恩曲替尼在制备病毒抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 恩曲替尼在制备病毒抑制剂中的应用 (Application of enretinib in preparation of virus inhibitor ) 是由 岑山 李泉洁 衣岽戎 于 2020-05-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了恩曲替尼在制备病毒抑制剂中的应用。本发明提供了式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐的应用：在制备病毒抑制剂中的应用；在抑制病毒中的应用。本发明提供了式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐的应用：在制备产品中的应用,所述产品的用途为治疗病毒感染引起的疾病；在治疗病毒感染引起的疾病中的应用。本发明的发明人发现,式(Ⅰ)所示化合物同时与hNV-RdRp和DENV-RdRp具有结合的小分子化合物,进而可以抑制hNV-RdRp和DENV-RdRp活性。式(Ⅰ)所示化合物对多种病毒具有抑制作用,从而可以用作广谱抗病毒制剂。<Image he="344" wi="700" file="DDA0002488265300000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses application of enretinib in preparation of a virus inhibitor. The invention provides a compound shown as a formula (I) or an application of a pharmaceutically acceptable salt thereof: the application in preparing virus inhibitor; the application in inhibiting virus. The invention provides a compound shown as a formula (I) or an application of a pharmaceutically acceptable salt thereof: the application of the product in preparing products for treating diseases caused by virus infection; the application in treating diseases caused by virus infection. The inventor of the invention finds that the compound shown in the formula (I) can be combined with hNV-RdRp and DENV-RdRp simultaneously, and further can inhibit hNV-RdRp and DENV-RdRp activities. The compounds of formula (I) have inhibitory effects on a variety of viruses and are therefore useful as broad-spectrum antiviral agents.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及恩曲替尼的新用途，具体涉及恩曲替尼在制备病毒抑制剂中的应用。
背景技术
各种新型病毒病原体的不断出现给全球公共卫生安全带来了巨大的威胁与挑战。例如，人类诺如病毒(hNV)和登革热病毒(DENV)均具有高度传染性，并且每年在全球范围内流行。诺如病毒是单股正链RNA病毒，属于(+)ssRNA(IV)，属于杯状病毒科，引起非细菌性急性胃肠炎，诺如病毒感染会导致严重的腹泻、呕吐、胃痛，发展中国家每年有多达20万人因为感染诺如病毒而死亡。登革热病毒是黄病毒科黄病毒属的一种单股正链RNA病毒；是一种蚊媒传染病，可引起发烧、皮疹、关节痛以及严重失血性休克；全世界每年大约有3.9亿人感染登革热病毒，其中多达9600万人患病。至今尚未有用于治疗人类诺如病毒和登革热病毒感染疾病的有效药物。目前，大多数抗病毒药物通常以一种特定的病毒为目标，不足以应对各种新兴病毒的爆发。为了快速应对大流行性威胁，迫切需要开发广谱抗病毒药物。
依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)是参与病毒基因组RNA复制的一个关键蛋白因子，是研究广谱抗RNA病毒新型药物的重要靶标。尽管不同病毒家族之间存在序列差异性，但病毒RNA聚合酶的结构却相对保守。RNA聚合酶的形状类似于人的右手，主要由手指、手掌和拇指三个结构域组成。RNA聚合酶中主要存在两种配体结合位点：催化活性位点和各种变构结合位点。核苷类似物(NIs)，例如BCX4430、favipiravir、ribavirin和remdesivir，通过靶向RNA聚合酶的活性位点发挥抗病毒作用。然而，这种抑制机制通常会导致脱靶等副作用。非核苷抑制剂(NNIs)结合到RNA聚合酶的变构位点上，通过阻止转录所需的构象变化来发挥抗病毒活性，通常具有较低的毒性和副作用，在药物开发中收到了广泛关注。到目前为止，大多数正在临床使用或正在进行临床试验的NNIs都是针对丙型肝炎病毒(HCV)开发的，并且具有物种特异性。迫切需要开发广谱的非核苷抑制剂。HCV为有包膜单股正链RNA病毒，(+)ssRNA病毒，属于黄病毒科丙型肝炎病毒属(Flaviviridae hepacivirus)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制病毒，相应的如何治疗病毒感染引起的疾病。
为了解决以上技术问题，本发明提供了恩曲替尼的新用途。
恩曲替尼的结构式见式(Ⅰ)，其CAS号为1108743-60-7。
本发明提供了式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(a)或(b)：
(a)在制备病毒抑制剂中的应用；
(b)在抑制病毒中的应用。
本发明提供了式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(c)或(d)：
(c)在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗病毒感染引起的疾病；
(d)在治疗病毒感染引起的疾病中的应用。
示例性的，所述产品可为药物、疫苗或药物制剂。
所述产品除含有式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。
本发明提供了式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(e)或(f)：
(e)在制备病毒RdRp抑制剂中的应用；
(f)在抑制病毒的RdRp活性中的应用。
本发明还提供了药用化合物，其特征在于：所述药用化合物的活性成分为式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐。
所述药用化合物用于抑制病毒和/或治疗病毒感染引起的疾病和/或抑制病毒的RdRp活性。
本发明还提供了抑制病毒感染动物的方法，包括如下步骤：给受体动物施用式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐以抑制病毒感染动物。
本发明还提供了治疗病毒感染引起的疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用式(Ⅰ)所示化合物或其在药学上可接受的盐以治疗病毒感染引起的疾病。
以上任一所述病毒为单股正链RNA病毒。
以上任一所述病毒为具有RdRp的病毒。
以上任一所述病毒为杯状病毒科的病毒或黄病毒科的病毒。
所述杯状病毒科的病毒为诺如病毒，例如人类诺如病毒或鼠诺如病毒。
所述黄病毒科的病毒为黄病毒属的病毒或丙型肝炎病毒属的病毒。
以上任一所述病毒为诺如病毒(例如人类诺如病毒或鼠诺如病毒)、登革热病毒或丙型肝炎病毒。
本发明中，所述抑制病毒也可称为抗病毒。
RdRp的全称为依赖于RNA的RNA聚合酶。
hNV-RdRp如序列表的序列1所示。
DNEV-RdRp如序列表的序列3所示。
恩曲替尼通过靶向RNA依赖的RNA聚合酶发挥广谱抗病毒作用。
本发明中，所述动物可为哺乳动物，如人；所述动物还可为除哺乳动物以外的所述病毒感染的其他动物，如鼠。
本发明中，术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge,et al.,J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。
本发明的发明人发现，式(Ⅰ)所示化合物同时与hNV-RdRp和DENV-RdRp具有结合的小分子化合物(结合位点位于hNV-RdRp以及DENV-RdRp的共有的变构位点)，进而可以抑制hNV-RdRp和DENV-RdRp活性。式(Ⅰ)所示化合物对多种病毒具有抑制作用，从而可以用作广谱抗病毒制剂。本发明对于抗病毒具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例2中的蛋白电泳图。
图2为实施例3的结果图。
图3为实施例4的结果图。
图4为实施例5的结果图。
图5为实施例6的结果图。
图6为实施例7中RNA抑制率的结果图。
图7为实施例7中正链RNA的相对丰度和负链RNA的相对丰度的结果图。
图8为实施例8的结果图。
图9为实施例9的结果图。
图10为实施例10的结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。如无特殊说明，下述实施例中的实验方法，均为本领域技术人员公知的常规方法或按照厂商所建议的方法。如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)测量。
化合物RAI-13，CAS号为1108743-60-7，中文名称为恩曲替尼，英文名称为Entrectinib，结构式见式(Ⅰ)，属于小分子化合物。
人类诺如病毒的RdRp，用hNV-RdRp表示。
登革热病毒的RdRp，用DENV-RdRp表示。
实施例1、初步筛选化合物
HCV的RNA聚合酶结构中存在五个变构位点：拇指位点I，拇指位点II，手掌位点I，手掌位点II和手掌位点β。HCV的RNA聚合酶结构中的手掌位点I在结构上等同于DENV的RNA聚合酶结构中的变构位点N-Pocket。HCV的RNA聚合酶结构中的手掌位点I位于拇指/手掌区域，被β-hairpin loop环绕。DENV的RNA聚合酶结构中的N-Pocket位于拇指和手掌结构域交界处，并与priming loop相邻。DENV的RNA聚合酶结构中的priming loop与HCV的RNA聚合酶结构中的β-hairpin loop具有相似的生物学功能。hNV的RNA聚合酶结构中的PPNDS的结合位点(B-site)在结构上与HCV的RNA聚合酶结构中的手掌位点I大致相同。同样，B-site位于hNV的RNA聚合酶结构中的拇指结构域中，被C-terminal所环绕。变构位点B-site在诺如病毒所属的杯状病毒科中高度保守。
本发明的发明人首先借助分子对接手段在分子水平对化合物的结合模式和作用机制进行解释和分析。以DENV-RdRp中的N-Pocket和hNV-RdRp中的B-site为靶点，通过基于结构的虚拟筛选方法在TargetMol活性化合物数据库中搜索小分子化合物(数据库中含有4万种生物活性已知的小分子)。根据计算得到的小分子与靶蛋白的结合自由能数据，初步筛选到256个与DENV-RdRp和hNV-RdR均有较优结合自由能的小分子化合物。最后通过分子对接方法进一步评估小分子与靶蛋白的结合模式。最终获得并购买20种化合物。20种化合物依次用RAI-1至RAI-20表示。
实施例2、hNV和DNEV的RNA依赖的RNA聚合酶的表达与纯化
一、hNV的RNA依赖的RNA聚合酶的表达和纯化
1、将hNV-RdRp DNA(hNV-RdRp DNA即序列表的序列2所示的双链DNA分子，编码序列表的序列1所示的hNV-RdRp)插入pET-21a(+)的BamHⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒，命名为hNV-RdRp重组质粒。
hNV-RdRp重组质粒中，hNV-RdRp DNA的上游连接如下DNA分子“ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCC”，下游连接如下DNA分子“GCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA”，形成融合基因，表达具有His6标签的hNV-RdRp。
2、将hNV-RdRp重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
3、将步骤2得到的重组菌接种于含100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至0D600nm值＝0.6，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mM，然后16℃、200rpm振荡培养18小时。
4、完成步骤3后，在体系中加入溶菌酶和DNase I(溶菌酶在体系中的浓度为0.2mg/ml，DNase I在体系中的浓度为0.02mg/ml)，然后进行超声破碎，然后4℃、12000rpm离心10min，收集上清液。
5、取步骤4得到的上清液，采用Ni-三硝基三乙酸亲和色谱进行纯化。
用缓冲液A洗涤去除非目标蛋白，用缓冲液B洗脱以收集目标蛋白。
缓冲液A：含300mM NaCl、10％(体积比)甘油、2mM DTT、10mM咪唑，余量为PBS缓冲液(pH7.5、10mM)。缓冲液B：含300mM NaCl、10％(体积比)甘油、2mM DTT、500mM咪唑，余量为PBS缓冲液(pH7.5、10mM)。
6、取步骤5得到的溶液，采用尺寸排阻色谱进行纯化。
采用缓冲液C透析并将目的蛋白浓缩至3-5mg/mL，得到hNV-RdRp蛋白溶液。
缓冲液C：含150mM NaCl、2mM DTT，余量为PBS缓冲液(pH7.5、10mM)。
二、DNEV的RNA依赖的RNA聚合酶的表达和纯化
1、将DNEV-RdRp DNA(DNEV-RdRp DNA即序列表的序列4所示的双链DNA分子，编码序列表的序列3所示的DNEV-RdRp)插入pET-21a(+)的BamHⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒，命名为DNEV-RdRp重组质粒。
DNEV-RdRp重组质粒中，DNEV-RdRp DNA的上游连接如下DNA分子“ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCC”，下游连接如下DNA分子“GCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA”，形成融合基因，表达具有His6标签的DNEV-RdRp。
2、将DNEV-RdRp重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
3、将步骤2得到的重组菌接种于含100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至0D600nm值＝0.6，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mM，然后22℃、200rpm振荡培养18小时。
步骤4至6同步骤一的4至6。
得到DNEV-RdRp蛋白溶液。
三、蛋白电泳
hNV-RdRp蛋白溶液和DNEV-RdRp蛋白溶液进行SDS-PAGE，见图1。hNV-RdRp蛋白的预期分子量为57KD，DNEV-RdRp蛋白的预期分子量为70KD。
实施例3、hNV-RdRp抑制剂的筛选
Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料，仅在与双链核酸结合后才发出荧光，且所产生的荧光与双链核酸浓度呈正比。通过使用PicoGreen检测反应体系中形成的双链RNA(dsRNA)含量来评估供试化合物对hNV-RdRp活性的影响。
PicoGreen：Thermo Scientific。PicoGreen用pH7.5的TE缓冲液稀释至200倍体积，得到PicoGreen工作液。
供试化合物：RAI-1至RAI-20。
供试化合物溶于DMSO，得到浓度为10mM的化合物母液。
反应在黑色的96孔板中进行。
试验孔，每孔一个反应体系(25μL)。25μL反应体系由poly(C)RNA(P4903，Sigma-Aldrich)、GTP、0.5μL实施例2制备的hNV-RdRp蛋白溶液(hNV-RdRp蛋白溶液中，蛋白浓度为5mg/mL)、MnCl2、DTT、化合物母液和PBS缓冲液(pH 7.5、10mM)组成。反应体系中各成分的浓度为：40ng/mL poly(C)RNA、25μM GTP、2.5mM MnCl2、5mM DTT、40μM供试化合物。将反应体系30℃孵育30分钟，然后加入EDTA并使其在体系中的浓度为10mM以终止反应，然后每孔加入175μL PicoGreen工作液并避光孵育5分钟，然后采用酶标仪检测荧光强度(激发和发射波长分别为485nm和520nm)。每种供试化合物设置5个复孔。
空白对照孔，用等体积DMSO代替化合物母液，其他同试验孔。该孔有RNA聚合酶但没有抑制剂，测得的值为总聚合酶活性(Total activity)。设置5个复孔。对各孔取平均值，记为meanTA。
阴性对照孔，用等体积灭活(100℃，2min)后的hNV-RdRp蛋白溶液代替hNV-RdRp蛋白溶液，其他同试验孔。该孔的RNA聚合酶没有活性，因此不会有双链RNA合成。设置5个复孔。对各孔取平均值，记为meanNSA。
阳性对照孔，用等摩尔阳性对照化合物代替供试化合物，其他同试验孔。设置5个复孔。阳性对照化合物为PPNDS(现有技术中的hNV-RdRp抑制剂，CAS号为1021868-77-8)。
hNV-RdRp相对活性＝100×「(sample-meanNSA)÷(meanTA-meanNSA)]。
结果见图2。图2中，1至20依次对应RAI-1至RAI-20。对于40μM浓度，RAI-5、RAI-13和RAI-14对hNV-RdRp活性具有的抑制作用。
实施例4、RAI-13对hNV-RdRp的抑制作用具有良好的剂量依赖性
供试化合物为RAI-13。
方法基本同实施例3。
反应体系中，供试化合物的浓度为12.5μM-400μM(2倍梯度)。
抑制率＝100-[100×(sample-meanNSA)÷(meanTA-meanNSA)]。
使用GraphPad 5.0软件计算RAI-13的半最大效应浓度(EC50)。
结果见图3。图3中，横坐标为化合物浓度(μM)以10为底的对数。RAI-13对hNV-RdRp表现出剂量依赖性抑制作用，EC50值为46.88μM。
实施例5、RAI-13对MNV的抑制作用具有良好的剂量依赖性
人诺如病毒很难在体外建立培养体系，鼠诺如病毒(MNV)经常被用来作为模型研究NV生物学特性和致病机理。因此采用鼠诺如病毒来评价化合物的抗诺如病毒活性。
RAW264.7细胞，即RAW 264.7cell line细胞系,American Type CultureCollection(ATCC)，编号为TIB-71。MNV SH1603：从小鼠粪便中分离得到的MNV毒株；记载于如下文献：我国鼠诺如病毒的分离培养及其基因组序列分析，王慧敏等，中国生物制品学杂志，2017年5月第30卷第5期，462-466。
一、细胞培养
1、将RAW264.7细胞接种至12孔板(2×105个细胞/孔)，采用DMEM培养基培养24小时。
2、完成步骤1后，吸弃上清，按MOI＝10的病毒量接种MNV SH1603，然后采用含RAI-13的培养基培养4小时。
3、完成步骤2后，吸弃上清，采用新的含RAI-13的培养基培养48h。
步骤2和步骤3中，RAI-13的浓度相同。
含RAI-13的培养基的制备方法：将RAI-13母液和DMEM培养基混合。RAI-13母液的制备方法：RAI-13溶于DMSO，得到浓度为10mM的RAI-13母液。
试验孔，RAI-13在培养基中的浓度分别设置为：0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM或5μM。每个浓度设置5个复孔。
阴性对照孔，用等体积DMSO代替RAI-13母液。阴性对照孔设置5个复孔。
二、检测
完成步骤一后，收集细胞，提取总RNA，采用一步式SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒，通过qRT-PCR分析确定病毒RNA的水平。
用于检测病毒的引物如下：
5’-CCACTGCTCAGATCACATGC-3’；
5’-TTAGAAAGAAGGCGGCCAGA-3’。
mGAPDH基因作为内参基因。用于检测内参基因的引物如下：
5’-TGCAGTGGCAAAGTGGAGATT-3’；
5’-GTGAGTGGAGTCATACTGGAACATGT-3’。
RNA抑制率＝(阴性对照孔的RNA丰度-试验孔的RNA丰度)÷阴性对照孔的RNA丰度×100％。
结果见图4。图4中，横坐标为化合物浓度(μM)以10为底的对数。RAI-13对MNV表现出剂量依赖性抑制作用，EC50值为1.73μM。
实施例6、对DNEV-RdRp活性的抑制作用
供试化合物：RAI-5、RAI-13和RAI-14。
RAI-5的CAS号：612847-09-3。
RAI-14的CAS号：1033769-28-6。
供试化合物溶于DMSO，得到浓度为10mM的化合物母液。
反应在黑色的96孔板中进行。
试验孔，每孔一个反应体系(25μL)。25μL反应体系由poly(C)RNA(P4903，Sigma-Aldrich)、GTP、5μL实施例2制备的DNEV-RdRp蛋白溶液(DNEV-RdRp蛋白溶液中，蛋白浓度为3mg/mL)、MnCl2、DTT、化合物母液和PBS缓冲液(pH 7.5、10mM)组成。反应体系中各成分的浓度为：40ng/mL poly(C)RNA、50μM GTP、2.5mM MnCl2、5mM DTT、40μM供试化合物。将反应体系30℃孵育30分钟，然后加入EDTA并使其在体系中的浓度为10mM以终止反应，然后每孔加入175μL PicoGreen工作液并避光孵育5分钟，然后采用酶标仪检测荧光强度(激发和发射波长分别为485nm和520nm)。每种供试化合物设置5个复孔。
空白对照孔，用等体积DMSO代替化合物母液，其他同试验孔。该孔有RNA聚合酶但没有抑制剂，测得的值为总聚合酶活性(Total activity)。设置5个复孔。对各孔取平均值，记为meanTA。
阴性对照孔，用等体积灭活(100℃，2min)后的DNEV-RdRp蛋白溶液代替DNEV-RdRp蛋白溶液，其他同试验孔。该孔的RNA聚合酶没有活性，因此不会有双链RNA合成。设置5个复孔。对各孔取平均值，记为meanNSA。
阳性对照孔，用等摩尔阳性对照化合物代替供试化合物，其他同试验孔。设置5个复孔。阳性对照化合物为JF-31-MG46，现有技术中的DENV-RdRp抑制剂。JF-31-MG46：IUPACname:2-{6-methoxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl}acetic acid；美国MolPort公司，货号为MolPort-006-827-314。
DENV-RdRp相对活性＝100×「(sample-meanNSA)÷(meanTA-meanNSA)]。
结果见图5。RAI-13显著抑制DENV-RdRp活性，RAI-5和RAI-14对DENV-RdRp的活性没有影响。
实施例7、RAI-13对DENV-2的抑制作用具有良好的剂量依赖性
DENV-2Tr1751，即DENV-2Tr1751毒株，记载于如下文献：Wang J,Gao N,Chen W,etal；Preparation of Antibodies against Soluble Recombinant Dengue E ProteinsFused with Glutathione's Transferase；Dengue Bulletin-Volume 30,2006。
A549细胞：American Type Culture Collection(ATCC)，编号为CCL-185。
一、细胞培养
1、将A549细胞接种至6孔板(5×105个细胞/孔)，采用DMEM培养基培养24小时。
2、完成步骤1后，吸弃上清，按MOI＝0.1的病毒量接种DENV-2Tr1751，然后采用含RAI-13的培养基培养4小时。
3、完成步骤2后，吸弃上清，采用新的含RAI-13的培养基培养48h。
步骤2和步骤3中，RAI-13的浓度相同。
含RAI-13的培养基的制备方法：将RAI-13母液和DMEM培养基混合。RAI-13母液的制备方法：RAI-13溶于DMSO，得到浓度为10mM的RAI-13母液。
RAI-13在培养基中的浓度分别设置为：0.25μM、0.5μM、1μM、2μM或4μM。每个浓度设置5个复孔。
阴性对照孔，用等体积DMSO代替RAI-13母液。阴性对照设置5个复孔。
二、检测
完成步骤一后，收集细胞，提取总RNA，采用一步式SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒，通过qRT-PCR分析确定病毒RNA的水平。
用于检测病毒的引物如下：
5'-TCATACTCTATGTGCACAGGAAAG-3'；
5'-CGATGAAGCTTGGCCGATAGAACTTCC-3'。
hGAPDH基因作为内参基因。用于检测内参基因的引物如下：
5’-ATCATCCCTGCCTCTACTGG-3’；
5’-GTCAGGTCCACCACTGACAC-3’。
RNA抑制率＝(阴性对照孔的RNA丰度-试验孔的RNA丰度)÷阴性对照孔的RNA丰度×100％。
结果见图6。图6中，横坐标为化合物浓度(μM)以10为底的对数。RAI-13对DENV2表现出剂量依赖性抑制作用，EC50值为2.35μM。
检测DENV-2的正链RNA和负链RNA水平(检测正链时，逆转录反应只加入3’引物,逆转录反应完成后再加入5’引物；检测负链时，逆转录反应只加入5’引物，逆转录反应完成后再加入3’引物)。RAI-13浓度为2μM处理的结果见图7。结果表明，在RAI-13作用下，正链和负链RNA水平均降低了约50％。
以上结果表明，RAI-13通过抑制DENV-RdRp的活性降低了DENV RNA的合成。
实施例8、RAI-13的抗病毒活性与其细胞毒性无关
为了排除由于化合物毒性而产生的非特异性差异，采用细胞计数试剂盒-8(cellCounting Kit-8，CCK-8)评估RAI-13对供试细胞生长的影响。
供试细胞为RAW264.7或A549细胞。
CCK-8是检测细胞增殖、细胞存活和细胞毒性的试剂盒，是一种基于WST-8(水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用快速高灵敏度检测试剂盒，为MTT法的替代方法。试剂盒中采用水溶性四唑盐-WST-8，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅；对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈良好线性关系。
1、将供试细胞接种至96孔板(4×104个细胞/孔)，采用DMEM培养基培养24小时。
2、完成步骤1后，吸弃上清，采用含RAI-13的培养基培养48小时。
RAI-13在培养基中的浓度分别设置为40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM或0.625μM。每个浓度设置5个复孔。
含RAI-13的培养基的制备方法：将RAI-13母液和DMEM培养基混合。RAI-13母液的制备方法：RAI-13溶于DMSO，得到浓度为10mM的RAI-13母液。
空白对照孔，用等体积DMSO代替RAI-13母液。阴性对照设置5个复孔。
3、完成步骤2后，吸弃上清，采用含10％CCK-8试剂的DMEM培养基培养1h。
4、完成步骤3后，在微孔板读数器(Thermo，Varioskan Flash)上记录450nm处每孔的光密度(OD)值。
将空白对照孔的OD450nm记作细胞活力为1。
结果见图8。图8中，横坐标为化合物浓度(μM)以10为底的对数。RAI-13对RAW264.7以及A549细胞的CC50值分别为13.22μM和20.75μM。在10μM以下浓度下，RAI-13对细胞活性均无明显影响。由此说明，该浓度下RAI-13的抗病毒活性与其细胞毒性无关。
实施例9、采用生物膜层光学干涉技术体外测定RAI-13与供试蛋白的结合能力
利用基于光纤生物传感器的生物膜层光学干涉(BioLayer Interferometry,BLI)技术体外测定RAI-13与供试蛋白的结合能力。BLI技术能够实时跟踪生物分子间的相互作用，是研究蛋白质和其它生物分子相互作用的理想选择。
供试蛋白：hNV-RdRp或DNEV-RdRp。用PBS缓冲液作为溶剂，对实施例2制备的蛋白溶液(hNV-RdRp蛋白溶液或DNEV-RdRp蛋白溶液)进行稀释，得到供试蛋白溶液。
取RAI-13，用DMSO溶解，得到浓度为10mM的RAI-13母液，然后用PBS缓冲液稀释，得到各个RAI-13溶液。RAI-13溶液中，RAI-13的浓度分别为3.91μM、7.82μM、15.63μM、31.25μM、62.5μM或125μM。
1、对供试蛋白进行生物素化处理。
将生物素(EZ-LinkTM NHS-LC-LC-Biotin，Cat.#21343,Thermo ScientificTM)与供试蛋白按摩尔比1:1进行混合，室温反应1小时后过脱盐柱(ZebaTM Spin DesaltingColumns，Cat.#89883,Thermo)以除去未反应的生物素，得到生物素化的供试蛋白。
2、由于实验选用Super streptavidin(SSA)生物传感器，实验采用Octet RED96(ForteBio，Inc.，CA，USA)仪器，
(1)第一次检测基线
将SSA传感器浸没在PBS缓冲液中静置120s以达平衡。
(2)将生物素化的供试蛋白孵育到传感器上
将传感器探针移动到生物素化的供试蛋白溶液(蛋白浓度为50μg/ml)中静置600s，使蛋白固定在SSA传感器上。
(3)封闭传感器
将传感器移动到含5μM生物胞素(Biocytin,Cat.#28022,Thermo)的PBS缓冲液中封闭60s。
(4)第二次检测基线
将传感器移动到缓冲溶液中静置120s以达平衡。
(5)结合
将传感器移动到RAI-13溶液中静置60s，获得Kon值；
(6)解离
将传感器移动到缓冲溶液中静置60s，获得Koff值。
上样和检测分开进行。第一块微孔板具有3列，第1列为PBS缓冲液用作第一次检测基线，第2列为生物素化的供试蛋白溶液用于上样，第3列为含5μM生物胞素的PBS缓冲液用于封闭。第2块微孔板具有12列，第1、3、5、7、9、11列为含5％(体积比)DMSO的PBS缓冲液用于第二次检测基线及解离，第2、4、6、8、10、12列为RAI-13溶液(每一列对应一种RAI-13浓度)。
获得动力学曲线。使用ForteBio数据分析软件Data Analysis 9.0分析实验数据。解离速率常数KD＝Koff/Kon。
结果见图9。图9中，横坐标为反应时间(单位为秒)，纵坐标为信号强度(单位为nm)。RAI-13能够与hNV-RdRp以及DENV-RdRp结合，拟合的KD值分别为39.9±3.4μM和166±13.7μM。
实施例10、丙型肝炎病毒(Jc-1-Gluc HCVcc)制备及感染性测定
供试病毒：丙型肝炎病毒(Jc1-Luc HCVcc virus)；记载于如下文献：Human MxBInhibits the Replication of Hepatitis C Virus；Dong-Rong Yi，etc；Journal ofVirology；January 2019Volume 93Issue 1 e01285-18。
Huh7.5.1细胞(Huh7.5.1cells)，记载于如下文献：Human MxB Inhibits theReplication of Hepatitis C Virus；Dong-Rong Yi，etc；Journal of Virology；January2019Volume 93Issue 1e01285-18。
含RAI-13的培养基的制备方法：将RAI-13母液和DMEM培养基混合。RAI-13母液的制备方法：RAI-13溶于DMSO，得到浓度为10mM的RAI-13母液。
1、将Huh7.5.1细胞接种至96孔板(2×104个细胞/孔)，采用DMEM培养基培养24小时。
2、完成步骤1后，吸弃上清，按MOI＝1的病毒量接种供试病毒，采用含1μM RAI-13的培养基培养4小时。
3、完成步骤2后，吸弃上清，采用新的含1μM RAI-13的培养基培养48h。
4、完成步骤3后，使用Centro XS3 LB 960光度计检测Gaussia荧光素酶(Gluc)的活性，从而测量上清液中病毒的感染量。
阴性对照孔，用等体积DMSO代替RAI-13母液。
将阴性对照孔的Gluc活性作为1。
结果见图10(均为5个复孔的平均值)。与阴性对照孔相比，1μM RAI-13对Jc1HCVcc感染的抑制作用超过95％。
以上对本发明进行了详述。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所
<120> 恩曲替尼在制备病毒抑制剂中的应用
<130> GNCYX201205
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> Human norovirus
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<212> DNA
<213> Human norovirus
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