates to the technical field of biosensors, in particular to a biosensor based on fluorescence intensity change and auxiliary cyclic amplification of strand displacement reaction and hybridization chain reaction. The method aims to solve the problems of low specificity and sensitivity and high cost of the method for detecting miRNA-141 in the prior art. A biosensor for detecting miRNA-141 based on fluorescence combines fluorescence intensity change with strand displacement reaction and hybrid chain reaction assisted cyclic amplification to perform homogeneous reaction on mixed liquid. The preparation method comprises the following steps: synthesizing silver clusters; miRNA-141, S4, S, AgNCs-DNA, H1 and H2 are mixed and reacted in a homogeneous system. And the cyclic utilization of the Trigger is realized by using the chain displacement reaction-assisted cyclic amplification, and the signal amplification effect is achieved.)

一种检测miRNA-141的生物传感器及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种检测miRNA-141的生物传感器及其制备方法与应用，具体涉及基于链置换反应和杂交链式反应双重信号循环放大及银簇荧光强度变化检测miRNA-141的生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20-25个核苷酸。人体中大部分miRNAs通过与靶基因miRNAs的3’端非转录区域碱基互补完全或不完全配对的形式来抑制miRNA的翻译，并诱导miRNA的切割降解，进一步由细胞到个体的各个水平上影响人体的生长发育，同时参与包括肿瘤在内的多种疾病过程。miRNA-141，其核酸链碱基顺序是5’- UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’。研究表明，miRNA-141 的异常表达与细胞增殖、凋亡、分化、个体发育以及前列腺癌发展、侵袭、转移密切相关。这为前列腺癌、前列腺增生生物标志物的寻找提供了一个新的途径。

目前报道的MiRNA的检测方法主要有定量逆转录-聚合酶链式反应（qRT—PCR）和Northern blotting 法、克隆测序法、实时荧光定量PCR等，但实时荧光定量PCR对温度和仪器要求较高，专业技术要求高；Northern blotting法耗时、过程复杂、检测灵敏度不高，克隆测序法也是耗时耗力。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测miRNA-141。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测miRNA-122的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的，基于链置换反应和杂交链式反应双重信号循环放大及银簇荧光强度变化检测miRNA-141的生物传感器，同时本发明还提供了基于链置换反应和杂交链式反应双重信号循环放大及银簇荧光强度变化检测miRNA-141的生物传感器的制备方法及应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种检测miRNA-141的生物传感器，包括复合探针S、AgNCs-DNA、miRNA-141、S4、H1、H2、buffer；

所述的复合探针S是S3与S1、S2杂交成双链形成的；

所用到的碱基序列为：

H1碱基序列如SEQ No.1所示；具体为:5’-GTCTTG-GTTAGATCGCCAAGGTTTCTGTAGCTACGA CGATCAGACCTTGGCGAGTCGTAGCTACAGAAACCTTGGCGA-3’；

H2碱基序列如SEQ No.2所示；具体为:5’-ACCTTGGCGA GTCGTAGCTACAGAAACCTTGGCGATC TAACTTCTGTAGCTACGACTCGCCAAGGT-CTGATCCAAGAC-3’

AgNCs-DNA碱基序列如SEQ No.3所示；具体为:5’-CCCACCCACCCGCCCAAGTCTTGTCGCCAAGGTCAAGAC-BHQ1-3’

S2碱基序列如SEQ No.4所示；具体为:5’-GTCGTAGCTACAGAAACCTTGGCGATCTAAC-3’

S3碱基序列如SEQ No.5所示；具体为:5’-GATCGCCAAGGT-TTCTGTAGCTACGACGGGAT-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’

S1碱基序列如SEQ No.6所示；具体为: 5’-TCTGGTAAAGATGGATCCC-3’

S4碱基序列如SEQ No.7所示；具体为:5’-TCTGGTAAAGATGGATCCCGTCGTAGCTACAGAAACCTTGGCGATC-3’

miRNA-141碱基序列如SEQ No.8所示；具体为: 5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’；

所述AgNCs-DNA的3’连接有-BHQ1。

上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）复合探针S的制备：S3事先与S1、S2杂交成双链，形成复合探针S；

（2）使用发夹AgNCs-DNA链制备纳米银簇AgNCs：

（3）将miRNA-141、S4、S、AgNCs-DNA、H1、H2、buffer、水混合，反应；

（4）加入步骤（2）制备的纳米银簇AgNCs-DNA，荧光检测。

所述的步骤（1）的过程为：将S3和S1、S2、buffer、水混合均匀，95℃下反应3min，然后慢慢冷却到室温。

所述的步骤（2）纳米银簇AgNCs的制备，方法如下：向PB缓冲溶液，加入H2、AgNO₃，混匀后4℃放置15-30min，加入现配的NaHBO₄，震荡1min，4℃放置4h以上。

所述的步骤（3）过程为：取S、S4、H1、H2、buffer、miRNA-141、水混合均匀，在37℃下反应1.2h。

上述方法制备的生物传感器在非疾病诊断上检测miRNA-122的应用。

本发明中一共用到了8条DNA链，其序列分别是：

H1:5’-GTCTTG-GTTAGATCGCCAAGGTTTCTGTAGCTACGACGATCAGACCTTGGCGAGTCGTAGCTACAGAAACCTTGGCGA-3’

H2:5’-ACCTTGGCGA GTCGTAGCTACAGAAACCTTGGCGATCTAACTTCTGTAGCTACGACTCGCCAAGGT-CTGATCCAAGAC-3’

AgNCs-DNA:5’-CCCACCCACCCGCCCAAGTCTTGTCGCCAAGGTCAAGAC-BHQ1-3’

S2:5’-GTCGTAGCTACAGAAACCTTGGCGATCTAAC-3’

S3:5’-GATCGCCAAGGT-TTCTGTAGCTACGACGGGAT-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’

S1: 5’-TCTGGTAAAGATGGATCCC-3’

S4:5’-TCTGGTAAAGATGGATCCCGTCGTAGCTACAGAAACCTTGGCGATC-3’

miRNA-141: 5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’

其中，S3的加粗部分与S1互补配对，S3的斜体部分与 S2的斜体部分互补配对，S3与S1、S2形成杂交双链。在目标物miRNA-141存在的条件下，会发生toehold端介导的链置换放大反应，将S1从S3上置换下来。S4继续借助上述反应过程的产物进行链置换放大反应，将S2、miRNA-141从S3上置换下来，形成S3、S4杂交双链。S2作为trigger链继续进行下一轮放大反应。S2与H1链的斜体部分互补配对，将发夹探针H1打开，H1的加粗部分与和H2的加粗部分互补配对，将发夹探针H2打开，H2的斜体部分与H1的斜体部分互补配对，进行杂交链式反应（HCR)，H1和H2虚线下划线部分未能参与互补配对，虚线下划线部分可以将AgNCs-DNA发夹打开，使得5’端银簇和3’端的猝灭基团分开，从而产生荧光信号。AgNCs-DNA链斜体部分是银簇序列。

本发明的检测方式是通过荧光检测miRNA-141，在不加入目标物miRNA-141的情况下，体系中已经合成好的AgNCs-DNA，它的荧光被3’端BHQ猝灭。加入目标物miRNA-141以后，通过链置换放大反应产生S2链，S2链打开H1，H1打开H2，进行杂交链式反应。H1、H2的紫色填充部分会打开AgNCs-DNA链，AgNCs与猝灭基团BHQ分开，从而产生荧光信号。

本发明基于链置换反应产生S2链进行后续的反应，利用杂交链式反应辅助循环放大以及荧光方法构建了荧光生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补miRNA-141现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、超灵敏性检测

利用链置换放大反应、以及杂交链式反应，实现了目标物miRNA-141的双重循环放大；利用杂交链式反应的产物，将分子信标打开，产生荧光信号，杂交链式反应本身就是一种放大方式，从而使得荧光信号非常强，实现了放大检测信号，其检测方法操作简便、结果明显、检测周期短、提高了检测的灵敏度，实现对目标物miRNA的超灵敏性检测；

2、反应条件温和，反应速度快

该传感器的反应条件温和，反应速度快；检测主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速、简单、灵敏的检测；

3、产业化

制备方法简单，性能稳定，适用于医疗卫生领域对于肿瘤标志物miRNA的检测以及为后续肿瘤的治疗打下基础以及生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1传感器检测的标准曲线；

图3为实施例2时间优化检测结果图；

图4为实施例3 AgNCs-DNA浓度优化检测结果图；

图5为实施例4 S4浓度优化检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

一种检测miRNA-141的的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1) S3事先与S1、S2杂交成双链，形成复合探针S；

(2) 使用发夹AgNCs-DNA链制备纳米银簇AgNCs：

(3) 将miRNA-141、S4、S、AgNCs-DNA、H1、H2在均相体系中混合反应。

所述步骤（2）的AgNCs银簇的制备操作步骤如下：

1.配置PB缓冲溶液（浓度为20mM），PB缓冲溶液是由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠组成，分别称取0.7163g的磷酸氢二钠与0.3120g的磷酸二氢钠，各配成100mL溶液，然后取一部分磷酸氢二钠与一部分磷酸二氢钠混合，将其混合溶液的pH值调至6.5然后备用。

2.配制AgNO₃浓度为2mM,体积为1mL，AgNO₃见光易分解，现用现配，配置AgNO₃时先用锡箔纸包裹离心管。

3.取1mL的离心管，加入76μL的PB（20mM），加入15μL发夹2（100μM），加入4.5μL的AgNO₃（2mM），震荡1min，放于4℃冰箱15-30min。在此期间配制NaHBO_4，浓度为2mM，体积为1mL，NaHBO₄现用现配，受热易分解，用0℃冰水配制。

4.从冰箱中取出后，加入4.5μL NaHBO₄（2mM）于反应体系中，震荡1min,放在4℃冰箱4h以上。

5.取30ul制备好的AgNCs于离心管中，加入120ul超纯水混匀，用移液枪取150ul溶液于微量比色皿中，使用荧光分析仪对其进行扫描，使用激发光560nm,测得其发射峰在625nm，证明成功合成AgNCs。

所述步骤（1）的过程为：将2μL的S3链（1μM）和2μL的S1链（1μM）、2μL的S2链（1μM）、4μL的buffer(50mM)、6μL的水混合均匀，95℃下反应3min，然后慢慢冷却到室温。

所述步骤（3）的过程为：取上述反应产物2μL、2μL的S4链（1μM）、2μL的H1链（1μM）、2μL的H2链（1μM）、4μL的buffer(50mM)、和1μL的miRNA-141以及超纯水混合均匀，在37℃下反应1.2h。将上述合成好的AgNCs-DNA取2μL(1.0μM)加入反应产物中，之后用荧光仪对其进行检测。

本发明的检测方式是通过荧光检测miRNA-141，在不加入目标物miRNA-141的情况下，体系中已经合成好的AgNCs-DNA，它的荧光被3’端BHQ猝灭。加入目标物miRNA-141以后，通过链置换放大反应产生S2链，S2链打开H1，H1打开H2，进行杂交链式反应。H1、H2的紫色填充部分会打开AgNCs-DNA链，AgNCs与猝灭基团BHQ分开，从而产生荧光信号。

本发明基于链置换反应产生S2链进行后续的反应，利用杂交链式反应辅助循环放大以及荧光方法构建了荧光生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补miRNA-141现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

实施例1

生物传感器的反应过程的主要步骤如下：

1、将2μL的S3链（1μM）和2μL的S1链（1μM）、2μL的S2链（1μM）、4μL的buffer(50mM)、6μL的水混合均匀，95℃下反应3min，然后慢慢冷却到室温。

2、取上述反应产物2μL、2μL的S4链（1μM）、2μL的H1链（1μM）、2μL的H2链(1μM) 、4μL的buffer（50mM）和不同浓度的miRNA-141（0nm,1pM,10pM,100pM,1nM,10nM,100nM,1μM）以及超纯水混合均匀，在37℃下反应1.2h。将上述合成好的AgNCs-DNA取2μL(1.0μM)加入反应产物中，之后用荧光仪对其加入目标物前后荧光强度变化进行检测。

经检测，如图2，检测到的荧光信号强度随着miRNA-141的浓度在1pM-1μM区间内逐渐上升。

实施例2

生物传感器的反应过程的主要步骤如下：

1、将2μL的S3链（1μM）和2μL的S1链（1μM）、2μL的S2链（1μM）、4μL的buffer(50mM)、6μL的水混合均匀，95℃下反应3min，然后慢慢冷却到室温。

2、取上述反应产物2μL、2μL的S4链（1μM）、2μL的H1链（1μM）、2μL的H2链（1μM）、4μL的buffer(50mM)、和1μL的miRNA-141以及超纯水混合均匀，在37℃条件下水浴不同时间(20min,40min,60min,80min,100min,120min)。将上述合成好的AgNCs-DNA取2μL(1.0μM)加入反应产物中，之后用荧光仪对其加入目标物前后荧光强度变化进行检测。

经检测，如图3，检测到的荧光信号强度随着时间在0-80min区间内逐渐增大，80-120min荧光强度基本保持不变，当反应时间为80min时，荧光强度值达到了最大值，因而，本实验方案的最佳反应时间是80min。

实施例3

生物传感器的反应过程的主要步骤如下：

1、将2μL的S3链（1μM）和2μL的S1链（1μM）、2μL的S2链（1μM）、4μL的buffer(50mM)、6μL的水混合均匀，95℃下反应3min，然后慢慢冷却到室温。

2、取上述反应产物2μL、2μL的S4链（1μM）、2μL的H1链（1μM）、2μL的H2链（1μM）、4μL的buffer(50mM)、和1μL的miRNA-141以及超纯水混合均匀，在37℃下反应1.2h。将上述合成好的不同浓度的AgNCs-DNA（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μM）加入反应产物中，之后用荧光仪对其加入目标物前后荧光强度变化进行检测。

经检测，如图4，检测到的荧光信号强度随着AgNCs-DNA的浓度在0-1.4μM区间内先逐渐增大后保持不变，当AgNCs-DNA浓度为1.0μM时，荧光强度值达到了最大值，因而AgNCs-DNA的最佳浓度为1.0μM。

实施例4

生物传感器的反应过程的主要步骤如下：

1、将2μL的S3链（1μM）和2μL的S1链（1μM）、2μL的S2链（1μM）、4μL的buffer(50mM)、6μL的水混合均匀，95℃下反应3min，然后慢慢冷却到室温。

2、取上述反应产物2μL、2μL不同浓度的S4链（0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2μM）、2μL的H1链（1μM）、2μL的H2链（1μM）、4μL的buffer(50mM)、和1μL的miRNA-141以及超纯水混合均匀，在37℃下反应1.2h。将上述合成好的AgNCs-DNA取2μL(1.0μM)加入反应产物中，之后用荧光仪对其加入目标物前后荧光强度变化进行检测。

经检测，如图5，检测到的荧光信号强度随着S4链浓度在0.2-1.2μM区间内先逐渐增大后保持不变，当S4链浓度为1.0μM时，荧光强度值达到了最大值，因而，S4链的最佳浓度为1.0μM。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种检测miRNA-141的生物传感器及其制备方法与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

gtcttggtta gatcgccaag gtttctgtag ctacgacgat cagaccttgg cgagtcgtag 60

ctacagaaac cttggcga 78

<210> 2

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

accttggcga gtcgtagcta cagaaacctt ggcgatctaa cttctgtagc tacgactcgc 60

caaggtctga tccaagac 78

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

cccacccacc cgcccaagtc ttgtcgccaa ggtcaagac 39

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

gtcgtagcta cagaaacctt ggcgatctaa c 31

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

gatcgccaag gtttctgtag ctacgacggg atccatcttt accagacagt gtta 54

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 6

tctggtaaag atggatccc 19

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 7

tctggtaaag atggatcccg tcgtagctac agaaaccttg gcgatc 46

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 8

uaacacuguc ugguaaagau gg 22