具体实施方式

下面通过实验对本发明要求保护的技术方案及其技术效果进行说明。除非另作特殊说明，本发明中所用材料、试剂均可从本领域商业化产品中获得。

1.材料与方法

1.1试剂与化学药品

以如下方法从北桑寄生中分离出鼠李素-3-O-α-鼠李糖苷（ARR），其结构式见图1A。

步骤一，称取粉碎后的北桑寄生药材用75%乙醇超声提取3次，每次20min。提取液合并，减压浓缩得醇浸膏；

步骤二，取1g醇浸膏用温水捏溶成悬浮液定容至2ml，加入D101型大孔吸附树脂柱，用3倍量柱体积蒸馏水洗脱，去除大量的水溶性杂质；继续用3倍量60%的乙醇洗脱黄酮类化合物，收集洗脱液，浓缩，得到富集总黄酮；

步骤三，取60%乙醇提取的富集总黄酮1g与1g 200-300目硅胶，加入无水乙醇在旋转蒸发仪中拌样；

步骤四，用二氯甲烷:甲醇=17:2的溶剂硅胶柱湿法装柱，使用真空泵压柱或者自然沉降4h，将拌样的样品加入粗品与硅胶的比例为1:25的硅胶柱后加入2g硅胶，先使用二氯甲烷:甲醇:甲酸=17:2:1的流动相以3倍量的柱体积洗脱，分10mL试管收集洗脱液；再使用二氯甲烷:甲醇=4:1的流动相以3倍量的柱体积洗脱，分10mL试管收集洗脱液。点薄层色谱硅胶板，展开剂为二氯甲烷:甲醇:甲酸=17:2:1，将化合物一致的试管混合，旋转蒸发仪65°C减压浓缩得鼠李素-3-O-α-鼠李糖苷单体。

脂多糖（LPS）和吲哚美辛（Indo）购自Sigma-aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。DMEM高糖培养基，胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素均购自Gibco（美国马里兰州盖瑟斯堡）。包括NF-κB p65、磷酸-NF-κB-p65、Nrf2、NQO1、HO-1、NLRC3和TRAF6在内的主要兔单克隆抗体是从Abcam（英国剑桥）获得的。细胞因子小鼠酶联免疫试剂盒购自Elabscience（中国，武汉）。

1.2细胞培养和细胞活力测定

小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7，目录号：CL-0190）的白血病细胞获自Procell LifeScience＆Technology Co.Ltd.（武汉，中国），并在添加有10% 热灭活FBS和1% 青霉素-链霉素的DMEM培养基中孵育在37°C和5% CO2的培养箱中。进行2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二硫代-苯甲基）-2H-四唑啉钠盐（WST-8）测定以测量药物对细胞的活力作用。将RAW264.7巨噬细胞（4 × 104细胞/mL）接种在96孔板（100 μL/孔）中并用各种量的ARR（5、10、20、40、80、100、200 μg/mL）处理）24小时。然后将10 μL WST-8试剂（Sigma-aldrich，美国密苏里州圣路易斯）添加到每个孔中，并与细胞再孵育2小时。在电子偶联剂1-甲氧基PMS的存在下，WST-8转化为橙黄色水溶性甲臜。使用Thermo Scientific酶标仪（Thermo Fisher Scientific，上海，中国）在450nm下测定光密度。

1.3一氧化氮（NO）测定

为了进行NO分析，在6孔板中培养了1 × 10⁶ RAW264.7巨噬细胞。温育24小时后，加入LPS并与细胞温育2小时，然后加入各种量的ARR（25、50、100 μg/mL）。再过24小时后，将200 µL Griess试剂（Sigma-aldrich，美国）和培养基混合物添加到96孔板中，并在黑暗中于37°C孵育30分钟。使用Thermo Scientific Microplate Reader在550 nm下检测吸光度。

1.4细胞因子测定

使用ELISA试剂盒根据试剂盒的说明书确定每组巨噬细胞上清液中的细胞因子IL-6，IL-1β，PGE₂。然后立即通过Thermo Scientific Microplate Reader在450 nm的每个孔中对吸光度进行定量。

1.5实时定量PCR（RT-qPCR）

使用Trizol（TransGen Biotech，北京，中国）从RAW264.7细胞中获得总RNA，并使用Nanodrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，上海，中国）测定分离的RNA的质量和浓度。根据RT-qPCR合成试剂盒的规格，使用RT-qPCR合成试剂盒合成了第一链cDNA。使用RT-qPCR试剂盒（PerfectStartTM Green qPCR SuperMix，TransGen Biotech）对IL-6，IL-1β，COX-2，iNOS和GAPDH的mRNA进行分析。将IL-6，IL-1β，COX-2，iNOS的mRNA表达标准化为GAPDH（作为内部对照），并使用2^-ΔΔCt方法进行计算。引物如表1所示。

1.6免疫印迹

通过使用全细胞裂解测定（KeyGEN Bio TECH，江苏，中国）裂解RAW264.7细胞。使用核和细胞质蛋白质提取试剂盒（KeyGEN Bio TECH）提取核和细胞质总蛋白质。用BCA蛋白质测定试剂盒（KeyGEN Bio TECH）测量蛋白质浓度。然后，将每个样品中的20 μg蛋白在10%SDS-PAGE上进行电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将特异性识别NF-κBp65，磷酸-NF-κBp65、Nrf2、HO-1、NQO1、β-肌动蛋白和组蛋白H3的一抗用封闭缓冲液以1:1000、1:1000、1:1000、1:1000、1:1000、1:2000、1:2000比例稀释。然后将膜用辣根过氧化物酶偶联的抗兔探针探测1小时。用TBST缓冲液多次洗涤后，使用增强型化学发光（ECL）溶液和化学发光成像系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.）观察蛋白条带，并使用Image Lab软件（6.0版，Bio-Rad Laboratories，公司）分析。

1.7免疫荧光显微镜

将RAW264.7细胞接种到置于6孔板孔底部的玻璃盖玻片上，并用4%多聚甲醛固定，并用0.1% TrintonX-100透化，并用10%山羊血清封闭。然后，将细胞与兔特异性NF-κB p65抗体（1：1000稀释度）和山羊抗兔二抗IgG（H + L）（CY3偶联）抗体（1：5000稀释度）一起温育。细胞核用二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，Pierce）染色后，加入一滴抗荧光淬灭固定液，并通过免疫荧光显微镜成像。使用软件Image J（美国国立卫生研究院）进行图片分析和合成。

1.8免疫组织化学染色

NLRC、TRAF6和NF-κBp65抗体用作一抗，生物素化抗体用作二抗，所有样品均用DAB染色。使用荧光显微镜获得可视化图像，并且使用Image J（美国国立卫生研究院）对获得的图像进行定量。

1.9统计分析

所有数据均以平均值±标准差（S.D.）表示。使用SPSS软件（版本26.0，IBM，纽约，美国）和GraphPad Prism 6.0版（GraphPad软件，加利福尼亚，圣地亚哥）进行统计分析。 进行单向方差分析以比较多种平均值。 P <0.05和P <0.01分别被认为具有统计学显著性和统计学极显著性。

2.结果

2.1 ARR对LPS刺激的RAW 264.7细胞中细胞活力的影响

为了研究ARR对细胞生存力的影响，将RAW264.7细胞与0-200 μg/mL ARR孵育24小时。如图1B所示，发现高达200 μg/mL的ARR浓度对RAW264.7细胞的活力没有明显影响。根据先前关于ARR抗炎作用的实验，在以下试验中使用了25至100 μg/mL的浓度。

2.2 ARR对LPS刺激的RAW264.7细胞炎症介质的影响

由于LPS诱导的炎症反应模型被广泛用于抗炎药的炎症研究中，因此我们在RAW264.7细胞中建立了LPS诱导的炎症反应模型以评估ARR的抗炎作用。与LPS孵育后，与对照组相比，NO的含量显著增加，但是，添加ARR显著抑制LPS诱导的NO分泌（图1C）。与LPS组相比，高剂量的ARR（100 μg/mL）抑制LPS诱导的NO浓度超过90%。这些结果表明ARR显著抑制了RAW264.7细胞中NO的产生。IL-6、IL-1β和PGE₂是介导炎症反应的关键炎症细胞因子，使用ELISA试剂盒检测RAW264.7细胞上清液中IL-6、IL-1β和PGE₂的含量。如图1D-F所示，与单独使用LPS治疗的组相比，LPS明显上调了IL-6、IL-1β和PGE₂的浓度，而ARR明显降低了三种炎性细胞因子的表达水平。综上所述，这些数据表明ARR通过抑制IL-6、IL-1β和PGE₂的释放发挥炎性作用，此外，ARR的抗炎能力呈剂量依赖性，在浓度为100 μg/mL时效果最佳，（图1D-F）。

2.3 ARR对LPS刺激的RAW264.7细胞促炎因子基因水平的影响

为了证明ARR对炎症因子的调节是否基于mRNA水平，使用RT-qPCR进一步检测了各种炎症因子的表达。如图2A-D所示，与单独用LPS处理相比，添加ARR后，炎性因子iNOS、IL-6、IL-1β和COX-2的mRNA水平显著降低。 100 μg/mL时，ARR的缓解作用最为明显。这些结果与ELISA结果一致，表明ARR可以通过在mRNA和蛋白质水平上抑制许多炎症因子的表达来发挥抗炎作用。

2.4 ARR对LPS刺激的RAW264.7细胞中NF-κB p65易位的影响

NF-κB是参与炎症反应的众所周知的转录因子，因此我们使用蛋白质印迹法检测了p65的磷酸化以及NF-κB p65向核的移位。LPS显著增加了NF-κB p65的磷酸化，而ARR的添加显著抑制了RAW264.7细胞中NF-κB p65的磷酸化（图3A）。LPS刺激诱导NF-κB p65易位至细胞核。但是，添加ARR可显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NF-κB p65核移位（图3B）。免疫荧光显微镜观察到了NF-κB p65核易位的相似结果。如预期的那样，与对照组相比，发现LPS显著增加了NF-κB p65核移位（图4）。但是与单独使用LPS组相比，添加ARR可以显著抑制NF-κB p65的核易位（图4）。两者合计，我们认为ARR通过抑制NF-κB p65易位发挥抗炎作用。

2.5 ARR对LPS刺激的RAW 264.7细胞中NLRC3、TRAF6和NF-κB p65蛋白表达的影响

为了进一步研究ARR对NF-κB通路的影响，进行了IHC染色以确定RAW264.7细胞中NLRC3、TRAF6和NF-κBp65的表达。LPS降低NLRC3，同时增加TRAF6和NF-κBp65表达（图5）。然而，与单独使用LPS的治疗组相比，ARR显著改善了NLRC3的表达，而TRAF6和NF-κBp65的表达却被ARR明显地阻断了。这些数据表明，ARR在炎症反应中显著增强了NLRC3的激活，降低了TRAF6和NF-κBp65的水平。

2.6 ARR对LPS刺激的RAW 264.7细胞中Nrf2途径的影响

我们还确定了ARR对LPS刺激的RAW264.7细胞中Nrf2途径的影响，结果表明，与对照组和单独使用LPS的治疗组相比，ARR明显诱导了Nrf2蛋白及其靶分子HO-1和NQO1的表达水平。（图3D-3F）。结果表明，ARR还可以通过Nrf2途径发挥抗炎作用。

3.讨论

炎症是宿主防御的自然反应过程，根据病程长短可分为急性和慢性。急性发炎以发红，肿胀，疼痛等为主要症状。慢性炎症是由炎症因子的持续存在和对组织的损害引起的，这表现为局部组织的变性，渗出和增殖。ARR是从北桑寄生中提取的类黄酮化合物，目前还没有关于ARR对炎症及其潜在机制的影响的研究。

当巨噬细胞被激活时，它们会产生许多引起炎症的炎性细胞因子。众所周知，LPS是一种巨噬细胞刺激物，可引起巨噬细胞分泌促炎因子，包括NO、PGE₂、IL-6和IL-1β。因此，在研究中我们建立了LPS诱导的炎症反应模型，以评估ARR对RAW264.7细胞的抗炎作用。暴露于高水平的NO会引起先天性免疫反应，并导致组织破裂或细胞损伤。细胞因子IL-6和IL-1β造成组织损伤，并在介导各种炎症性疾病中起重要作用。在这项研究中，我们发现ARR显著抑制促炎因子IL-6和IL-1β的分泌。

炎症反应伴随着许多信号通路的系统激活。NF-κB在炎症反应中起关键作用，因为它促进促炎细胞因子的释放，并且p65易位在NF-κB的激活中起关键作用，这也被证实是LPS诱导巨噬细胞炎症的主要信号途径。NF-κB激活的抑制已被认为是炎症治疗中的一种抗炎策略。NF-κB通过激活转录来调节iNOS、COX-2和其他相关炎症基因的表达。NO是iNOS合并的游离气体信号分子，而iNOS介导的过量NO则引起炎症反应。已知COX-2会产生促炎物质前列腺素（例如PGE₂）并引起炎症。包括类黄酮，槲皮素，染料木黄酮和山奈酚在内的多种天然化合物已被视为天然COX-2抑制剂。Min-Seon Kim证明了formononetin-7-O-磷酸盐通过抑制NF-κB核移位来抑制COX-2。

我们还探讨了ARR是否通过NF-κB信号通路发挥抗炎作用。如预期的那样，我们的结果表明ARR不仅抑制iNOS和COX-2 mRNA的表达，而且以剂量依赖的方式降低NO和PGE₂的含量。此外，ARR显著抑制了NF-κB p65的表达。据我们所知，这是第一个证明ARR可通过LPS诱导的RAW264.7细胞通过NF-κB途径抑制NF-κB p65表达的第一个证据。

NLRC3充当检查点，以防止炎症失调。用LPS刺激RAW264.7细胞后，NLRC3分子充当去泛素化酶，以去除TRAF6的泛素化并抑制NF-κB p65亚基的核易位，从而减少IL-1β的释放。根据我们的研究结果，ARR增加了NLRC3的表达，从而抑制了NF-κB途径的激活。

Nrf2信号通路是炎症的另一个重要调节因子。Nrf2及其靶分子如HO-1和NQO1的活化被认为是针对氧化应激和炎症反应的细胞内保护性调节剂。Nrf2的激活可以破坏NF-κB与靶分子之间的串扰，从而控制炎症反应。此外，HO-1和NQO1抑制由NF-κB介导的炎性粘附分子的转录。在这项研究中，我们的结果表明ARR诱导Nrf2并抑制NF-κB的核易位。因此，我们认为ARR诱导的Nrf2激活会阻止由NF-κB介导的炎性细胞因子的增加。

综上所述，我们的研究表明鼠李素-3-O-α-鼠李糖苷（ARR）至少部分地通过调节NF-κB和Nrf2介导的炎症反应，在LPS刺激的RAW264.7细胞中发挥抗炎作用，可以作为活性成分制备广谱抗炎药物。鼠李素-3-O-α-鼠李糖苷ARR为水溶性，制剂可为注射剂。当然，也可以加入其他医学上可接收的辅料制成如片剂、颗粒剂等剂型。