阅读说明：本技术 一种对肿瘤具有杀伤作用的拓扑异构酶i抑制剂 (Topoisomerase I inhibitor with tumor killing effect ) 是由 袁健 耿国河 于 2019-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种对肿瘤具有杀伤作用的拓扑异构酶I抑制剂,通过研究发现(1Z,2E)-1-(甲基亚胺)-4a,5,6,7,8,8a-六氢萘-2(1H)-酮肟(DIA-002)在体内和体外均具有抗肿瘤和诱导DNA损伤的能力,随后的进一步研究发现,DIA-002可以抑制Top1的活性。(The invention provides a topoisomerase I inhibitor with a killing effect on tumors, and researches show that (1Z, 2E) -1- (methylimine) -4a, 5, 6, 7, 8, 8 a-hexahydronaphthalene-2 (1H) -ketoxime (DIA-002) has the capacity of resisting tumors and inducing DNA damage in vivo and in vitro, and further researches show that DIA-002 can inhibit the activity of Top 1.)

一种对肿瘤具有杀伤作用的拓扑异构酶I抑制剂

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种对肿瘤具有杀伤作用的拓扑异构酶I抑制剂。

背景技术

乳腺癌是女性中最常见的癌症，2016年美国大约有246660例新增断病例和40450例死亡病例。三阴性乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性乳腺癌，在所有乳腺癌中三阴性乳腺癌约占15％。TNBC的定义是缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(HER2)的表达和激活。目前，TNBC患者的治疗选择仍然非常有限，因为HER2靶向治疗或激素治疗无效。加上TNBC耐药率高、早期转移，预后较差等，此外，常规化疗仍是TNBC的主要治疗手段但这种疗法毒副作用难以耐受。因此，迫切需要开发新的方法来治疗这种具有挑战性的疾病。

发明内容

针对背景技术中指出的问题，本发明提出一种对肿瘤具有杀伤作用的拓扑异构酶I抑制剂。

对于三阴性乳腺癌(TNBC)的治疗仍然是临床实践中的一大挑战，迫切需要新的治疗方法。本申请中研究发现(1Z，2E)-1-(甲基亚胺)-4a，5，6，7，8，8a-六氢萘-2(1H)-酮肟在体内和体外均具有抗肿瘤和诱导DNA损伤的能力，(下文中的“DIA-002”即代表“(1Z，2E)-1-(甲基亚胺)-4a，5，6，7，8，8a-六氢萘-2(1H)-酮肟”)。随后的进一步研究发现，DIA-002可以抑制Top1的活性，从而达到杀死杀伤肿瘤细胞的效果。

附图说明

图1A为通式(I)；

图1B为DIA-002对多种肿瘤细胞的表现出的抗增殖示意图；

图1C为DIA-002对乳腺癌细胞株增殖的抑制示意图；

图2A使用2μmDIA-002处理MDA-MB-231细胞的示意图；

图2B使用DIA-002处理对了γH2AX、p-chk1和p-chk2的表达的影响；

图2C使用DIA-002处理对Top I cc小点(Foci)形成的影响；

图3A为DIA-002诱导MDA-MB-231细胞发生G2/M细胞周期阻滞的示意图；

图3B使用DIA-002处理对MDA-MB-231细胞pH3染色的影响；

图3C使用DIA-002处理对MDA-MB-231细胞切割的caspase-3表达的影响；

图4A为DIA-002能抑制Top I的活性示图一；

图4B为DIA-002能抑制Top I的活性示图二；

图5A使用DIA-002和喜树碱对MDA-MB-231移植瘤的体积的影响；

图5B使用DIA-002和喜树碱对MDA-MB-231移植瘤的体积的影响；

图5C各组小鼠体重变化示意图。

具体实施方式

下面将结合实验来证明本发明所提供新型I型拓扑异构酶抑制剂抑制拓扑异构酶活性并杀伤肿瘤细胞的效果。

(1)DIA-002抑制包括MDA-MB-231细胞在内的多种肿瘤细胞系的活性。

DIA-002的化学结构如图1A所示。

通过检查DIA-002对2个正常细胞系以及14个肿瘤细胞系中的抗肿瘤作用。

发现，DIA-002对大多数被检测的人类癌细胞系表现出有效的抗增殖作用(图1B)，IC50值如表1所示。

表(1)

克隆形成实验结果进一步证实了DIA-002对乳腺癌细胞株(包括MDA-MB-231、MCF-7、SKBR-3和BT474)增殖的抑制作用(图1C)。

(2)DIA-002诱导MDA-MB-231细胞发生DNA损伤。

通过测定DNA损伤的标志物γH2AX核小点(Foci)的形成情况来评估DIA-002诱导的DNA的损伤程度。结果表明，使用2μmDIA-002处理MDA-MB-231细胞15min的可诱导γH2AX核小点(Foci)的形成，随着处理时间的延长核小点(Foci)逐渐增多，直至1小时达到最高水平，这些核小点(Foci)持续12小时以上(图2A)。

此外，Western Blot结果显示，DIA-002处理显著地提高了γH2AX、p-chk1和p-chk2的表达水平(图2B)。

此外，DIA-002处理还能诱导Top I cc小点(Foci)的形成(图2C)。

这些数据表明，DIA-002处理诱导致MDA-MB-231细胞发生DNA损伤。

(3)DIA-002诱导MDA-MB-231细胞发生G2/M细胞周期阻滞以及凋亡。

由于DIA-002对细胞具有杀伤作用以及能够诱导DNA发生损伤，我们进一步研究了其对细胞周期进程和细胞凋亡的影响。通过流式细胞仪分析细胞周期分布，我们发现DIA-002能够诱导MDA-MB-231细胞发生G2/M细胞周期阻滞(图3A)。

此外，DIA-002处理显著减弱了pH3染色(图3B)，这表明DIA-002处理后有丝分裂的细胞明显减少。

Western Blot结果显示DIA-002处理显著增加了切割的caspase-3表达(图3C)，这表明DIA-002诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡。

(4)DIA-002能抑制Top I的活性。

通过将超螺旋PBR322322DNA转化为松弛态的实验，我们研究了DIA-002对Top Ⅰ和Top Ⅱ活性的影响。50、100nm的DIA-002和喜树碱(50μm)对Top I活性有明显的抑制作用(图4A)，

但50、100nm的DIA-002对Top II活性没有明显的抑制作用，阳性对照组的Etoposide对Top II活性有明显的抑制作用(图4B)。

(5)DIA-002对裸鼠移植瘤表现出了抗肿瘤作用。

基于DIA-002的体外抗肿瘤作用，我们进一步检测了DIA-002对种有人的TNBCMDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤的治疗效果，以喜树碱(著名的TOP I抑制剂)作为阳性对照。

如图5A-B所示，DIA-002和喜树碱显著减小MDA-MB-231移植瘤的体积。

此外，各组小鼠体重并没有明显变化(图5C)，这说明所用剂量的DIA-002对小鼠无严重的系统毒性。

下面介绍上述实验中会使用的材料和方法：

细胞培养和抗体：

乳腺上皮细胞系MCF-10A，正常人成纤维细胞系IMR90，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、SKBR-3、BT474、MCF-7，胰腺癌细胞系BxPC-3、PANC-1,胶质瘤细胞系U251、T98G，非小细胞肺癌细胞系A549，卵巢癌细胞系OVCAR8、OVCAR10、前列腺癌细胞株LNCAP、PC-3和结肠癌细胞株HCT116是从美国美国菌种保藏中心(ATCC，USA)购买的。细胞使用含10％胎牛血清的合适培养基培养。

抗CHK1、p-CHK1(SER345)、CHK2、p-CHK2(THR68)和Caspase-3的抗体从CellSignaling Inc.购买。抗γH2AX(05-636)的抗体从Millipore购买。抗β-actin抗体购自Sigma。从Santa Cruz购买了抗小鼠(SC-2748)和兔(SC-2750)的辣根过氧化物酶结合二级抗体。

细胞毒性和克隆生存试验：

以每孔4000个细胞的数量将细胞接种到96孔板中。24小时后，用不同浓度的DIA-002处理细胞72小时。然后，根据制造商的说明(Promega)，用MTS检测细胞活力。简单地说，每孔加入20毫升MTS，3小时后，用微孔板阅读器(Tecan Infinite M1000 Pro)测量在490nm处的吸光度。

在六孔板中铺上500个细胞，用指示的DIA-002浓度处理细胞。10天后，用PBS洗涤细胞，甲醇固定，0.1％结晶紫染色，计数菌落数。

蛋白印迹法：

使用细胞裂解液(0.5％NP40,50mM Tris,150mMNaCl,and 1mM EDTA(NETN)bufferwith 10mMNaF,50mM β-glycerophosphate,and 1mg/ml aprotinin，1mg/ml pepstatin A)裂解细胞。蛋白通过SDS-PAGE胶分离，然后被转移到PVDF膜上，用合适的一抗和二抗检测蛋白。最后通过用ECL-Western印迹检测试剂(thermofisher)检测蛋白。

免疫荧光检测细胞核小点(Foci)：

细胞接种在盖玻片上。处理后，用PBS洗涤细胞，用3％多聚甲醛固定15分钟，接着用PBS稀释的0.5％Triton-X通透细胞5分钟，室温下用5％山羊血清封闭1小时。然后，在4℃的条件下，将细胞与一级抗体孵育过夜；然后在37℃下与Alexa Fluor 594或Alexa Fluor488结合的二级抗体孵育20分钟。PBS洗涤后，用DAPI对细胞核进行复染。使用共聚焦显微镜检测信号。

细胞周期分析：

收细胞并在-20℃下用70％乙醇固定过夜，然后用PBS洗涤两次。细胞在黑暗中用含RNase的碘化丙啶(PI)染色30分钟，然后用FACS(Beckman Coulter)分析细胞周期。数据通过ModFit LT软件进行分析。

TopI和II介导的DNA松弛实验

根据制造商的使用说明书，使用拓扑异构酶I和II药物筛选试剂盒(Topogen)将超螺旋PBR322 DNA转化为其松弛形式，检测DIA-002对TopI和TopII活性的影响。简单地说，研究Top 1的活性使用了20μl的反应体系，其中包括1μl人源Top1、可变体积的DIA-002(最终浓度：50，100nm)或喜树碱(50μm)、4μl 5×完全分析缓冲液、1μl PBR322DNA和可变体积的水(达到最终体积)。该混合物在37℃下孵育30分钟，然后使用2μl 10％SDS停止反应。然后将样品在1％琼脂糖凝胶(含有0.5μg/ml溴化乙锭)，50V的条件下跑电泳。凝胶在紫外线照射呈像前放在水中。以已知的Top Ⅰ抑制剂—喜树碱作为阳性对照。DIA-002对Top-II活性的影响采用类似于TopI的方法进行。以已知的Top-II抑制剂Etopside作为阳性对照。

体内抗肿瘤研究：

将MDA-MB-231细胞(1×106)悬浮于100μl的PBS中，通过皮下注射到6周龄雌性裸鼠侧腹。肿瘤体积的计算公式为：V＝(L×W2)/2(V，体积；L，长度；W，宽度)。当肿瘤体积约达到120mm3时，随机分为4组(1-4)，每组5只。对照组1腹腔注射PBS0.1ml，2组每4d腹腔注射MDA-MB-2312mg/kg，3组每4d腹腔注射MDA-MB-231 5mg/kg，4组每4d腹腔注射喜树碱5mg/kg。每4天测量一次体重和肿瘤体积。

统计：

所有数据均以平均值±标准差的形式呈现。使用GraphPad 5软件(GraphPadInc.USA)进行统计分析。采用双尾Student’st-tes检验或χ2检验评价各组间的统计学意义。p<0.05为显著性差异。图中统计显著性为：无显著性，*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001。