阅读说明：本技术 用于天使人综合征的基因治疗方法的修饰的ube3a基因 (Modified UBE3A gene for use in methods of gene therapy for Angel syndrome ) 是由 凯文·罗恩·纳什 埃德温·约翰·韦贝尔 于 2018-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了治疗以缺陷性UBE3A为特征的神经系统病症的新型载体、组合物和方法。已发现造成天使人综合征(AS)的是UBE3A基因,其编码泛素连接酶E6-AP。该基因的独特特征在于它以神经元特异性方式经历母本印记。在大多数AS病例中,母本遗传的UBE3A基因中存在突变或缺失,但其它病例是母本基因的错误甲基化或单亲源二体的结果。产生具有允许从细胞分泌并被邻近神经元细胞摄取的附加序列的UBE3A蛋白构建体。该UBE3A载体可用于基因疗法,以将功能性E6-AP蛋白赋予到神经元中并拯救疾病病理。(The present invention provides novel vectors, compositions and methods for treating neurological disorders characterized by defective UBE 3A. It has been found that the UBE3A gene, which encodes ubiquitin ligase E6-AP, causes the Angel Syndrome (AS). A unique feature of this gene is that it undergoes maternal imprinting in a neuron-specific manner. In most cases of AS, there is a mutation or deletion in the maternally inherited UBE3A gene, but other cases are the result of either mismethylation of the maternal gene or uniparental disomy. A UBE3A protein construct was generated with additional sequences that allow secretion from the cell and uptake by neighboring neuronal cells. The UBE3A vector can be used in gene therapy to confer a functional E6-AP protein into neurons and rescue disease pathology.)

用于天使人综合征的基因治疗方法的修饰的UBE3A基因

相关申请的交叉引用

本申请是2017年6月28日提交的题为“用于天使人综合征的基因治疗方法的修饰的UBE3A基因(Modified UBE3A Gene for a Gene Therapy Approach for AngelmanSyndrome)”的美国临时专利申请序列号62/525,787的非临时申请并要求其优先权，所述美国临时专利申请的内容特此通过引用并入本公开。

技术领域

本发明涉及天使人综合征(Angelman syndrome)的治疗。更具体来说，本发明提供了用于治疗天使人综合征的治疗方法和组合物。

背景技术

天使人综合征(AS)是一种影响神经元的遗传病症，据估计每15,000例新生儿中约发生1例(Clayton-Smith，英国的天使人综合征临床研究：对82位受影响个体的观察(Clinical research on Angelman syndrome in the United Kingdom:observations on82 affected individuals)，Am J Med Genet.1993年4月1日；46(1):12-5)，但是确诊的AS病例的实际数量可能由于误诊而更大。

天使人综合征是一种连续的损害，其呈现出延迟和降低的智力和发育进展，最明显的是在语言和运动技能方面。具体来说，AS通过以下来界定：很少或没有口头交流，带有一些非口头交流，共济失调，以及包括频繁的发笑和微笑和兴奋动作在内的性情。

更晚期的病例导致严重的智力迟钝、可能难以控制并通常在三岁前或到三岁时开始的癫痫发作、频繁发笑(Nicholls，新见解揭示了基因组印迹中所涉及的复杂机制(Newinsights reveal complex mechanisms involved in genomic imprinting)，Am J HumGenet.1994年5月；54(5):733-40)、小头畸形(miroencephaly)、和EEG异常。在严重的病例中，患者可能不会发展语言或只能使用5-10个词语。运动通常是呆笨的，并且走路通常伴有手摆动和步态僵硬。患者通常有癫痫，尤其是在生命早期，并且患有睡眠呼吸暂停，通常一次只能睡5个小时。他们有社会性并渴望人类接触。在一些病例中，皮肤和眼睛可能几乎没有色素，他们可能具有吮吸和吞咽问题，对热敏感以及对水体迷恋。UBE3A缺陷小鼠中的研究显示出长期突触可塑性的紊乱。目前尚无治愈天使人综合征的方法，并且治疗是姑息治疗。例如，使用抗惊厥药物来减少癫痫发作，并且使用言语和物理疗法来改善语言和运动技能。

基因UBE3A造成AS，并且其独特之处在于它是人类印迹基因的小家族之一。在15号染色体上发现的UBE3A编码E6AP C末端(HECT)蛋白(E6相关蛋白(E6AP))的同源物(Kishino等，UBE3A/E6-AP突变导致天使人综合征(UBE3A/E6-AP mutations cause Angelmansyndrome)，Nat Gen.1997年1月15日；15(1):70-3)。UBE3A在大脑中经历空间限定的母本印记；因此，父本拷贝经由DNA甲基化而沉默(Albrecht等，小鼠天使人综合征基因Ube3a在海马和浦肯野神经元中的印迹表达(Imprinted expression of the murine Angelmansyndrome gene,Ube3a,in hippocampal and Purkinje neurons)，Nat Genet.1997年9月；17(1):75-8)。因而，只有母本拷贝是有活性的，父本染色体对大脑该区域中的神经元的蛋白酶体几乎没有影响。因此，15号染色体中部分的失活、易位或缺失导致失代偿的功能丧失。一些研究表明，不当的E3-AP蛋白水平会改变天使人综合征患者的神经突接触(Tonazzini等，纳米结构衬底上泛素连接酶E3a(Ube3a)缺陷性海马神经元中的神经突接触指导受损(Impaired neurite contract guidance in ubuitin ligase E3a(Ube3a)-deficient hippocampal neurons on nanostructured substrates)，Adv HealthcMater.2016年4月；5(7):850-62)。

天使人综合征的大多数病例(70％)通过合并了UBE3A基因的母本染色体的从15q11-q13的约4Mb的从头缺失而发生(Kaplan等，与15号染色体长臂中的缺失相关的临床异质性：3例新病例的报道及其可能的意义(Clinical heterogeneity associated withdeletions in the long arm of chromosome 15:report of 3 new cases and theirpossible significance)，Am J Med Genet.1987年9月；28(1):45-53)，但也可能由于母本拷贝的异常甲基化阻止了其表达而发生(Buiting等，天使人和普拉德-威利综合征的遗传微缺失定义了人类15号染色体上的印迹中心(Inherited microdeletions in theAngelman and Prader-Willi syndromes define an imprinting centre on humanchromosome 15)，Nat Genet.1995年4月；9(4):395-400；Gabriel等，转基因***产生普拉德-威利和天使人综合征的可遗传染色体缺失小鼠模型(A transgene insertioncreating a heritable chromosome deletion mouse model of Prader-Willi andAngelman syndrome)，Proc Natl Acad Sci U.S.A.1999年8月；96(16):9258-63)，或由于其中遗传了父本基因的两个拷贝的单亲源二体而发生(Knoll等，天使人和普拉德-威利综合征具有共同的15号染色体缺失，但缺失的亲本起源不同(Angelman and Prader-Willisyndromes share a common chromosome 15 deletion but differ in parental originof the deletion)，Am J Med Genet.1989年2月；32(2):285-90；Malcolm等，天使人综合征的单亲源父本二体(Uniparental paternal disomy in Angelman’s syndrome)，Lancet.1991年3月23日；337(8743):694-7)。其余的AS病例通过母本染色体的各种UBE3A突变引起，或者他们被诊断为无遗传原因。12-15UBE3A编码E6相关蛋白(E6-AP)泛素连接酶。E6-AP是E3泛素连接酶，因此它表现出对蛋白质靶标的特异性，所述蛋白质靶标包括肿瘤抑制分子p53(Huibregtse等，细胞蛋白介导p53与16或18型人***瘤病毒的E6癌蛋白的缔合(A cellular protein mediates association of p53 with the E6 oncoprotein ofhuman papillomavirus types 16 or 18)，EMBO J.1991年12月；10(13):4129-35)、酵母DNA修复蛋白Rad23的人类同源物(Kumar等，鉴定到HHR23A是E6相关蛋白介导的泛素化的底物(Identification of HHR23A as a substrate for E6-associated protein-mediatedubiquitination)，J Biol Chem.1999年6月25日；274(26):18785-92)、E6-AP本身、和最近鉴定到的靶标Arc(Nuber等，泛素蛋白连接酶E6相关蛋白(E6-AP)用作其自身底物(Theubiquitin-protein ligase E6-associated protein(E6-AP)serves as its ownsubstrate)，Eur J Biochem.1998年6月15日；254(3):643-9；Greer等，天使人综合征蛋白Ube3A通过将arc泛素化来调节突触的发育(The Angelman Syndrome protein Ube3Aregulates synapse Development by ubiquitinating arc)，Cell.2010年3月5日；140(5):704-16)。

轻度病例可能是由于染色体15q11-13上UBE3A基因的突变所致，该基因编码泛素通路的E6-AP泛素连接酶蛋白，而更严重的病例是由于15号染色体的较大缺失而引起的。通常，海马和小脑中的UBE3A基因损失导致天使人综合征，但单个功能丧失的突变也可能导致该病症。

小鼠和人类AS大脑的解剖显示与正常大脑相比没有重大变化，这表明认知缺陷在本质上可能是生物化学的而不是发育性的(Jiang等，小鼠中天使人泛素连接酶的突变导致细胞质p53增加以及情境学***没有任何变化，从而导致其活性总体下降。在突触后致密物处的CaMKII总量也有减少，表明活性CaMKII的量减少。在Thr³⁰⁵位点处具有阻止磷酸化的点突变的突变小鼠模型与AS小鼠杂交拯救了AS表型，即癫痫发作活动、运动协调性、海马依赖性学***。因此，αCaMKII的出生后表达表明，AS小鼠模型的主要表型是由于出生后的生物化学改变而不是总体发育缺陷引起的(Bayer等，CaM激酶II同种型的发育表达：普遍存在的γ-和δ-CaM激酶II是早期的同种型，并且在发育中的神经系统中含量最高(Developmental expression of the CaM kinase II isoforms:ubiquitousγ-andδ-CaMkinase II are the early isoforms and most abundant in the developing nervoussystem)，Brain Res Mol Brain Res.1999年6月18日；70(1):147-54)。

Ube3a缺陷也与亨廷顿氏病(Huntington's disease)有关(Maheshwari等，亨廷顿氏病小鼠大脑中的Ube3a缺陷增加了总负荷并加速了疾病病理(Deficiency of Ube3a inHuntington’s disease mice brain increases aggregate load and acceleratesdisease pathology)，Hum Mol Genet.2014年12月1日；23(23):6235-45)。

Matentzoglu指出E6-AP具有与激素信号传导相关的非E3活性(Matentzoglu,EP2,724,721 A1)。因此，施用类固醇如雄激素、***和糖皮质激素被用于治疗各种E6-AP病症，包括天使人综合征、自闭症、癫痫、普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome)、***、脆性X综合征和瑞特综合征(Rett syndrome)。Philpot建议使用拓扑异构酶抑制剂对沉默的基因进行去甲基化，从而纠正Ube3A的缺陷(Philpot等,P.G.Pub.US 2013/0317018A1)。然而，本领域中的工作和所提出的疗法，如同使用类固醇时那样，并没有解决潜在的病症，或者在使用去甲基化化合物的情况下可能导致其它病症，例如自闭症。因此，需要的是一种以安全有效的方式解决UBE3A缺陷病症的潜在原因的疗法。

Nash和Weeber(WO 2016/179584)证实，重组腺相关病毒(rAAV)载体可以是在小鼠模型中进行基因递送的有效方法。然而，只有少数神经元被成功地转导并因此表达蛋白质，从而如有效治疗所需要的那样阻止了蛋白质在大脑中的总体分布。因此，需要一种在整个大脑中提供Ube3a蛋白补充的疗法。

发明内容

尽管大多数以严重智力迟钝为特征的人类病症都涉及大脑结构异常，但是没有与AS相关的重大的解剖学变化。已经生成的Ube3a蛋白含有附加的允许Ube3a从细胞分泌的细胞分泌序列和提供被邻近的神经元细胞摄取的细胞摄取序列。这向神经元中提供了功能性E6-AP蛋白，从而拯救了疾病病理。

研究了新型质粒构建体的功效，该构建体含有修饰的Ube3A基因，其具有促进E6-AP分泌的分泌信号和促进E6-AP在邻近细胞中再摄取的细胞穿透肽(CPP)信号。作为AS的基因疗法，这可以使E6-AP在转导到小鼠大脑中后具有更大的总体分布。

因而，使用转录起始序列以及设置在所述转录起始序列下游的UBE构建体来形成UBE3A载体。所述UBE构建体由UBE3A序列、分泌序列和细胞摄取序列形成。UBE3A序列的非限制性实例包括小家鼠(mus musculus)UBE3A，智人(homo sapiens)UBE3A变体1、变体2或变体3。细胞摄取序列的非限制性实例包括穿膜肽(penetratin)、R6W3、HIV TAT、HIV TATk和pVEC。分泌序列的非限制性实例包括胰岛素、GDNF和IgK。

在本发明的一些变化形式中，转录起始序列是巨细胞病毒鸡β肌动蛋白杂合启动子或人类泛素c启动子。本发明任选地包括增强子序列。增强子序列的非限制性实例是巨细胞病毒立即早期增强子序列，其设置于转录起始序列的上游。载体任选地还包括土拨鼠肝炎转录后调控元件。

在变化形式中，将所述载体***质粒例如基于重组腺相关病毒血清型2的质粒中。在特定的变化形式中，基于重组腺相关病毒血清型2的质粒缺乏DNA整合元件。基于重组腺相关病毒血清型2的质粒的非限制性实例是pTR质粒。

在一些变化形式中，分泌序列被设置于UBE3A序列的上游。细胞摄取序列可以设置于UBE3A序列的上游和分泌序列的下游。

还提出了一种治疗以UBE3A缺陷为特征的神经退行性病症如天使人综合征和亨廷顿氏病的方法，所述方法包括向患者的大脑施用治疗有效量的如前所述的UBE3A载体，以纠正UBE3A缺陷。所述载体可以通过注射入大脑中，例如通过海马内或脑室内注射来施用。在一些情况下，所述载体可以双侧注射。示例性剂量可以在约5.55×10¹¹至2.86×10¹²基因组/克脑质量的范围内。

还提供了用于治疗以UBE3A缺陷为特征的神经退行性病症的组合物。所述组合物可以由如上所述的UBE3A载体和药学上可接受的载剂(carrier)组成。在一些情况下，所述药学上可接受的载剂可以是血脑屏障透化剂，例如甘露醇。

附图说明

为了更全面地理解本发明，应参考以下结合附图进行的详细描述，在所述附图中：

图1是抗GFP抗体在来自用含有所指示的信号肽的GFP克隆转染的HEK293细胞的培养基上的斑点印迹。

图2是本发明中使用的小鼠UBE3A载体构建体的图谱。注出了主要基因。

图3是显示从质粒转染的HEK293细胞分泌的E6-AP蛋白的Western印迹。取自用细胞培养基转染的对照细胞的培养基(cnt txn)、取自Ube3a转染细胞的培养基(Ube3a txn)；和取自未转染细胞的培养基(cnt untxn)在丙烯酰胺凝胶和抗E6-AP抗体上电泳。

图4是E6-AP蛋白的染色面积百分比的图。非转基因(Ntg)对照小鼠显示出正常小鼠大脑中的Ube3a表达水平。天使人综合征小鼠(AS)显示出在那些小鼠中的染色水平(又称背景染色)。将AAV4-STUb注射到AS小鼠的侧脑室中显示，与AS小鼠相比，E6-AP蛋白染色水平增加。n＝2。

图5是非转基因小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。GFP(绿色荧光蛋白)是一种不被分泌的胞质蛋白。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图6是非转基因小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像，显示了脑室系统(侧脑室(LV)，第3脑室)的更高放大倍数图像。GFP(绿色荧光蛋白)是一种不被分泌的胞质蛋白。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图7是未经注射的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。

图8是未经注射的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像，显示了脑室系统(侧脑室(LV)，第3脑室)的更高放大倍数图像。

图9是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。在室管膜细胞中可观察到表达，但在紧邻脑室的实质中也观察到染色(用箭头指示)。GFP(绿色荧光蛋白)是一种不被分泌的胞质蛋白。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图10是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像，显示了脑室系统(侧脑室(LV)，第3脑室)的更高放大倍数图像。在室管膜细胞中可观察到表达，但在紧邻脑室的实质中也观察到染色(用箭头指示)。GFP(绿色荧光蛋白)是一种不被分泌的胞质蛋白。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图11是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。AAV4-STUb递送后Ube3a表达的脑室系统(侧脑室(LV))的更高放大倍数图像。在室管膜细胞中可观察到表达，但在紧邻脑室的实质中也观察到染色(用箭头指示)。GFP(绿色荧光蛋白)是一种不被分泌的胞质蛋白。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图12是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。AAV4-STUb递送后Ube3a表达的脑室系统(第3脑室)的更高放大倍数图像。在室管膜细胞中可观察到表达，但在紧邻脑室的实质中也观察到染色(用箭头指示)。GFP(绿色荧光蛋白)是一种不被分泌的胞质蛋白。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图13是用GFP转染的非转基因小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。在AAV4-GFP注射的情况下未观察到表达，仅显示了室管膜和脉络丛细胞的转导。GFP(绿色荧光蛋白)是一种不被分泌的胞质蛋白。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图14是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。AAV4-STUb递送后Ube3a表达的大脑矢状横截面。

图15是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。大脑侧脑室(LV)的矢状横截面显示AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图16是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。大脑中第3脑室(3V)的矢状横截面显示了AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图17是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。大脑侧脑室(LV)内角的矢状横截面显示了AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图18是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。大脑中侧脑室(4V)的矢状横截面显示了AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图19是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。大脑中第四脑室(LV)的矢状横截面显示了AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图20是用AAV4-STUb注射到侧脑室的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。大脑的矢状横截面，AAV4-STUb递送后Ube3a表达的脑室系统在侧脑室(LV)、和(C)第3脑室(3V)上的更高放大倍数图像。

图21是本发明中使用的人类UBE3A载体构建体的图谱。注出了主要基因。

图22是用hSTUb构建体转染的HEK293细胞裂解物的Western印迹。蛋白质用抗E6AP抗体染色。

图23是用具有GDNF信号或胰岛素信号的hSTUb构建体转染的HEK293细胞的抗E6AP抗体的斑点印迹，显示胰岛素信号对于表达和分泌来说作用更好。

图24是使用抗HA标签抗体证实胰岛素信号分泌的斑点印迹。

图25(A)是GFP蛋白的质粒构建体f的图解。

图25(B)是GFP蛋白的凝胶电泳结果的图像。

图25(C)是使用GFP构建体针对不同分泌信号的斑点印迹。将具有分泌信号的构建体转导至细胞培养物中，并各自获得两个克隆。培养所述克隆并收集培养基。

图26(A)是E6-AP蛋白的质粒构建体f的图解。

图26(B)是E6-AP蛋白的凝胶电泳结果的图像。

图26(C)是使用E6-AP构建体针对不同分泌信号的斑点印迹。将具有分泌信号的构建体转导至细胞培养物中，并各自获得两个克隆。培养所述克隆并收集培养基。

图27是显示细胞肽摄取信号在转染的HEK293细胞中诱导神经元对蛋白质的再摄取中的功效的Western印迹。将细胞裂解物添加到HEK293细胞的新细胞培养物中，并经由Western印迹测量温育后这些细胞中的E6-AP浓度。

图28(A)是显示场兴奋性突触后电位的图。Ube3A型式1(hUbev1)、分泌信号和CPPTATk的构建体经由rAAV载体转导到AS小鼠模型中。经由死后电生理学测量鼠类大脑的长期增强作用，并将其与GFP转染的AS模型对照小鼠和野生型对照小鼠进行比较。

图28(B)是显示场兴奋性突触后电位的图。Ube3A型式1(hUbev1)、分泌信号和CPPTATk的构建体经由rAAV载体转导到AS小鼠模型中。经由死后电生理学测量鼠类大脑的长期增强作用，并将其与GFP转染的AS模型对照小鼠和野生型对照小鼠进行比较。

具体实施方式

如本文所用，不带具体数量的指称物包括复数个指称物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“多肽”的指称包括两种或更多种多肽的混合物等。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是本文描述了一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用整体并入本文，以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。应理解，在存在矛盾的程度上，用本公开内容取代所并入的出版物的任何公开内容。

所有数字名称例如pH、温度、时间、浓度和分子量(包括范围)均为近似值，它们在适当时，以1.0或0.1的增量上下变化。应理解，即使并非总是明确指出，所有数字名称之前也都带有术语“约”。还应理解，即使并非总是明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物在本领域中是已知的并且可以代替本文明确指出的试剂。

如本文所用，术语“包含”旨在表示产品、组合物和方法包括所提及的组分或步骤，但不排除其它。当用于定义产品、组合物和方法时，“基本上由……组成”应表示排除具有任何重要意义的其它组分或步骤。因此，基本上由所述组分组成的组合物不排除痕量污染物和药学上可接受的载剂。“由……组成”应表示排除其它组分或步骤的痕量以上的元素。

除非上下文另外明确指出，否则如本说明书和权利要求书中所用的不带具体数量的指称物包括复数个指称物。例如，术语“载体”包括多个载体。

如本文所用，“约”是指近似或接近，并且在所阐述的数值或范围的上下文中是指数值±15％。

如本文所用，“腺相关病毒(AAV)载体”是指可以针对基因疗法中的特定功能进行工程改造的腺相关病毒载体。在一些情况下，AAV可以是重组腺相关病毒载体，称为rAAV。尽管描述了AAV4用于本文，但是可以使用本领域已知的任何合适的AAV，包括但不限于AAV9、AAV5、AAV1和AAV4。

“施用”用于描述将本发明的化合物单独或与其它化合物组合递送到患者的过程。所述组合物可以各种方式施用，包括注射到包括大脑在内的中枢神经系统中，包括但不限于纹状体内，海马内，腹侧被盖区(VTA)注射，大脑内，小脑内，髓质内，黑质内，脑室内，脑池内，颅内，实质内，包括脊髓和脑干；口服；肠胃外(指的是静脉内和动脉内以及其它适当的肠胃外途径)；鞘内；肌肉内；皮下；经直肠；和经鼻等。可以使用本发明化合物的其它施用途径容易地处理这些病状中的每一种，以治疗疾病或病状。

如本文所用，“治疗”是指以下任何一种：症状的缓解、改善、消除和/或稳定化，以及特定病症症状的进展延迟。例如，神经退行性疾病的“治疗”可以包括以下的任何一种或多种：改善和/或消除与神经退行性疾病相关的一种或多种症状，减轻神经退行性疾病的一种或多种症状，使神经退行性疾病的症状稳定化，以及延迟神经退行性疾病的一种或多种症状的进展。

如本文所用，“预防”是指以下任何一种：停止神经退行性疾病的影响，减少神经退行性疾病的影响，减少神经退行性疾病的发生率，减少神经退行性疾病的发展，延迟神经退行性疾病症状的发作，增加神经退行性疾病症状发作的时间，以及降低神经退行性疾病发展的风险。

可以根据用于制备药学上有用的组合物的已知方法来配制本发明的药物组合物。此外，如本文所用，短语“药学上可接受的载剂”是指任何标准药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂可包括稀释剂、佐剂和媒介物，以及植入物载剂，和不与本发明的活性成分反应的惰性、无毒的固体或液体填充剂、稀释剂或囊封材料。实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水和乳剂，例如油/水乳剂。在一些实施方式中，药学上可接受的载剂可以是血脑透化剂，包括但不限于甘露醇。所述载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)，其合适的混合物，和植物油。在本领域技术人员熟知且容易获得的众多来源中描述了制剂。例如，《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)(Martin EW[1995]Easton Pennsylvania,Mack PublishingCompany,第19版)描述了可与本发明结合使用的制剂。

如本文所用，“动物”是指被分类在动物界或后生动物界中的多细胞真核生物。该术语包括但不限于哺乳动物。非限制性实例包括啮齿动物，哺乳动物，水生哺乳动物，家养动物例如狗和猫，农场动物例如绵羊、猪、牛和马，以及人类。在使用术语“动物”的情况下，设想了它也适用于任何动物。

如本文所用，短语“保守取代”是指氨基酸被具有相似特性(例如酸性，碱性，带正电或带负电，极性或非极性)的其它氨基酸取代。以下六组各自包含互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

如本文所用，“保守突变”是指不引起编码氨基酸的改变的核苷酸取代，即简并密码子中冗余序列的改变，或导致保守取代的取代。表1和表2可见密码子冗余的实例。

表1：氨基酸(基于类别)和三联体密码以及冗余的对应编码氨基酸(基于功能组类别)

表2：冗余三联体密码和对应编码氨基酸。

因此，根据表2，密码子UUA的保守突变包括UUG、CUU、CUC、CUA和CUG。

如本文所用，术语“同源”是指与目标序列具有至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性，甚至更优选至少98％的序列同一性的核苷酸序列。核苷酸序列中的变异可以是核苷酸序列中的保守突变，即编码相同氨基酸的三联体密码中的突变，如表2所示。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以改善天使人综合征或其它UBE3A相关病症或其一种或多种症状，预防天使人综合征或其它UBE3A相关病症的进展或导致天使人综合征或其它UBE3A相关病症的消退的疗法(例如治疗剂或载体)的量。根据本发明，合适的单剂量大小是当在合适的时间段内施用一次或多次时能够预防或减轻(减少或消除)患者症状的剂量。本领域技术人员可以基于哺乳动物的体型和施用途径容易地确定用于全身施用的适当的单剂量大小。

如本领域所知，用于获得治疗或预防作用的本发明化合物和组合物的给药取决于患者的情况。本文中患者的给药可以通过单独或单位剂量的本文化合物或组合物或通过组合或预包装或预配制剂量的化合物或组合物来实现。平均40g小鼠的脑重0.416g，160g小鼠的脑重1.02g，250g小鼠的脑重1.802g。平均人类脑重1508g，这可用于指导实现本文所述治疗所需或有用的治疗量。

剂量的非限制性实例包括但不限于：5.55×10¹¹基因组/克脑质量、5.75×10¹¹基因组/克脑质量、5.8×10¹¹基因组/克脑质量、5.9×10¹¹基因组/克脑质量、6.0×10¹¹基因组/克脑质量、6.1×10¹¹基因组/克脑质量、6.2×10¹¹基因组/克脑质量、6.3×10¹¹基因组/克脑质量、6.4×10¹¹基因组/克脑质量、6.5×10¹¹基因组/克脑质量、6.6.×10¹¹基因组/克脑质量、6.7×10¹¹基因组/克脑质量、6.8×10¹¹基因组/克脑质量、6.9×10¹¹基因组/克脑质量、7.0×10¹¹基因组/克脑质量、7.1×10¹¹基因组/克脑质量、7.2×10¹¹基因组/克脑质量、7.3×10¹¹基因组/克脑质量、7.4×10¹¹基因组/克脑质量、7.5×10¹¹基因组/克脑质量、7.6×10¹¹基因组/克脑质量、7.7×10¹¹基因组/克脑质量、7.8×10¹¹基因组/克脑质量、7.9×10¹¹基因组/克脑质量、8.0×10¹¹基因组/克脑质量、8.1×10¹¹基因组/克脑质量、8.2×10¹¹基因组/克脑质量、8.3×10¹¹基因组/克脑质量、8.4×10¹¹基因组/克脑质量、8.5×10¹¹基因组/克脑质量、8.6×10¹¹基因组/克脑质量、8.7×10¹¹基因组/克脑质量、8.8×10¹¹基因组/克脑质量、8.9×10¹¹基因组/克脑质量、9.0×10¹¹基因组/克脑质量、9.1×10¹¹基因组/克脑质量、9.2×10¹¹基因组/克脑质量、9.3×10¹¹基因组/克脑质量、9.4×10¹¹基因组/克脑质量、9.5×10¹¹基因组/克脑质量、9.6×10¹¹基因组/克脑质量、9.7×10¹¹基因组/克脑质量、9.80×10¹¹基因组/克脑质量、1.0×10¹²基因组/克脑质量、1.1×10¹²基因组/克脑质量、1.2×10¹²基因组/克脑质量、1.3×10¹²基因组/克脑质量、1.4×10¹²基因组/克脑质量、1.5×10¹²基因组/克脑质量、1.6×10¹²基因组/克脑质量、1.7×10¹²基因组/克脑质量、1.8×10¹²基因组/克脑质量、1.9×10¹²基因组/克脑质量、2.0×10¹²基因组/克脑质量、2.1×10¹²基因组/克脑质量、2.2×10¹²基因组/克脑质量、2.3×10¹²基因组/克脑质量、2.40×10¹²基因组/克脑质量、2.5×10¹²基因组/克脑质量、2.6×10¹²基因组/克脑质量、2.7×10¹²基因组/克脑质量、2.75×10¹²基因组/克脑质量、2.8×10¹²基因组/克脑质量或2.86×10¹²基因组/克脑质量。

本发明中使用的组合物可以单独施用，或与一种或多种其它用于神经退行性病症，特别是UBE3A缺陷病症的治疗剂组合或共同施用。

如本文所用，“患者”用于描述被施用治疗的动物，优选人类，所述治疗包括使用本发明组合物的预防性治疗。

如本文所用，“神经退行性病症”或“神经退行性疾病”是指其中病症的病因涉及神经元细胞的死亡或功能障碍的任何异常的身体或精神行为或体验。此外，如本文所用的术语“神经退行性疾病”描述了与UBE3A缺陷相关的“神经退行性疾病”。示例性的神经退行性疾病包括天使人综合征、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、肌萎缩性侧索硬化症、自闭症谱系障碍、癫痫、多发性硬化症、普拉德-威利综合征、脆性X综合征、瑞特综合征和皮克氏病(Pick's Disease)。

如本文所用，“UBE3A缺陷”是指UBE3A基因中的突变或缺失。

如本文所用，术语“正常”或“对照”是指被评估为不患有天使人综合征或任何其它神经退行性疾病或任何其它UBE3A缺陷性神经系统病症的样品或细胞或患者。

通常，使用转录起始序列以及设置在所述转录起始序列下游的UBE构建体来形成UBE3A载体。所述UBE构建体由UBE3A序列、分泌序列和细胞摄取序列形成。UBE3A序列的非限制性实例是SEQ ID No:4，SEQ ID No:9，SEQ ID No:14，SEQ ID No:15，SEQ ID NO:17，SEQID No:10的cDNA，SEQ ID No:16的cDNA，或同源序列。DNA序列的变异包括DNA三联体密码中的保守突变，如表1和表2所示。在特定变异中，UBE3A序列是小家鼠UBE3A，智人UBE3A变体1、变体2或变体3。

分泌序列的非限制性实例是SEQ ID No:2，SEQ ID No:5，SEQ ID No:11，SEQ IDNo:12，SEQ ID No:3的cDNA，SEQ ID NO:7的cDNA，SEQ ID NO:18的cDNA，SEQ ID NO:19的cDNA或同源序列，其中DNA序列的变异包括上述保守突变。

细胞摄取序列的非限制性实例是SEQ ID No:6，SEQ ID No.8的cDNA，SEQ ID No:13的cDNA，SEQ ID No:20的cDNA，SEQ ID No:21的cDNA，SEQ ID No:22的cDNA，或同源序列。DNA序列的变异包括上述保守突变。

在本发明的特定变化形式中，分泌序列被设置于UBE3A序列的上游，并且更具体来说，任选地设置于UBE3A序列的上游和分泌序列的下游。其它可能的摄取蛋白包括穿膜肽、TATk、pVEC、转运素、MPG、Pep-1、聚精氨酸、MAP和R6W3。

在本发明的一些变化形式中，转录起始序列是巨细胞病毒鸡β肌动蛋白杂合启动子或人类泛素c启动子。本发明任选地包括增强子序列。所述增强子序列的非限制性实例是巨细胞病毒立即早期增强子序列，其设置于转录起始序列的上游。所述载体任选地还包括土拨鼠肝炎转录后调控元件。所列出的启动子、增强子序列和转录后调控元件是本领域众所周知的。(Garg S.等，杂合巨细胞病毒增强子/鸡β肌动蛋白启动子与土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件一起增强了DNA疫苗的保护功效(The hybrid cytomegalovirus enhancer/chicken beta-actin promotor along with woodchuck hepatitis virusposttranscriptional regulatory element enhances the protective efficacy ofDNA vaccines)，J.Immunol.,2004年7月1日；173(1):550-558；Higashimoto,T.等，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件降低了逆转录病毒载体的通读转录(The woodchuck hepatitisvirus post-transcriptional regulatory element reduces readthroughtranscription from retroviral vectors)，2007年9月；14(17):1298-304；Cooper,A.R.等，剪接介导的内含子缺失的拯救使含有人类泛素C启动子的慢病毒载体中的表达最大化(Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviralvectors containing the human ubiquitin C promoter)，Nucleic Acids Res.,2015年1月；43(1):682-90)。

在变化形式中，将载体***质粒例如基于重组腺相关病毒血清型2的质粒中。在特定的变化形式中，所述基于重组腺相关病毒血清型2的质粒缺乏DNA整合元件。所述基于重组腺相关病毒血清型2的质粒的非限制性实例是pTR质粒。

合成UBE3A载体的方法包括将UBE3A构建体***具有转录起始序列的骨架质粒中。如上所述，TBE3A构建体由UBE3A序列、分泌序列和细胞摄取序列形成。例如，将Ube3a基因克隆并与3'DNA序列(N端具有另外两个肽序列)、信号肽和HIV TAT序列框内融合，然后将其克隆到重组腺相关病毒载体中以表达在AS患者的大脑和脊髓中分泌的E6-AP蛋白。任选地通过用至少一种核酸内切酶切割骨架质粒来***UBE构建体，并且将UBE3A构建体连接至骨架质粒的切割端。

然后将载体任选地***具有抗生素抗性基因的扩增宿主中，并进行对应于抗生素抗性基因的抗生素选择。然后将扩增宿主在含有抗生素选择的培养基中扩增，并收集经扩增的扩增宿主。然后从扩增宿主中分离载体。在本发明的特定变化形式中，抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因，其中对应的抗生素选择是氨苄青霉素。

在一个优选的实施方式中，UBE3A载体由从智人UBE3A基因克隆的cDNA形成，所述cDNA用于形成UBE3A型式1基因(SEQ ID No:9)，其与编码分泌信号肽例如GDNF、胰岛素或IgK的基因融合。在一个优选的实施方式中，使用GDNF。在CMV鸡β肌动蛋白杂合启动子(优选)或人类泛素c启动子下，将构建体***hSTUb载体中。存在土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)以增加表达水平。

然后将UBE3A分泌信号构建体连接至细胞摄取肽(细胞穿透肽或CPP)，例如HIVTAT或HIV TATk(优选)。然后使用实施例2中所述的热激法将人类UBE3A载体转化到扩增宿主如大肠杆菌(E.coli)中。将转化的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的肉汤中扩增以选择载体并收集大量载体。然后可以将治疗有效剂量的载体作为基因疗法施用于患者，以治疗天使人综合征或另一种具有UBE3A缺陷的神经系统病症。所述载体可以经由注射到海马或脑室中来施用，在某些情况下是双侧施用。治疗剂的剂量可以在约5.55×10¹¹至2.86×10¹²基因组/克脑质量的范围内。

实施例1–分泌信号的效率

为了测试分泌信号的功效，将GFP(SEQ ID No:1)(XM 013480425.1)与人类胰岛素、GDNF(SEQ ID No:2)(AB675653.1)或IgK信号肽框内克隆。

ATGGCTCGTC TTTCTTTTGT TTCTCTTCTT TCTCTGTCAC TGCTCTTCGG GCAGCAAGCAGTCAGAGCTC AGAATTACAC CATGGTGAGC AAGGGCGAGG AGCTGTTCAC CGGGGTGGTG CCCATCCTGGTCGAGCTGGA CGGCGACGTA AACGGCCACA AGTTCAGCGT GTCCGGCGAG GGCGAGGGCG ATGCCACCTACGGCAAGGAC TGCCTGAAGT TCATCTGCAC CACCGGCAAG CTGCCCGTGC CCTGGCCCAC CCTCGTGACCACCTTCGGCT ACGGCCTGAT GTGCTTCGCC CGCTACCCCG ACCACATGAA GCAGCACGAC TTCTTCAAGTCCGCCATGCC CGAAGGCTAC GTCCAGGAGC GCACCATCTT CTTCAAGGAC GACGGCAACT ACAAGACCCGCGCCGAGGTG AAGTTCGAGG GCGACACCCT GGTGAACCGC ATCGAGCTGA AGGGCATCGA CTTCAAGGAGGACGGCAACA TCCTGGGGCA CAAGCTGGAG TACAACTACA ACAGCCACAA CGTCTATATC ATGGCCGACAAGCAGAAGAA CGGCATCAAG GTGAACTTCA AGATCCGCCA CAACATCGAG GACGGCAGCG TGCAGCTCGCCGACCACTAC CAGCAGAACA CCCCCATCGG CGACGGCCCC GTGCTGCTGC CCGACAACCA CTACCTGAGCTACCAGTCCG CCCTGAGCAA AGACCCCAAC GAGAAGCGCG ATCACATGGT CCTGCTGGAG TTCGTGACCGCCGCCGGGAT CACTCTCGGC ATGGACGAGC TATACAAGTG GGCGCGCCAC TCGAGACGAA TCACTAGTGAATTCGCGGCC GCCTGCAGGT CGAGGTTTGC AGCAGAGTAG(SEQ ID No:1)，

与基于GDNF的分泌蛋白融合；

ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTC CACACCGCGTCCGCC(SEQ ID No:2)(XM 017009337.2)，其编码

MKLWDVVAVCLVLLHTASA(SEQ ID NO:3)(AAC98782.1)

将构建体***pTR质粒中，并转染到HEK293细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA))中。HEK293细胞在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的达尔伯克改良基本培养基(Dulbecco's ModifiedEssential Medium，DMEM)中在37℃5％CO₂下生长，并在80％汇合下进行传代培养。

使用PEI转染方法将载体(6孔板中，2μg/孔)转染到细胞中。在转染前两天，将细胞以0.5×10⁶个细胞/孔在6孔板中用DMEM培养基传代培养。转染前一晚更换培养基。将无内毒素的dH₂O加热至约80℃，并溶解聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich Co.LLC，密苏里州圣路易斯)。将该溶液冷却至约25℃，并使用氢氧化钠中和该溶液。对于每个转染的孔，将AAV4-STUb载体或阴性对照(仅培养基)以每200μL为2μg的量添加到无血清DMEM中，并将9μL的1μg/μL聚乙烯亚胺添加到每个孔的混合物中。将转染混合物在室温下温育15分钟，然后以210μL/孔的量添加到每个细胞孔中并温育48小时。

从每个培养物孔中收集培养基，并使用窄尖移液管将2μL点样到硝酸纤维素膜上。在样品干燥后，通过向所述膜施加含5％BSA的TBS-T并在室温下温育30分钟至1小时对所述膜进行封闭，接着将所述膜与鸡抗GFP抗体(5μg/mL，Abcam PLC，英国剑桥；#ab13970)一起在BSA/TBS-T中在室温下温育30分钟。将所述膜用TBS-T洗涤3次，每次洗涤5分钟。将所述膜与缀合有HRP的抗鸡HRP缀合物第二抗体(Southern Biotechnology，Thermo FisherScientific,Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆；#6100-05，1/3000)在室温下温育30分钟，接着用TBS-T洗涤所述膜3次，一次15分钟，随后每次洗涤5分钟。将所述膜在室温下用TBS洗涤5分钟，并与发光试剂一起温育1分钟(Millipore,Merck KGaA，特拉华州达姆施塔特；#WBKLS0100)。将所述膜在GE Amersham成像仪600(General Electric，加利福尼亚州费尔菲尔德)上记录，如图1所示。

从图1可以看出，通过与未转染的对照细胞相比观察到，所有三种分泌信号均导致从细胞中释放出带有GFP标签的蛋白。在三种分泌构建体中，IgK构建体显示出最高的分泌水平，但GDNF构建体的克隆2确实类似地显示出带有GFP标签的蛋白的高分泌。

实施例2–小鼠UBE3A载体构建体

使用pTR质粒产生小鼠UBE3A载体构建体。小鼠(小家鼠)UBE3A基因由cDNA(U82122.1)形成；

ATGAAGCGAG CAGCTGCAAA GCATCTAATA GAACGCTACT ACCATCAGTT AACTGAGGGCTGTGGAAATG AGGCCTGCAC GAATGAGTTT TGTGCTTCCT GTCCAACTTT TCTTCGTATG GATAACAATGCAGCAGCTAT TAAAGCCCTT GAGCTTTATA AAATTAATGC AAAACTCTGT GATCCTCATC CCTCCAAGAAAGGAGCAAGC TCAGCTTACC TTGAGAACTC AAAAGGTGCA TCTAACAACT CAGAGATAAA AATGAACAAGAAGGAAGGAA AAGATTTTAA AGATGTGATT TACCTAACTG AAGAGAAAGT ATATGAAATT TATGAATTTTGTAGAGAGAG TGAGGATTAT TCCCCTTTAA TTCGTGTAAT TGGAAGAATA TTTTCTAGTG CTGAGGCACTGGTTCTGAGC TTTCGGAAAG TCAAACAGCA CACAAAGGAG GAATTGAAAT CTCTTCAAGA AAAGGATGAAGACAAGGATG AAGATGAAAA GGAAAAAGCT GCATGTTCTG CTGCTGCTAT GGAAGAAGAC TCAGAAGCATCTTCTTCAAG GATGGGTGAT AGTTCACAGG GAGACAACAA TGTACAAAAA TTAGGTCCTG ATGATGTGACTGTGGATATT GATGCTATTA GAAGGGTCTA CAGCAGTTTG CTCGCTAATG AAAAATTAGA AACTGCCTTCCTGAATGCAC TTGTATATCT GTCACCTAAC GTGGAATGTG ATTTGACATA TCATAATGTG TATACTCGAGATCCTAATTA TCTCAATTTG TTCATTATTG TAATGGAGAA TAGTAATCTC CACAGTCCTG AATATCTGGAAATGGCGTTG CCATTATTTT GCAAAGCTAT GTGTAAGCTA CCCCTTGAAG CTCAAGGAAA ACTGATTAGGCTGTGGTCTA AATACAGTGC TGACCAGATT CGGAGAATGA TGGAAACATT TCAGCAACTT ATTACCTACAAAGTCATAAG CAATGAATTT AATAGCCGAA ATCTAGTGAA TGATGATGAT GCCATTGTTG CTGCTTCAAAGTGTTTGAAA ATGGTTTACT ATGCAAATGT AGTGGGAGGG GATGTGGACA CAAATCATAA TGAGGAAGATGATGAAGAAC CCATACCTGA GTCCAGCGAA TTAACACTTC AGGAGCTTCT GGGAGATGAA AGAAGAAATAAGAAAGGTCC TCGAGTGGAT CCACTAGAAA CCGAACTTGG CGTTAAAACT CTAGACTGTC GAAAACCACTTATCTCCTTT GAAGAATTCA TTAATGAACC ACTGAATGAT GTTCTAGAAA TGGACAAAGA TTATACCTTTTTCAAAGTTG AAACAGAGAA CAAATTCTCT TTTATGACAT GTCCCTTTAT ATTGAATGCT GTCACAAAGAATCTGGGATT ATATTATGAC AATAGAATTC GCATGTACAG TGAAAGAAGA ATCACTGTTC TTTACAGCCTAGTTCAAGGA CAGCAGTTGA ATCCGTATTT GAGACTCAAA GTCAGACGTG ACCATATTAT AGATGATGCACTGGTCCGGC TAGAGATGAT TGCTATGGAA AATCCTGCAG ACTTGAAGAA GCAGTTGTAT GTGGAATTTGAAGGAGAACA AGGAGTAATG AGGGAGGCGT TTCCAAAGAG TTTTTTCAGT TGGGTTGTGG AGGAAATTTTTAATCCAAAT ATTGGTATGT TCACATATGA TGAAGCTACG AAATTATTTT GGTTTAATCC ATCTTCTTTTGAAACTGAGG GTCAGGTTTA CTCTGATTGG CATATCCTGG GTCTGGCTAT TTACAATAAT TGTATACTGGATGTCCATTT TCCCATGGTT GTATACAGGA AGCTAATGGG GAAAAAAGGA ACCTTTCGTG ACTTGGGAGACTCTCACCCA GTTTTATATC AGAGTTTAAA GGATTTATTG GAATATGAAG GGAGTGTGGA AGATGATATGATGATCACTT TCCAGATATC ACAGACAGAT CTTTTTGGTA ACCCAATGAT GTATGATCTA AAAGAAAATGGTGATAAAAT TCCAATTACA AATGAAAACA GGAAGGAATT TGTCAATCTC TATTCAGACT ACATTCTCAATAAATCTGTA GAAAAACAAT TCAAGGCATT TCGCAGAGGT TTTCATATGG TGACTAATGA ATCGCCCTTAAAATACTTAT TCAGACCAGA AGAAATTGAA TTGCTTATAT GTGGAAGCCG GAATCTAGAT TTCCAGGCACTAGAAGAAAC TACAGAGTAT GACGGTGGCT ATACGAGGGA ATCTGTTGTG ATTAGGGAGT TCTGGGAAATTGTTCATTCG TTTACAGATG AACAGAAAAG ACTCTTTCTG CAGTTTACAA CAGGCACAGA CAGAGCACCTGTTGGAGGAC TAGGAAAATT GAAGATGATT ATAGCCAAAA ATGGCCCAGA CACAGAAAGG TTACCTACATCTCATACTTG CTTTAATGTC CTTTTACTTC CGGAATATTC AAGCAAAGAA AAACTTAAAG AGAGATTGTTGAAGGCCATC ACATATGCCA AAGGATTTGG CATGCTGTAA(SEQ ID No:4)(U82122.1)。

将该cDNA亚克隆并测序。将小鼠UBE3A基因(SEQ ID No.4)与编码分泌信号肽GDNF(SEQ ID No.5)和细胞摄取肽HIV TAT序列(SEQ ID No:6)的DNA序列融合。所述分泌信号肽具有DNA序列：

ATG GCC CTG TTG GTG CAC TTC CTA CCC CTG CTG GCC CTG CTT GCC CTC TGGGAG CCC AAA CCC ACC CAG GCT TTT GTC(SEQ ID No:5)(NM 008386.4)，其编码蛋白质序列：

MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFV(SEQ ID No:7)(NP 032412.3)；

而HIV TAT序列是

TAC GGC AGA AAG AAG AGG AGG CAG AGA AGG AGA(SEQ ID No:6)，其编码蛋白质序列：

YGRKKRRQRRR(SEQ ID No:8)(AIW51918.1)。

将与SEQ ID No:5和SEQ ID No:6融合的SEQ ID No:4的构建体序列***pTR质粒中。使用Age I和Xho I核酸内切酶切割质粒，并使用连接酶连接构建体序列。所述载体含有AAV血清型2末端重复序列、CMV-鸡β肌动蛋白杂合启动子和WPRE，如图2所示。重组质粒缺少Rep和Cap元件，限制了质粒整合到宿主DNA中。

然后将载体(AAV4-STUb载体)转化到大肠埃希氏菌(大肠杆菌，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific,Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆；SURE2细胞)中。简言之，将细胞在冰上平衡，并将1pg至500ng的载体加入到大肠杆菌中，并使其温育约1分钟。将细胞在0.1cm比色皿(1.7V，200欧姆)中用BioRad Gene Pulser进行电穿孔。然后将大肠杆菌在培养基中生长60分钟，然后再接种到含有氨苄青霉素(50μg/mL)的琼脂例如ATCC培养基1065(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)上。在含有氨苄青霉素的肉汤中扩增大肠杆菌，以收集大量载体。

实施例3–小鼠UBE3A载体构建体的体外测试

在HEK293细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)中测试了实施例2中产生的构建体的小鼠载体特性。HEK293细胞在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的达尔伯克改良基本培养基(DMEM)中在37℃5％CO₂下生长，并在80％汇合下进行传代培养。

使用PEI转染方法将载体(6孔板中，2μg/孔)转染到细胞中。在转染前两天，将细胞以0.5×10⁶个细胞/孔在6孔板中用DMEM培养基传代培养。转染前一晚更换培养基。将无内毒素的dH₂O加热至80℃，并溶解聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich Co.LLC，密苏里州圣路易斯)。使溶液冷却至约25℃，并使用氢氧化钠中和溶液。对于每个转染孔，将AAV4-STUb载体或阴性对照(仅培养基)以每200μl为2μg的量添加到无血清DMEM中，然后将9μl的1μg/μl聚乙烯亚胺添加到每个孔的混合物中。转染混合物在室温下温育15分钟，然后以210μl/孔的量添加到每个细胞孔中并温育48小时。

从AAV4-STUb载体转染的细胞、仅培养基转染的对照细胞和未转染的对照细胞中收集培养基。对所述培养基进行Western印迹，并用0.4μg/ml的对人类和小鼠E6-AP具有反应性的兔抗E6-AP抗体(A300-351A，Bethyl Labs，德克萨斯州蒙哥马利)染色。用兔缀合辣根过氧化物酶(Southern Biotechnology，Thermo Fisher Scientific,Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行二次缀合。结果通过密度计测量来确定，并显示用AAV4-STUb转染的HEK293细胞将E6-AP蛋白分泌到培养基中，如图3所示。

实施例4–小鼠UBE3A载体构建体的体内测试

转基因小鼠是通过杂交在母本UBE3A(Jiang等，小鼠中天使人泛素连接酶的突变导致细胞质p53增加以及情境学习和长期增强的缺陷(Mutation of the Angelmanubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits ofcontextual learning and long-term potentiation)，Neuron.1998年10月；21(4):799-811；Gustin等，啮齿动物和天使人综合征小鼠模型中Ube3a蛋白表达的组织特异性变异(Tissue-specific variation of Ube3a protein expression in rodents and in amouse model of Angelman syndrome)，Neurobiol Dis.2010年9月；39(3):283-91；Heck等,Ube3a缺陷小鼠的小脑功能分析揭示了新的基因型特异性行为(Analysis ofcerebellar function in Ube3a-deficient mice reveals novel genotype-specificbehaviors)，Hum Mol Genet.2008年7月15日；17(14):2181-9)和GABARB3中具有缺失的小鼠而形成的。小鼠以12小时日光循环笼养并自由进食和进水。用所述载体处理三月龄小鼠。

将小鼠用异氟烷麻醉并放入立体定位装置(仅供小鼠用51725D数字立体定位仪，Stoelting，伊利诺伊州伍德戴尔)中。在颅骨的中间作矢状切口并将周围的皮肤向后推以扩大开口。使用以下坐标来定位左侧和右侧海马：AP 22.7mm，L 62.7mm和V 23.0mm。使用10mL Hamilton注射器，小鼠在各脑半球中接受在10μL 20％甘露醇中浓度为1×10¹²基因组/毫升的AAV4-STUb颗粒(N＝2)或媒介物(10μL 20％甘露醇)的双侧海马内注射。用盐水清洗伤口，并使用Vetbond(NC9286393 Fisher Scientific，宾夕法尼亚州匹兹堡)闭合。对照动物包括未注射的AS小鼠和同窝出生的野生型小鼠(n＝2)。小鼠在干净的空笼中在温暖的加热垫上恢复，然后单独笼养直至处死。在实验过程中监测小鼠。

处理后第30天，通过腹膜内注射市售安乐死溶液

(0.22ml/kg)使小鼠安乐死。对动物实施安乐死后，收集CSF，并用PBS灌注动物并取出大脑。将大脑在4％多聚甲醛溶液中固定过夜，然后在蔗糖溶液中进行低温保护。使用切片机将大脑切成25μm的切片。

大多数重组腺相关病毒载体研究将载体直接注射到实质中，这通常导致有限的细胞转导(Li等，脑室内输注rAAV-1-EGFP导致成年大鼠大脑的多个区域中发生转导：rAAV2和rAAV5载体的比较性研究(Intra-ventricular infusion of rAAV-1-EGFP resulted intransduction in multiple regions of adult rat brain:a comparative study withrAAV2 and rAAV5 vectors)，Brain Res.2006年11月29日；1122(1):1-9)。然而，将分泌信号序列和TAT序列附加于所述Ube3A蛋白允许从转染的细胞分泌HECT蛋白(即UBE3A)并由相邻的神经元摄取所述肽，从而允许注射到离散的部位中以用作对整个大脑中其它部位的蛋白质供应。

使用切片机将被处死小鼠的大脑切片，并使用抗E6-AP抗体(A300-351A，BethylLabs，德克萨斯州蒙哥马利)和生物素化的抗兔第二抗体(Vector Labs#AB-1000)对E6-AP蛋白进行染色。用ABC(Vector Labs)和DAB反应完成染色。将切片固定并使用Zeiss Axio扫描显微镜扫描。使用IAE-NearCYTE图像分析软件(匹兹堡大学Starzl移植研究所，宾夕法尼亚州匹兹堡)对染色面积百分比进行定量。

非转基因(Ntg)对照小鼠显示出正常小鼠大脑中的UBE3a表达水平，其为约40％，如图4所示。相比之下，天使人综合征小鼠(AS)显示Ube3a蛋白染色水平为约25％。将AAV4-STUb载体***AS小鼠的侧脑室显示，所述载体将E6-AP的水平提高至约30-35％。

大脑切片的免疫组织化学分析表明，非转基因小鼠具有较高水平的E6-AP，具有区域特异性染色，如图5和图6所示。如所预期的，在天使人综合征模型小鼠中，E6-AP的染色模式相似，但是E6-AP的水平急剧降低，如图7和图8所示。将小鼠UBE3A载体施用于天使人综合征模型小鼠确实提高了E6-AP的水平，但没有达到非转基因小鼠的水平，如图9和图10所示。对侧脑室的详细分析表明，注射UBE3A载体导致所述载体被室管膜细胞摄取，如图11所示。然而，除了由室管膜细胞摄取UBE3A载体和表达E6-AP外，实质中的相邻细胞也对E6-AP阳性染色，如图中用箭头指示。此外，在更远端位置例如第3脑室中观察到染色，如图12所示。这表明E6-AP正被转染的细胞分泌并被相邻的细胞成功摄取，证实所述构建体可以用于引入E6-AP，并且所述E6-AP构建体可以用作治疗剂来治疗全脑的E6-AP表达缺陷，例如天使人综合征。如图13所示，使用AAV4-GFP载体进行的对照处理未表现出对照蛋白的摄取，因为仅转导了室管膜和脉络丛细胞。

对天使人综合征模型小鼠的冠状横截面的详细分析证实，UBE3A构建体的施用提高了侧脑室中和周围的E6-AP水平，如图14至20所示。

实施例5–人类UBE3A载体构建体

使用pTR质粒产生人类载体构建体。从cDNA(AH005553.1)形成智人UBE3A基因；

GGAGTAGTTT ACTGAGCCAC TAATCTAAAG TTTAATACTG TGAGTGAATA CCAGTGAGTACCTTTGTTAA TGTGGATAAC CAATACTTGG CTATAGGAAG TTTTTTAGTT GTGTGTTTTA TNACACGTATTTGACTTTGT GAATAATTAT GGCTTATAAT GGCTTGTCTG TTGGTATCTA TGTATAGCGT TTACAGTTTCCTTTAAAAAA CATGCATTGA GTTTTTTAAT AGTCCAACCC TTAAAATAAA TGTGTTGTAT GGCCACCTGATCTGACCACT TTCTTTCATG TTGACATCTT TAATTTTAAA ACTGTTTTAT TTAGTGCTTA AATCTTGTTNACAAAATTGT CTTCCTAAGT AATATGTCTA CCTTTTTTTT TGGAATATGG AATATTTTGC TAACTGTTTCTCAATTGCAT TTTACAGATC AGGAGAACCT CAGTCTGACG ACATTGAAGC TAGCCGAATG TAAGTGTAACTTGGTTGAGA CTGTGGTTCT TATTTTGAGT TGCCCTAGAC TGCTTTAAAT TACGTCACAT TATTTGGAAATAATTTCTGG TTAAAAGAAA GGAATCATTT AGCAGTAAAT GGGAGATAGG AACATACCTA CTTTTTTTCCTATCAGATAA CTCTAAACCT CGGTAACAGT TTACTAGGTT TCTACTACTA GATAGATAAA TGCACACGCCTAAATTCTTA GTCTTTTTGC TTCCCTGGTA GCAGTTGTAG GGAAATAGGG AGGTTGAGGA AAGAGTTTAACAGTCTCAAC GCCTACCATA TTTAAGGCAT CAAGTACTAT GTTATAGATA CAGAGATGCG TAATAATTAGTTTTCACCCT ACAGAAATTT ATATTATACT CAAGAGTGAA AGATGCAGAA GCAAATAATT TCAGTCACTGAGGTAGAATG GTATCCAAAA 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CTGTGTACTACATCATCGTA TGTAGTTGTT TGCATTTGGG CCAGTTGGTT GGGGCAGGGG TCTTTTTTTC TTTTGTCCCTTAATCTGTAT CACTTTTTCC TCCCAAAGTT GAGTTAAAGG ATGAGTAGAC CAGGAGAATA AAGGAGAAAGGATAAATAAA ATATATACCC AAAGGCACCT GGAGTTAATT TTTCCAAATA TTCATTTCAG TCTTTTTCAATTCATAGGAT TTTGTCTTTT GCTCATTACT GACTGCATAA TGTGATTATA CCATAGTTTA AATAGTCACTTCCTGTTACT ACACACTTGG GTTTTCTCAA TTTTTTACTA TTGTAGTACT AATATTTTAC TATATTGTAATCTAATCCAA ATTTTTACGT ATTCAGAGCT GTTCAGGATA AATTTGCTTG GAAATTTTTA AATCACCAGAAGTGATACTA TCCTGATAAT TAACTTCCAA GTTGTCTCTT AATATAGTTT TAATGCAAAT CATAAGCTTATGTTAGTACC AGTCATAATG AATGCCAAAC TGAAACCAGT ATTGTATTTT TTCTCATTAG GGAGTTCTGGGAAATCGTTC ATTCATTTAC AGATGAACAG AAAAGACTCT TCTTGCAGTT TACAACGGGC ACAGACAGAGCACCTGTGGG AGGACTAGGA AAATTAAAGA TGATTATAGC CAAAAATGGC CCAGACACAG AAAGGTAGGTAATTATTAAC TTGTGACTGT ATACCTACCG AAAACCTTGC ATTCCTCGTC ACATACATAT GAACTGTCTTTATAGTTTCT GAGCACATTC GTGATTTTAT ATACAAATCC CCAAATCATA TTAGACAATT GAGAAAATACTTTGCTGTCA TTGTGTGAGG AAACTTTTAA GAAATTGCCC TAGTTAAAAA TTATTATGGG GCTCACATTGGTTTGGAATC AAATTAGTGT GATTCATTTA CTTTTTTGAT TCCCAGCTTG TTAATTGAAA GCCATATAACATGATCATCT ATTTAGAATG GTTACATTGA GGCTCGGAAG ATTATCATTT GATTGTGCTA GAATCCTGTTATCAAATCAT TTTCTTAGTC ATATTGCCAG CAGTGTTTCT AATAAGCATT TAAGAGCACA CACTTTGCAGTCTTGTAAAA CAGGTTTGAG TATTTTCTCC ACCTTAGAGG AAGTTACTTG ACTTCTCAGT GACCTAACCTCTAAAGTGCA TTTACTGATG TCCTCTCTGT GGTTTTGTTG TGGAAAGATT TAGTTAAATG AACTGTAAGAATTCAGTACC TAAAATGGTA TCTGTTATGT AGTAAAAACT CAATGGATAC AGTATCTTAT CATCGTCACTAGCTTTGAGT AATTTATAGG ATAAAGGCAA CTTGGTAGTT ACACAACAAA AAGTTTATGA TTTGCATTAATGTATAGTTT GCATTGCAGA CCGTCTCAAC TATATACAAT CTAAAAATAG GAGCATTTAA TTCTAAGTGTATTTCCCATG ACTTACAGTT TTCCTGTTTT TTTCCCCTTT TCTCTATTTA GGTTACCTAC ATCTCATACTTGCTTTAATG TGCTTTTACT TCCGGAATAC TCAAGCAAAG AAAAACTTAA AGAGAGATTG TTGAAGGCCATCACGTATGC CAAAGGATTT GGCATGCTGT AAAACAAAAC AAAACAAAAT AAAACAAAAA AAAGGAAGGAAAAAAAAAGA AAAAATTTAA AAAATTTTAA AAATATAACG AGGGATAAAT TTT(SEQ ID No:9)(AH005553.1)，其编码

MKRAAAKHLIERYYHQLTEGCGNEACTNEFCASCPTFLRMDNNAAAIKALELYKINAKLCDPHPSKKGASSAYLENSKGAPNNSCSEIKMNKKGARIDFKDVTYLTEEKVYEILELCREREDYSPLIRVIGRVFSSAEALVQSFRKVKQHTKEELKSLQAKDEDKDEDEKEKAACSAAAMEEDSEASSSRIGDSSQGDNNLQKLGPDDVSVDIDAIRRVYTRLLSNEKIETAFLNALVYLSPNVECDLTYHNVYSRDPNYLNLFIIVMENRNLHSPEYLEMALPLFCKAMSKLPLAAQGKLIRLWSKYNADQIRRMMETFQQLITYKVISNEFNSRNLVNDDDAIVAASKCLKMVYYANVVGGEVDTNHNEEDDEEPIPESSELTLQELLGEERRNKKGPRVDPLETELGVKTLDCRKPLIPFEEFINEPLNEVLEMDKDYTFFKVETENKFSFMTCPFILNAVTKNLGLYYDNRIRMYSERRITVLYSLVQGQQLNPYLRLKVRRDHIIDDALVRLEMIAMENPADLKKQLYVEFEGEQGVDEGGVSKEFFQLVVEEIFNPDIGMFTYDESTKLFWFNPSSFETEGQFTLIGIVLGLAIYNNCILDVHFPMVVYRKLMGKKGTFRDLGDSHPVLYQSLKDLLEYEGNVEDDMMITFQISQTDLFGNPMMYDLKENGDKIPITNENRKEFVNLYSDYILNKSVEKQFKAFRRGFHMVTNESPLKYLFRPEEIELLICGSRNLDFQALEETTEYDGGYTRDSVLIREFWEIVHSFTDEQKRLFLQFTTGTDRAPVGGLGKLKMIIAKNGPDTERLPTSHTCFNVLLLPEYSSKEKLKERLLKAITYAKGFGML(SEQ ID No:10)(NP 570853.1)。

将所述cDNA亚克隆并测序。将UBE3A型式1基因(hUBEv1)(SEQ ID No:9)与编码分泌信号肽的三个基因之一融合，所述三个基因是基于GDNF：

ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTC CACACCGCGTCCGCC(SEQ ID No:2)，

来自胰岛素蛋白；

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCC(SEQ ID No:11)(AH002844.2)，

或来自IgK；

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTG GGTTCCAGGTTCCACTGGT(SEQ IDNo:12)(NG 000834.1)。

在CMV鸡β肌动蛋白杂合启动子或人类泛素c启动子下，将构建体***到hSTUb载体中。存在土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)以增加表达水平。

然后将UBE3A分泌信号构建体连接到细胞摄取肽(细胞穿透肽)；HIV TAT序列

YGRKKRRQRRR(SEQ ID No.8)；或

HIV TATk序列

YARKAARQARA(SEQ ID No.13)。

然后，使用实施例2中所述的热激法，将图21所示的人类UBE3A载体转化到大肠杆菌中。将转化的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的肉汤中扩增以选择载体并收集大量载体。

UBE3A的其它序列包括变体1、2或3，如下所示；

智人UBE3A变体1：

ACAGTATGAC ATCTGATGCT GGAGGGTCGC ACTTTCACAA ATGAGTCAGC TGGTACATGGGGTTATCATC AATTTTTAGC TCTTCTGTCT GGGAGATACA AGTTTGGAAG CAATCTTGGG GTACTTACCCACAAGGCTGG TGGAGACCAG ATCAGGAGAA CCTCAGTCTG ACGACATTGA AGCTAGCCGA ATGAAGCGAGCAGCTGCAAA GCATCTAATA GAACGCTACT ACCACCAGTT AACTGAGGGC TGTGGAAATG AAGCCTGCACGAATGAGTTT TGTGCTTCCT GTCCAACTTT TCTTCGTATG GATAATAATG CAGCAGCTAT TAAAGCCCTCGAGCTTTATA AGATTAATGC AAAACTCTGT GATCCTCATC CCTCCAAGAA AGGAGCAAGC TCAGCTTACCTTGAGAACTC GAAAGGTGCC CCCAACAACT CCTGCTCTGA GATAAAAATG AACAAGAAAG GCGCTAGAATTGATTTTAAA GATGTGACTT ACTTAACAGA AGAGAAGGTA TATGAAATTC TTGAATTATG TAGAGAAAGAGAGGATTATT CCCCTTTAAT CCGTGTTATT GGAAGAGTTT TTTCTAGTGC TGAGGCATTG GTACAGAGCTTCCGGAAAGT TAAACAACAC ACCAAGGAAG AACTGAAATC TCTTCAAGCA AAAGATGAAG ACAAAGATGAGGATGAAAAG GAAAAAGCTG CATGTTCTGC TGCTGCTATG GAAGAAGACT CAGAAGCATC TTCCTCAAGGATAGGTGATA GCTCACAGGG AGACAACAAT TTGCAAAAAT TAGGCCCTGA TGATGTGTCT GTGGATATTGATGCCATTAG AAGGGTCTAC ACCAGATTGC TCTCTAATGA AAAAATTGAA ACTGCCTTTC TCAATGCACTTGTATATTTG TCACCTAACG TGGAATGTGA CTTGACGTAT CACAATGTAT ACTCTCGAGA TCCTAATTATCTGAATTTGT TCATTATCGT AATGGAGAAT AGAAATCTCC ACAGTCCTGA ATATCTGGAA ATGGCTTTGCCATTATTTTG CAAAGCGATG AGCAAGCTAC CCCTTGCAGC CCAAGGAAAA CTGATCAGAC TGTGGTCTAAATACAATGCA GACCAGATTC GGAGAATGAT GGAGACATTT CAGCAACTTA TTACTTATAA AGTCATAAGCAATGAATTTA ACAGTCGAAA TCTAGTGAAT GATGATGATG CCATTGTTGC TGCTTCGAAG TGCTTGAAAATGGTTTACTA TGCAAATGTA GTGGGAGGGG AAGTGGACAC AAATCACAAT GAAGAAGATG ATGAAGAGCCCATCCCTGAG TCCAGCGAGC TGACACTTCA GGAACTTTTG GGAGAAGAAA GAAGAAACAA GAAAGGTCCTCGAGTGGACC CCCTGGAAAC TGAACTTGGT GTTAAAACCC TGGATTGTCG AAAACCACTT ATCCCTTTTGAAGAGTTTAT TAATGAACCA CTGAATGAGG TTCTAGAAAT GGATAAAGAT TATACTTTTT TCAAAGTAGAAACAGAGAAC AAATTCTCTT TTATGACATG TCCCTTTATA TTGAATGCTG TCACAAAGAA TTTGGGATTATATTATGACA ATAGAATTCG CATGTACAGT GAACGAAGAA TCACTGTTCT CTACAGCTTA GTTCAAGGACAGCAGTTGAA TCCATATTTG AGACTCAAAG TTAGACGTGA CCATATCATA GATGATGCAC TTGTCCGGCTAGAGATGATC GCTATGGAAA ATCCTGCAGA CTTGAAGAAG CAGTTGTATG TGGAATTTGA AGGAGAACAAGGAGTTGATG AGGGAGGTGT TTCCAAAGAA TTTTTTCAGC TGGTTGTGGA GGAAATCTTC AATCCAGATATTGGTATGTT CACATACGAT GAATCTACAA AATTGTTTTG GTTTAATCCA TCTTCTTTTG AAACTGAGGGTCAGTTTACT CTGATTGGCA TAGTACTGGG TCTGGCTATT TACAATAACT GTATACTGGA TGTACATTTTCCCATGGTTG TCTACAGGAA GCTAATGGGG AAAAAAGGAA CTTTTCGTGA CTTGGGAGAC TCTCACCCAGTTCTATATCA GAGTTTAAAA GATTTATTGG AGTATGAAGG GAATGTGGAA GATGACATGA TGATCACTTTCCAGATATCA CAGACAGATC TTTTTGGTAA CCCAATGATG TATGATCTAA AGGAAAATGG TGATAAAATTCCAATTACAA ATGAAAACAG GAAGGAATTT GTCAATCTTT ATTCTGACTA CATTCTCAAT AAATCAGTAGAAAAACAGTT CAAGGCTTTT CGGAGAGGTT TTCATATGGT GACCAATGAA TCTCCCTTAA AGTACTTATTCAGACCAGAA GAAATTGAAT TGCTTATATG TGGAAGCCGG AATCTAGATT TCCAAGCACT AGAAGAAACTACAGAATATG ACGGTGGCTA TACCAGGGAC TCTGTTCTGA TTAGGGAGTT CTGGGAAATC GTTCATTCATTTACAGATGA ACAGAAAAGA CTCTTCTTGC AGTTTACAAC GGGCACAGAC AGAGCACCTG TGGGAGGACTAGGAAAATTA AAGATGATTA TAGCCAAAAA TGGCCCAGAC ACAGAAAGGT TACCTACATC TCATACTTGCTTTAATGTGC TTTTACTTCC GGAATACTCA AGCAAAGAAA AACTTAAAGA GAGATTGTTG AAGGCCATCACGTATGCCAA AGGATTTGGC ATGCTGTAAA ACAAAACAAA ACAAAAT(SEQ ID No:14)(AK291405.1)；

智人UBE3A变体2；

AGCCAGTCCT CCCGTCTTGC GCCGCGGCCG CGAGATCCGT GTGTCTCCCA AGATGGTGGCGCTGGGCTCG GGGTGACTAC AGGAGACGAC GGGGCCTTTT CCCTTCGCCA GGACCCGACA CACCAGGCTTCGCTCGCTCG CGCACCCCTC CGCCGCGTAG CCATCCGCCA GCGCGGGCGC CCGCCATCCG CCGCCTACTTACGCTTCACC TCTGCCGACC CGGCGCGCTC GGCTGCGGGC GGCGGCGCCT CCTTCGGCTC CTCCTCGGAATAGCTCGCGG CCTGTAGCCC CTGGCAGGAG GGCCCCTCAG CCCCCCGGTG TGGACAGGCA GCGGCGGCTGGCGACGAACG CCGGGATTTC GGCGGCCCCG GCGCTCCCTT TCCCGGCCTC GTTTTCCGGA TAAGGAAGCGCGGGTCCCGC ATGAGCCCCG GCGGTGGCGG CAGCGAAAGA GAACGAGGCG GTGGCGGGCG GAGGCGGCGGGCGAGGGCGA CTACGACCAG TGAGGCGGCC GCCGCAGCCC AGGCGCGGGG GCGACGACAG GTTAAAAATCTGTAAGAGCC TGATTTTAGA ATTCACCAGC TCCTCAGAAG TTTGGCGAAA TATGAGTTAT TAAGCCTACGCTCAGATCAA GGTAGCAGCT AGACTGGTGT GACAACCTGT TTTTAATCAG TGACTCAAAG CTGTGATCACCCTGATGTCA CCGAATGGCC ACAGCTTGTA AAAGAGAGTT ACAGTGGAGG TAAAAGGAGT GGCTTGCAGGATGGAGAAGC TGCACCAGTG TTATTGGAAA TCAGGAGAAC CTCAGTCTGA CGACATTGAA GCTAGCCGAATGAAGCGAGC AGCTGCAAAG CATCTAATAG AACGCTACTA CCACCAGTTA ACTGAGGGCT GTGGAAATGAAGCCTGCACG AATGAGTTTT GTGCTTCCTG TCCAACTTTT CTTCGTATGG ATAATAATGC AGCAGCTATTAAAGCCCTCG AGCTTTATAA GATTAATGCA AAACTCTGTG ATCCTCATCC CTCCAAGAAA GGAGCAAGCTCAGCTTACCT TGAGAACTCG AAAGGTGCCC CCAACAACTC CTGCTCTGAG ATAAAAATGA ACAAGAAAGGCGCTAGAATT GATTTTAAAG ATGTGACTTA CTTAACAGAA GAGAAGGTAT ATGAAATTCT TGAATTATGTAGAGAAAGAG AGGATTATTC CCCTTTAATC CGTGTTATTG GAAGAGTTTT TTCTAGTGCT GAGGCATTGGTACAGAGCTT CCGGAAAGTT AAACAACACA CCAAGGAAGA ACTGAAATCT CTTCAAGCAA AAGATGAAGACAAAGATGAA GATGAAAAGG AAAAAGCTGC ATGTTCTGCT GCTGCTATGG AAGAAGACTC AGAAGCATCTTCCTCAAGGA TAGGTGATAG CTCACAGGGA GACAACAATT TGCAAAAATT AGGCCCTGAT GATGTGTCTGTGGATATTGA TGCCATTAGA AGGGTCTACA CCAGATTGCT CTCTAATGAA AAAATTGAAA CTGCCTTTCTCAATGCACTT GTATATTTGT CACCTAACGT GGAATGTGAC TTGACGTATC ACAATGTATA CTCTCGAGATCCTAATTATC TGAATTTGTT CATTATCGTA ATGGAGAATA GAAATCTCCA CAGTCCTGAA TATCTGGAAATGGCTTTGCC ATTATTTTGC AAAGCGATGA GCAAGCTACC CCTTGCAGCC CAAGGAAAAC TGATCAGACTGTGGTCTAAA TACAATGCAG ACCAGATTCG GAGAATGATG GAGACATTTC AGCAACTTAT TACTTATAAAGTCATAAGCA ATGAATTTAA CAGTCGAAAT 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GTATGAAGGG AATGTGGAAG ATGACATGATGATCACTTTC CAGATATCAC AGACAGATCT TTTTGGTAAC CCAATGATGT ATGATCTAAA GGAAAATGGTGATAAAATTC CAATTACAAA TGAAAACAGG AAGGAATTTG TCAATCTTTA TTCTGACTAC ATTCTCAATAAATCAGTAGA AAAACAGTTC AAGGCTTTTC GGAGAGGTTT TCATATGGTG ACCAATGAAT CTCCCTTAAAGTACTTATTC AGACCAGAAG AAATTGAATT GCTTATATGT GGAAGCCGGA ATCTAGATTT CCAAGCACTAGAAGAAACTA CAGAATATGA CGGTGGCTAT ACCAGGGACT CTGTTCTGAT TAGGGAGTTC TGGGAAATCGTTCATTCATT TACAGATGAA CAGAAAAGAC TCTTCTTGCA GTTTACAACG GGCACAGACA GAGCACCTGTGGGAGGACTA GGAAAATTAA AGATGATTAT AGCCAAAAAT GGCCCAGACA CAGAAAGGTT ACCTACATCTCATACTTGCT TTAATGTGCT TTTACTTCCG GAATACTCAA GCAAAGAAAA ACTTAAAGAG AGATTGTTGAAGGCCATCAC GTATGCCAAA GGATTTGGCA TGCTGTAAAA CAAAACAAAA CAAAATAAAA CAAAAAAAAGGAAGGAAAAA AAAAGAAAAA ATTTAAAAAA TTTTAAAAAT ATAACGAGGG ATAAATTTTT GGTGGTGATAGTGTCCCAGT ACAAAAAGGC TGTAAGATAG TCAACCACAG TAGTCACCTA TGTCTGTGCC TCCCTTCTTTATTGGGGACA TGTGGGCTGG AACAGCAGAT TTCAGCTACA TATATGAACA AATCCTTTAT TATTATTATAATTATTTTTT TGCGTGAAAG TGTTACATAT TCTTTCACTT GTATGTACAG AGAGGTTTTT CTGAATATTTATTTTAAGGG TTAAATCACT TTTGCTTGTG TTTATTACTG CTTGAGGTTG AGCCTTTTGA GTATTTAAAAAATATATACC AACAGAACTA CTCTCCCAAG GAAAATATTG CCACCATTTG TAGACCACGT AACCTTCAAGTATGTGCTAC TTTTTTGTCC CTGTATCTAA CTCAAATCAG GAACTGTATT TTTTTTAATG ATTTGCTTTTGAAACTTGAA GTCTTGAAAA CAGTGTGATG CAATTACTGC TGTTCTAGCC CCCAAAGAGT TTTCTGTGCAAAATCTTGAG AATCAATCAA TAAAGAAAGA TGGAAGGAAG GGAGAAATTG GAATGTTTTA ACTGCAGCCCTCAGAACTTT AGTAACAGCA CAACAAATTA AAAACAAAAA CAACTCATGC CACAGTATGT CGTCTTCATGTGTCTTGCAA TGAACTGTTT CAGTAGCCAA TCCTCTTTCT TAGTATATGA AAGGACAGGG ATTTTTGTTCTTGTTGTTCT CGTTGTTGTT TTAAGTTTAC TGGGGAAAGT GCATTTGGCC AAATGAAATG GTAGTCAAGCCTATTGCAAC AAAGTTAGGA AGTTTGTTGT TTGTTTATTA TAAACAAAAA GCATGTGAAA GTGCACTTAAGATAGAGTTT TTATTAATTA CTTACTTATT ACCTAGATTT TAAATAGACA ATCCAAAGTC TCCCCTTCGTGTTGCCATCA TCTTGTTGAA TCAGCCATTT TATCGAGGCA CGTGATCAGT GTTGCAACAT AATGAAAAAGATGGCTACTG TGCCTTGTGT TACTTAATCA TACAGTAAGC TGACCTGGAA ATGAATGAAA CTATTACTCCTAAGAATTAC ATTGTATAGC CCCACAGATT AAATTTAATT AATTAATTCA AAACATGTTA AACGTTACTTTCATGTACTA TGGAAAAGTA CAAGTAGGTT TACATTACTG ATTTCCAGAA GTAAGTAGTT TCCCCTTTCCTAGTCTTCTG TGTATGTGAT GTTGTTAATT TCTTTTATTG CATTATAAAA TAAAAGGATT ATGTATTTTTAACTAAGGTG AGACATTGAT ATATCCTTTT GCTACAAGCT ATAGCTAATG TGCTGAGCTT GTGCCTTGGTGATTGATTGA TTGATTGACT GATTGTTTTA ACTGATTACT GTAGATCAAC CTGATGATTT GTTTGTTTGAAATTGGCAGG AAAAATGCAG CTTTCAAATC ATTGGGGGGA GAAAAAGGAT GTCTTTCAGG ATTATTTTAATTAATTTTTT TCATAATTGA GACAGAACTG TTTGTTATGT ACCATAATGC TAAATAAAAC TGTGGCACTTTTCACCATAA TTTAATTTAG TGGAAAAAGA AGACAATGCT TTCCATATTG TGATAAGGTA ACATGGGGTTTTTCTGGGCC AGCCTTTAGA ACACTGTTAG GGTACATACG CTACCTTGAT GAAAGGGACC TTCGTGCAACTGTAGTCATC TTAAAGGCTT CTCATCCACT GTGCTTCTTA ATGTGTAATT AAAGTGAGGA GAAATTAAATACTCTGAGGG CGTTTTATAT AATAAATTCG TGAAGA(SEQ ID No:15)(NM 000462.4)，其编码蛋白质：

MEKLHQCYWK SGEPQSDDIE ASRMKRAAAK HLIERYYHQL TEGCGNEACT NEFCASCPTFLRMDNNAAAI KALELYKINA KLCDPHPSKK GASSAYLENS KGAPNNSCSE IKMNKKGARI DFKDVTYLTEEKVYEILELC REREDYSPLI RVIGRVFSSA EALVQSFRKV KQHTKEELKS LQAKDEDKDE DEKEKAACSAAAMEEDSEAS SSRIGDSSQG DNNLQKLGPD DVSVDIDAIR RVYTRLLSNE KIETAFLNAL VYLSPNVECDLTYHNVYSRD PNYLNLFIIV MENRNLHSPE YLEMALPLFC KAMSKLPLAA QGKLIRLWSK YNADQIRRMMETFQQLITYK VISNEFNSRN LVNDDDAIVA ASKCLKMVYY ANVVGGEVDT NHNEEDDEEP IPESSELTLQELLGEERRNK KGPRVDPLET ELGVKTLDCR KPLIPFEEFI NEPLNEVLEM DKDYTFFKVE TENKFSFMTCPFILNAVTKN LGLYYDNRIR MYSERRITVL YSLVQGQQLN PYLRLKVRRD HIIDDALVRL EMIAMENPADLKKQLYVEFE GEQGVDEGGV SKEFFQLVVE EIFNPDIGMF TYDESTKLFW FNPSSFETEG QFTLIGIVLGLAIYNNCILD VHFPMVVYRK LMGKKGTFRD LGDSHPVLYQ SLKDLLEYEG NVEDDMMITF QISQTDLFGNPMMYDLKENG DKIPITNENR KEFVNLYSDY ILNKSVEKQF KAFRRGFHMV TNESPLKYLF RPEEIELLICGSRNLDFQAL EETTEYDGGY TRDSVLIREF WEIVHSFTDE QKRLFLQFTT GTDRAPVGGL GKLKMIIAKNGPDTERLPTS HTCFNVLLLP EYSSKEKLKE RLLKAITYAK GFGML(SEQ ID No:16)(NP 000453.2)；

智人UBE3A变体3

TTTTTCCGGA TAAGGAAGCG CGGGTCCCGC ATGAGCCCCG GCGGTGGCGG CAGCGAAAGAGAACGAGGCG GTGGCGGGCG GAGGCGGCGG GCGAGGGCGA CTACGACCAG TGAGGCGGCC GCCGCAGCCCAGGCGCGGGG GCGACGACAG GTTAAAAATC TGTAAGAGCC TGATTTTAGA ATTCACCAGC TCCTCAGAAGTTTGGCGAAA TATGAGTTAT TAAGCCTACG CTCAGATCAA GGTAGCAGCT AGACTGGTGT GACAACCTGTTTTTAATCAG TGACTCAAAG CTGTGATCAC CCTGATGTCA CCGAATGGCC ACAGCTTGTA AAAGATCAGGAGAACCTCAG TCTGACGACA TTGAAGCTAG CCGAATGAAG CGAGCAGCTG CAAAGCATCT AATAGAACGCTACTACCACC AGTTAACTGA GGGCTGTGGA AATGAAGCCT GCACGAATGA GTTTTGTGCT TCCTGTCCAACTTTTCTTCG TATGGATAAT AATGCAGCAG CTATTAAAGC CCTCGAGCTT TATAAGATTA ATGCAAAACTCTGTGATCCT CATCCCTCCA AGAAAGGAGC AAGCTCAGCT TACCTTGAGA ACTCGAAAGG TGCCCCCAACAACTCCTGCT CTGAGATAAA AATGAACAAG AAAGGCGCTA GAATTGATTT TAAAGATGTG ACTTACTTAACAGAAGAGAA GGTATATGAA ATTCTTGAAT TATGTAGAGA AAGAGAGGAT TATTCCCCTT TAATCCGTGTTATTGGAAGA GTTTTTTCTA GTGCTGAGGC ATTGGTACAG AGCTTCCGGA AAGTTAAACA ACACACCAAGGAAGAACTGA AATCTCTTCA AGCAAAAGAT GAAGACAAAG ATGAAGATGA AAAGGAAAAA GCTGCATGTTCTGCTGCTGC TATGGAAGAA GACTCAGAGG CATCTTCCTC AAGGATAGGT GATAGCTCAC AGGGAGACAACAATTTGCAA AAATTAGGCC CTGATGATGT GTCTGTGGAT ATTGATGCCA TTAGAAGGGT CTACACCAGATTGCTCTCTA ATGAAAAAAT TGAAACTGCC TTTCTCAATG CACTTGTATA TTTGTCACCT AACGTGGAATGTGACTTGAC GTATCACAAT GTATACTCTC GAGATCCTAA TTATCTGAAT TTGTTCATTA TCGTAATGGAGAATAGAAAT CTCCACAGTC CTGAATATCT GGAAATGGCT TTGCCATTAT TTTGCAAAGC GATGAGCAAGCTACCCCTTG CAGCCCAAGG AAAACTGATC AGACTGTGGT CTAAATACAA TGCAGACCAG ATTCGGAGAATGATGGAGAC ATTTCAGCAA CTTATTACTT ATAAAGTCAT AAGCAATGAA TTTAACAGTC GAAATCTAGTGAATGATGAT GATGCCATTG TTGCTGCTTC GAAGTGCTTG AAAATGGTTT ACTATGCAAA TGTAGTGGGAGGGGAAGTGG ACACAAATCA CAATGAAGAA GATGATGAAG AGCCCATCCC TGAGTCCAGC GAGCTGACACTTCAGGAACT TTTGGGAGAA GAAAGAAGAA ACAAGAAAGG TCCTCGAGTG GACCCCCTGG AAACTGAACTTGGTGTTAAA ACCCTGGATT GTCGAAAACC ACTTATCCCT TTTGAAGAGT TTATTAATGA ACCACTGAATGAGGTTCTAG AAATGGATAA AGATTATACT TTTTTCAAAG TAGAAACAGA GAACAAATTC TCTTTTATGACATGTCCCTT TATATTGAAT GCTGTCACAA AGAATTTGGG ATTATATTAT GACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAACGA AGAATCACTG TTCTCTACAG CTTAGTTCAA GGACAGCAGT TGAATCCATA TTTGAGACTCAAAGTTAGAC GTGACCATAT CATAGATGAT GCACTTGTCC GGCTAGAGAT GATCGCTATG GAAAATCCTGCAGACTTGAA GAAGCAGTTG TATGTGGAAT TTGAAGGAGA ACAAGGAGTT GATGAGGGAG GTGTTTCCAAAGAATTTTTT CAGCTGGTTG TGGAGGAAAT CTTCAATCCA GATATTGGTA TGTTCACATA CGATGAATCTACAAAATTGT TTTGGTTTAA TCCATCTTCT TTTGAAACTG AGGGTCAGTT TACTCTGATT GGCATAGTACTGGGTCTGGC TATTTACAAT AACTGTATAC TGGATGTACA TTTTCCCATG GTTGTCTACA GGAAGCTAATGGGGAAAAAA GGAACTTTTC GTGACTTGGG AGACTCTCAC CCAGTTCTAT ATCAGAGTTT AAAAGATTTATTGGAGTATG AAGGGAATGT GGAAGATGAC ATGATGATCA CTTTCCAGAT ATCACAGACA GATCTTTTTGGTAACCCAAT GATGTATGAT CTAAAGGAAA ATGGTGATAA AATTCCAATT ACAAATGAAA ACAGGAAGGAATTTGTCAAT CTTTATTCTG ACTACATTCT CAATAAATCA GTAGAAAAAC AGTTCAAGGC TTTTCGGAGAGGTTTTCATA TGGTGACCAA TGAATCTCCC TTAAAGTACT TATTCAGACC AGAAGAAATT GAATTGCTTATATGTGGAAG CCGGAATCTA GATTTCCAAG CACTAGAAGA AACTACAGAA TATGACGGTG GCTATACCAGGGACTCTGTT CTGATTAGGG AGTTCTGGGA AATCGTTCAT TCATTTACAG ATGAACAGAA AAGACTCTTCTTGCAGTTTA CAACGGGCAC AGACAGAGCA CCTGTGGGAG GACTAGGAAA ATTAAAGATG ATTATAGCCAAAAATGGCCC AGACACAGAA AGGTTACCTA CATCTCATAC TTGCTTTAAT GTGCTTTTAC TTCCGGAATACTCAAGCAAA GAAAAACTTA AAGAGAGATT GTTGAAGGCC ATCACGTATG CCAAAGGATT TGGCATGCTGTAAAACAAAA CAAAACAAAA TAAAACAAAA AAAAGGAAGG(SEQ ID No:17)(AK292514.1)。

实施例6–人类UBE3A载体构建体的体外测试

在HEK293细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)中测试人类载体特性，所述细胞在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中在37℃5％CO₂下生长，并在80％汇合下传代培养。

使用PEI转染方法将载体(6孔板中，2μg/孔)转染到细胞中。在转染前两天，将细胞以0.5×10⁶个细胞/孔在6孔板中用DMEM培养基传代培养。转染前一晚更换培养基。将无内毒素的dH₂O加热至约80℃，并溶解聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich Co.LLC，密苏里州圣路易斯)。使溶液冷却至约25℃，并使用氢氧化钠中和溶液。对于每个转染孔，将AAV4-STUb载体或阴性对照(仅培养基)以每200μl为2μg的量添加到无血清DMEM中，并且将9μl的1μg/μl聚乙烯亚胺添加到每个孔的混合物中。转染混合物在室温下温育15分钟，然后以210μl/孔的量添加到每个细胞孔中并温育48小时。通过从平板上刮下细胞来收集细胞和培养基。然后将培养基和细胞以5000X g离心5分钟。

对于提取物的Western印迹，将细胞沉淀团重悬于50μL的低渗缓冲液中，并通过3次重复的冷冻/解冻来裂解细胞。将15μL裂解物与Lamelli样品缓冲液一起加热，并在4-20％的BioRad丙烯酰胺凝胶上电泳。使用TransBlot将其转移到硝酸纤维素膜上。用5％的牛奶封闭印迹，并使用抗E6AP抗体检测蛋白质。

如图22所示，用所述构建体转染的细胞表达UBE3A基因，即E6-AP。此外，将该基因附加到各种分泌信号表现出基于所述分泌信号肽的混合结果。例如，使用基于GDNF分泌信号的构建体的转染表现出来自转染细胞的表达较少和没有可检测到的分泌，如图23所示。使用胰岛素分泌信号导致E6AP从转染细胞的中度分泌，以及在所述细胞内所述构建体的高表达。胰岛素信号分泌的结果利用带有HA标签的构建体来证实，如图24所示。

实施例7–分泌肽的功效

通过产生包含各种分泌信号、GFP或人类Ube3A型式1(hUbev1)基因以及CPP TATk的质粒构建体，测量分泌肽在促进神经元对蛋白质的细胞外分泌中的功效，如图25(A)和图26(A)所示。产生GFP以用作体内测试的报告基因，并在未来的AS研究中用作hUbev1的对照。在该实验中测试的分泌信号是GDNF分泌信号、人类胰岛素分泌信号和IgK分泌信号。分泌信号的氨基酸序列如下；

对于胰岛素：MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA(SEQ ID NO:18)(CAA08766.1)；

对于GDNF：MKLWDVVAVCLVLLHTASA(SEQ ID NO:3)；

对于IgK：METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:19)(AAH80787.1)。

产生含有各种分泌信号的质粒构建体，并进行凝胶电泳以证实每个质粒的成功基因***。如图25(B)和图26(B)所示，GFP和hUbev1均成功地整合到质粒中。通过将质粒构建体转染到HEK293细胞中并经由斑点印迹测量培养基中GFP的浓度，来测量所选分泌信号在诱导神经元的肽分泌中的功效。收集来自培养基的提取物，将Xμl置于硝酸纤维素纸上，接着进行免疫染色。结果表明，胰岛素信号导致中等的细胞外蛋白水平，以及在IgK和GDNF信号下导致强至高的细胞外蛋白水平，如图25(C)和图26(C)所示。因此，每种信号都可有效诱导神经元中的肽分泌，并且含有hUbev1/GDNF信号的质粒在诱导E6-AP分泌方面特别有效。

实施例8–细胞穿透肽的功效

通过产生含有分泌信号(GDNF)、hUbev1基因和下述各种CPP信号的质粒构建体，以及将它们转染到HEK293细胞中，来测量所选CPP信号在诱导神经元对蛋白质的再摄取中的功效。

对于穿膜肽：RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:20)；

对于TATk：YARKAARQARA(SEQ ID NO:12)；

对于R6W3：RRWWRRWRR(SEQ ID NO:21)；

对于pVEC：LLIILRRRIRKQAHAHSK(SEQ ID NO:22)。

然后从这些细胞获取细胞裂解物，并将其添加到HEK293细胞的新细胞培养物中，并经由Western印迹测量温育后这些细胞中的E6-AP浓度。CPP信号穿膜肽、TATk、R6RW和pVEC的摄取结果如图27所示。

实施例9–小鼠模型中人类UBE3A载体构建体的体内测试

为了确保被修饰成包括分泌和再摄取信号的Ube3A基因维持其改善与AS相关的认知缺陷的能力，经由rAAV载体将含有人类Ube3A型式1(hUbev1)、分泌信号和CPP TATk的质粒构建体(hSTUb)转导到AS小鼠模型中。经由死后电生理学测量鼠类大脑的长期增强作用，并将其与GFP转染的AS模型对照小鼠和野生型对照小鼠进行比较。结果表明，hSTUb质粒成功地拯救了LTP缺陷，如图28(A)和(B)所示。

实施例10–作为小鼠模型中的基因疗法的人类UBE3A载体构建体

针对分泌和CPP信号肽用于促进E6-AP在神经元中的更大总体分布以用于AS基因疗法中的能力，对分泌和CPP信号肽的潜力进行了分析。hSTUb质粒在小鼠模型中对LTP的拯救表明，在添加分泌和CPP信号后，UBE3A基因在治疗AS认知缺陷中保持了其功效，这支持所述构建体在基因疗法中的潜力。GDNF信号呈现为用于该提议疗法中的最佳信号，因为如由其质粒构建体所示的，GDNF信号显示出转导后E6-AP向培养基中的分泌最多。将细胞裂解物施加到细胞后，CPP信号未能诱导可测量的E6-AP再摄取，这可能是由于若干因素，包括裂解物中E6-AP的浓度不足。

实施例11–预言性人类基因疗法

一个人类孩子表现出严重的发育迟缓，大约在12月龄时会变得明显。后来，孩子表现出无言语，癫痫，肌张力低下，共济失调和小头畸形。孩子的行动具有呆笨的木偶样特性，并且显示出异常快乐的举止，并伴有笑语。孩子具有畸形面部特征，特征在于下巴突出、笑容异常夸张和眼睛深陷。孩子诊断出患有天使人综合征。用治疗有效量的UBE3A载体治疗所述孩子，所述载体被双侧注射到大脑的左和右海马半球中。在治疗后可见症状改善，癫痫发作减少，肌张力增加，肌肉运动协调性增加和言语改善。

UBE3A载体由从智人UBE3A基因克隆的cDNA形成。将UBE3A型式1基因(SEQ ID No:9)与编码分泌信号肽的基因融合，所述分泌信号肽在这种情况下为GDNF，但也可以使用胰岛素或IgK。在CMV鸡β肌动蛋白杂合启动子或人类泛素c启动子下，将构建体***到hSTUb载体中。存在土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)以增加表达水平。

将UBE3A分泌信号构建体连接到细胞摄取肽(细胞穿透肽或CPP)，例如HIV TAT或HIV TATk。然后使用实施例2中所述的热激法将人类UBE3A载体转化到大肠杆菌中。将转化的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的肉汤中扩增以选择载体并收集大量载体。

在前面的说明书中，所公开的所有文件、行为或信息并不意味着承认其任何组合的文件、行为或信息是公开可用的，为公众已知，是本领域常识的一部分，或者在优先权日时已知与解决任何问题相关。

上面引用的所有出版物的公开内容均各自以整体引用的方式明确地并入本文，其程度与各自单独地以引用方式并入的程度相同。

尽管已经描述和说明了治疗UBE3A缺陷的方法的具体实施方式，但是对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的宽泛精神和原理的情况下，可以进行变化和修改。还应理解，以下权利要求书旨在覆盖本文所述的本发明的所有一般和特定特征，以及作为语言问题可以被认为落在本发明的范围之间的所有发明范围陈述。

序列表

<110> 南佛罗里达大学（University of South Florida）

<120> 用于天使人综合征的基因治疗方法的修饰的UBE3A基因

<130> 1372.1166.PRWO

<150> US 62/525,787

<151> 2017-06-28

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 870

<212> DNA

<213> 维多利亚水母（Aequorea victoria）

<400> 1

atggctcgtc tttcttttgt ttctcttctt tctctgtcac tgctcttcgg gcagcaagca 60

gtcagagctc agaattacac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 120

cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 180

ggcgagggcg atgccaccta cggcaaggac tgcctgaagt tcatctgcac caccggcaag 240

ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accttcggct acggcctgat gtgcttcgcc 300

cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 360

gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 420

aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 480

gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 540

atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 600

gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 660

gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc taccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 720

gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 780

atggacgagc tatacaagtg ggcgcgccac tcgagacgaa tcactagtga attcgcggcc 840

gcctgcaggt cgaggtttgc agcagagtag 870

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

atgaagttat gggatgtcgt ggctgtctgc ctggtgctgc tccacaccgc gtccgcc 57

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1 5 10 15

Ala Ser Ala

<210> 4

<211> 2550

<212> DNA

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 4

atgaagcgag cagctgcaaa gcatctaata gaacgctact accatcagtt aactgagggc 60

tgtggaaatg aggcctgcac gaatgagttt tgtgcttcct gtccaacttt tcttcgtatg 120

gataacaatg cagcagctat taaagccctt gagctttata aaattaatgc aaaactctgt 180

gatcctcatc cctccaagaa aggagcaagc tcagcttacc ttgagaactc aaaaggtgca 240

tctaacaact cagagataaa aatgaacaag aaggaaggaa aagattttaa agatgtgatt 300

tacctaactg aagagaaagt atatgaaatt tatgaatttt gtagagagag tgaggattat 360

tcccctttaa ttcgtgtaat tggaagaata ttttctagtg ctgaggcact ggttctgagc 420

tttcggaaag tcaaacagca cacaaaggag gaattgaaat ctcttcaaga aaaggatgaa 480

gacaaggatg aagatgaaaa ggaaaaagct gcatgttctg ctgctgctat ggaagaagac 540

tcagaagcat cttcttcaag gatgggtgat agttcacagg gagacaacaa tgtacaaaaa 600

ttaggtcctg atgatgtgac tgtggatatt gatgctatta gaagggtcta cagcagtttg 660

ctcgctaatg aaaaattaga aactgccttc ctgaatgcac ttgtatatct gtcacctaac 720

gtggaatgtg atttgacata tcataatgtg tatactcgag atcctaatta tctcaatttg 780

ttcattattg taatggagaa tagtaatctc cacagtcctg aatatctgga aatggcgttg 840

ccattatttt gcaaagctat gtgtaagcta ccccttgaag ctcaaggaaa actgattagg 900

ctgtggtcta aatacagtgc tgaccagatt cggagaatga tggaaacatt tcagcaactt 960

attacctaca aagtcataag caatgaattt aatagccgaa atctagtgaa tgatgatgat 1020

gccattgttg ctgcttcaaa gtgtttgaaa atggtttact atgcaaatgt agtgggaggg 1080

gatgtggaca caaatcataa tgaggaagat gatgaagaac ccatacctga gtccagcgaa 1140

ttaacacttc aggagcttct gggagatgaa agaagaaata agaaaggtcc tcgagtggat 1200

ccactagaaa ccgaacttgg cgttaaaact ctagactgtc gaaaaccact tatctccttt 1260

gaagaattca ttaatgaacc actgaatgat gttctagaaa tggacaaaga ttataccttt 1320

ttcaaagttg aaacagagaa caaattctct tttatgacat gtccctttat attgaatgct 1380

gtcacaaaga atctgggatt atattatgac aatagaattc gcatgtacag tgaaagaaga 1440

atcactgttc tttacagcct agttcaagga cagcagttga atccgtattt gagactcaaa 1500

gtcagacgtg accatattat agatgatgca ctggtccggc tagagatgat tgctatggaa 1560

aatcctgcag acttgaagaa gcagttgtat gtggaatttg aaggagaaca aggagtaatg 1620

agggaggcgt ttccaaagag ttttttcagt tgggttgtgg aggaaatttt taatccaaat 1680

attggtatgt tcacatatga tgaagctacg aaattatttt ggtttaatcc atcttctttt 1740

gaaactgagg gtcaggttta ctctgattgg catatcctgg gtctggctat ttacaataat 1800

tgtatactgg atgtccattt tcccatggtt gtatacagga agctaatggg gaaaaaagga 1860

acctttcgtg acttgggaga ctctcaccca gttttatatc agagtttaaa ggatttattg 1920

gaatatgaag ggagtgtgga agatgatatg atgatcactt tccagatatc acagacagat 1980

ctttttggta acccaatgat gtatgatcta aaagaaaatg gtgataaaat tccaattaca 2040

aatgaaaaca ggaaggaatt tgtcaatctc tattcagact acattctcaa taaatctgta 2100

gaaaaacaat tcaaggcatt tcgcagaggt tttcatatgg tgactaatga atcgccctta 2160

aaatacttat tcagaccaga agaaattgaa ttgcttatat gtggaagccg gaatctagat 2220

ttccaggcac tagaagaaac tacagagtat gacggtggct atacgaggga atctgttgtg 2280

attagggagt tctgggaaat tgttcattcg tttacagatg aacagaaaag actctttctg 2340

cagtttacaa caggcacaga cagagcacct gttggaggac taggaaaatt gaagatgatt 2400

atagccaaaa atggcccaga cacagaaagg ttacctacat ctcatacttg ctttaatgtc 2460

cttttacttc cggaatattc aagcaaagaa aaacttaaag agagattgtt gaaggccatc 2520

acatatgcca aaggatttgg catgctgtaa 2550

<210> 5

<211> 78

<212> DNA

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 5

atggccctgt tggtgcactt cctacccctg ctggccctgc ttgccctctg ggagcccaaa 60

cccacccagg cttttgtc 78

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 6

Met Ala Leu Leu Val His Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Glu Pro Lys Pro Thr Gln Ala Phe Val

20 25

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人类免疫缺陷病毒

<400> 7

tacggcagaa agaagaggag gcagagaagg aga 33

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类免疫缺陷病毒

<400> 8

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 10893

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

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<400> 9

ggagtagttt actgagccac taatctaaag tttaatactg tgagtgaata ccagtgagta 60

cctttgttaa tgtggataac caatacttgg ctataggaag ttttttagtt gtgtgtttta 120

tnacacgtat ttgactttgt gaataattat ggcttataat ggcttgtctg ttggtatcta 180

tgtatagcgt ttacagtttc ctttaaaaaa catgcattga gttttttaat agtccaaccc 240

ttaaaataaa tgtgttgtat ggccacctga tctgaccact ttctttcatg ttgacatctt 300

taattttaaa actgttttat ttagtgctta aatcttgttn acaaaattgt cttcctaagt 360

aatatgtcta cctttttttt tggaatatgg aatattttgc taactgtttc tcaattgcat 420

tttacagatc aggagaacct cagtctgacg acattgaagc tagccgaatg taagtgtaac 480

ttggttgaga ctgtggttct tattttgagt tgccctagac tgctttaaat tacgtcacat 540

tatttggaaa taatttctgg ttaaaagaaa ggaatcattt agcagtaaat gggagatagg 600

aacataccta ctttttttcc tatcagataa ctctaaacct cggtaacagt ttactaggtt 660

tctactacta gatagataaa tgcacacgcc taaattctta gtctttttgc ttccctggta 720

gcagttgtag ggaaataggg aggttgagga aagagtttaa cagtctcaac gcctaccata 780

tttaaggcat caagtactat gttatagata cagagatgcg taataattag ttttcaccct 840

acagaaattt atattatact caagagtgaa agatgcagaa gcaaataatt tcagtcactg 900

aggtagaatg gtatccaaaa tacaatagta acatgaagga gtactggagt accaggtatg 960

caataggaat ctagtgtaga tggcagggaa gtaagagtgg ccaggaaatg ctaagttcag 1020

tcttgaaatg tgactgggaa tcaggcagct atcaactata agtcaaatgt ttacaagctg 1080

ttaaaaatga aatactgatt atgtaaaaga aaaccggatt gatgctttaa atagactcat 1140

tttcntaatg ctaattttta aaatgataga atcctacaan tcttagctgt aaaccttgtg 1200

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ccccttttaa accaaaggaa tgtatactct gttaatacag tcagtaagca ttgacattct 1320

ttatcataat atcctagaaa atatttatta actatttcac tagtcaggag ttgtggtaaa 1380

tagtgcatct ccattttcta cttctcatct tcatacacag gttaatcact tcagtgcttg 1440

actaactttt gccttgatga tatgttgagc tttgtacttg agagctgtac taatcactgt 1500

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tactaccacc agttaactga gggctgtgga aatgaagcct gcacgaatga gttttgtgct 1620

tcctgtccaa cttttcttcg tatggataat aatgcagcag ctattaaagc cctcgagctt 1680

tataagatta atgcaaaact ctgtgatcct catccctcca agaaaggagc aagctcagct 1740

taccttgaga actcgaaagg tgcccccaac aactcctgct ctgagataaa aatgaacaag 1800

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tacattttac aggtctaatc attgctaatt agaagcagat catatgccaa aagttcattt 2040

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atttataatt aaagctatac attaatagat atcttgatta taaagaaagt ttaaactcat 2220

gatcttatta agagttatac attgttgaaa gaatgtaaaa gcatgggtga ggtcattggt 2280

ataggtaggt agttcattga aaaaaatagg taagcattaa attttgtttg ctgaatctaa 2340

gtattagata ctttaagagt tgtatatcat aaatgatatt gagcctagaa tgtttggctg 2400

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ccccttgcag cccaaggaaa actgatcaga ctgtggtcta aatacaatgc agaccagatt 3120

cggagaatga tggagacatt tcagcaactt attacttata aagtcataag caatgaattt 3180

aacagtcgaa atctagtgaa tgatgatgat gccattgttg ctgcttcgaa gtgcttgaaa 3240

atggtttact atgcaaatgt agtgggaggg gaagtggaca caaatcacaa tgaagaagat 3300

gatgaagagc ccatccctga gtccagcgag ctgacacttc aggaactttt gggagaagaa 3360

agaagaaaca agaaaggtcc tcgagtggac cccctggaaa ctgaacttgg tgttaaaacc 3420

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gttctagaaa tggataaaga ttatactttt ttcaaagtag aaacagagaa caaattctct 3540

tttatgacat gtccctttat attgaatgct gtcacaaaga atttgggatt atattatgac 3600

aatagaattc gcatgtacag tgaacgaaga atcactgttc tctacagctt agttcaagga 3660

cagcagttga atccatattt gagactcaaa gttagacgtg accatatcat agatgatgca 3720

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gttcagtgaa ttcattttaa aagtgactga aaaaaatgat accatatagc ataggaacac 3840

atggacattt ctgatcttat ataagtatta tacttttgtt gttcctgtgc aagtttatag 3900

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gggttttcta aatcttgaaa actaaatcca aagtttcttt cattcagaag agaatagagt 4020

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agtcttgaac tgggagtaat ggtacagtaa aaccatacca taaaattata ggtagtgtcc 4140

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gtggtaatta atactaagtc ttactgtgag agaccataaa ctgctttagt attcagtgta 4320

tttttcttaa ttgaaatatt taacttatga cttagtagat actaagactt aacccttgag 4380

tttctattct aataaaggac tactaatgaa caattttgag gttagacctc tactccattg 4440

tttttgctga aatgatttag ctgcttttcc atgtcctgtg tagtccagac ttaacacaca 4500

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ttactatgct agtgtctgtt ttgtgtctgt ctttttgatt atctttaaga ctgaatcttt 4620

gtcttcactg gctttttatc agtttgcttt ctgtttccat ttacatacaa aaagtcaaaa 4680

atttgtattt gtttcctaat cctactcctt gtttttattt tgtttttttc ctgatactag 4740

caatcatctt cttttcatgt ttatcttttc aatcactagc tagagatgat cgctatggaa 4800

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gagggaggtg tttccaaaga attttttcag ctggttgtgg aggaaatctt caatccagat 4920

attggtaaat acattagtaa tgtgattatg gtgtcgtatc atcttttgag ttagttattt 4980

gtttatctta ctttgtaaat attttcagct atgaagagca gcaaaagaag gatttggtat 5040

ggattaccca gaatcacaca tcatgactga atttgtaggt tttaggaact gatttgtatc 5100

actaatttat tcaaattctt ttatttctta gaaggaatat tctaatgaag gaaattatct 5160

ctttggtaaa ctgaattgaa agcactttag aatggtatat tggaacagtt ggagggattt 5220

ctttgctttt tgttgtctaa aaccatcatc aaactcacgg ttttcctgac ctgtgaactt 5280

caaagaacaa tggtttgaag agtattgaga gactgtctca caagtatgtc atgctcaaag 5340

ttcagaaaca ctagctgata tcacattaat taggtttatt tgctataaga tttcttgggg 5400

cttaatatan gtagtgttcc cccaaacttt ttgaactcca gaactctttt ctgccctaac 5460

agtagctact caggagctga ggcaggagaa ttgtttgaac ctaggaggca gaggttgcag 5520

tgagctgaga tcgtgccact ccagcccacc cctgggtaac agagcgagac tccatctcaa 5580

agaaaaaaat gaaaaattgt tttcaaaaat agtacgtgtg gtacagatat aagtaattat 5640

atttttataa atgaaacact ttggaaatgt agccattttt tgttttttta tgtttatttt 5700

tcagctatgg gtggataaag catgaatata acttttctta tgtgttagta gaaaattaga 5760

aagcttgaat ttaattaacg tatttttcta cccgatgcca ccaaattact tactacttta 5820

ttcctttggc ttcataaaat tacatatcac cattcacccc aatttatagc agatatatgt 5880

ggacattgtt ttctcaagtg ctaatataat agaaatcaat gttgcatgcc taattacata 5940

tattttaaat gttttatatg cataattatt ttaagtttat atttgtatta ttcatcagtc 6000

cttaataaaa tacaaaagta atgtattttt aaaaatcatt tcttataggt atgttcacat 6060

acgatgaatc tacaaaattg ttttggttta atccatcttc ttttgaaact gagggtcagt 6120

ttactctgat tggcatagta ctgggtctgg ctatttacaa taactgtata ctggatgtac 6180

attttcccat ggttgtctac aggaagctaa tggggaaaaa aggaactttt cgtgacttgg 6240

gagactctca cccagtaagt tctttgtcat ttttttaatt cagtctctta gattttattt 6300

aaatgcaaaa atttaattta tgtcaaaatt ttaaagtttt tgtttagaat ctttgttgat 6360

actcttatca ataagataaa aatgttttaa tctgaccgaa gtaccagaaa cacttaaaaa 6420

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atagagaagt gtttctaaac attttgtttg tgttttagtg aaatcttaag agataggtaa 6540

aaatcagagt agccctggct aagggtcttg gtagttacaa cgagtgtgcc tgctcctacc 6600

acccccaccc ccaccttgag acaccacaga atttctcata gagcacagtg tgaattctat 6660

tgctaaattg gtggtatggg gtttctcagc agagaatggg acatcacagt gactgacaat 6720

ctttctttta taggttggaa actatttggg ggactggagg gatactgtct acacttttta 6780

caatttttat tgataagatt tttgttgtct tctaagaaga gtgatataaa ttatttgttg 6840

tattttgtag ttctatggtg gcctcaattt accatttctg gttgctaggt tctatatcag 6900

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gataaaattc caattacaaa tgaaaacagg aaggtaataa atgtttttat gtcacatttt 7080

gtctcttcat taacactttc aaagcatgta tgcttataat ttttaaagaa gtatctaata 7140

tagtctgtac aaaaaaaaaa caagtaacta agtttatgta aatgctagag tccacttttc 7200

taaatcttgg atataagttg gtatgaaagc acacagttgg gcactaaagc cccttttaga 7260

gaaagaggac atgaagcagg agatagttaa tagctaagtg tggttgtagt ataaagcaag 7320

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cagaacaaat aaaaattaca tttaatttac acatgtatat cctgtttgtg ataaaaatac 7440

atttctgaaa agtatacttt acgtcagatt tgggttctat tgactaaaat gtgttcatcg 7500

ggaatgggaa taacccagaa cataacaagc aaaaaattat gacaaatata tagtatacct 7560

ttaagaaaca tgtttatatt gatataattt tttgattaaa tattatacac actaagggta 7620

caangcacat tttcctttta tganttngat acagtagttt atgtgtcagt cagatacttc 7680

cacatttttg ctgaactgga tacagtaagc agcttaccaa atattctatg gtagaaaact 7740

nggacttcct ggtttgctta aatcaaatat attgtactct cttaaaacgg ttggcattta 7800

taaatagatg gatacatggt ttaaatgtgt ctgttnacat acctagttga gagaacctaa 7860

agaattttct gcgtctccag catttatatt cagttctgtt taatacatta tcgaaattga 7920

catttataag tatgacagtt ttgtgtatat ggccttttca tagcttaata ttggctgtaa 7980

cagagaattg tgaaattgta agaagtagtt ttctttgtag gtgtaaaatt gaatttttaa 8040

gaatattctt gacagtttta tgtatatggc cttttcatag cttaatattg gctataacag 8100

agaattgtga aattgttaag aagtaggtgt aaaattgaat ttttaagaat attcttgaat 8160

gtttttttct tggaaaaatt aaaaagctat gcagcccaat aacttgtgtt ttgtttgcat 8220

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ctgactacat tctcaataaa tcagtagaaa aacagttcaa ggcttttcgg agaggttttc 8340

atatggtgac caatgaatct cccttaaagt acttattcag accagaagaa attgaattgc 8400

ttatatgtgg aagccgggta agaaagcagg tgtctgcaaa aagtcatgta tcgatttatt 8460

gtttgtaatg atacagtagt atagcagata actaagacat attttcttga atttgcagaa 8520

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attgtcatct atatacttag atttgtattt gtaatataat caccattttt cagagctaat 8760

cttgtgattt atttcatgaa tgaagtgttg ttatatataa gtctcatgta atctcctgca 8820

tttggcgtat ggattatcta gtattcctca ctggttagag tatgcttact gctggttaga 8880

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cactttttcc tcccaaagtt gagttaaagg atgagtagac caggagaata aaggagaaag 9300

gataaataaa atatataccc aaaggcacct ggagttaatt tttccaaata ttcatttcag 9360

tctttttcaa ttcataggat tttgtctttt gctcattact gactgcataa tgtgattata 9420

ccatagttta aatagtcact tcctgttact acacacttgg gttttctcaa ttttttacta 9480

ttgtagtact aatattttac tatattgtaa tctaatccaa atttttacgt attcagagct 9540

gttcaggata aatttgcttg gaaattttta aatcaccaga agtgatacta tcctgataat 9600

taacttccaa gttgtctctt aatatagttt taatgcaaat cataagctta tgttagtacc 9660

agtcataatg aatgccaaac tgaaaccagt attgtatttt ttctcattag ggagttctgg 9720

gaaatcgttc attcatttac agatgaacag aaaagactct tcttgcagtt tacaacgggc 9780

acagacagag cacctgtggg aggactagga aaattaaaga tgattatagc caaaaatggc 9840

ccagacacag aaaggtaggt aattattaac ttgtgactgt atacctaccg aaaaccttgc 9900

attcctcgtc acatacatat gaactgtctt tatagtttct gagcacattc gtgattttat 9960

atacaaatcc ccaaatcata ttagacaatt gagaaaatac tttgctgtca ttgtgtgagg 10020

aaacttttaa gaaattgccc tagttaaaaa ttattatggg gctcacattg gtttggaatc 10080

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atgatcatct atttagaatg gttacattga ggctcggaag attatcattt gattgtgcta 10200

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tctgttatgt agtaaaaact caatggatac agtatcttat catcgtcact agctttgagt 10500

aatttatagg ataaaggcaa cttggtagtt acacaacaaa aagtttatga tttgcattaa 10560

tgtatagttt gcattgcaga ccgtctcaac tatatacaat ctaaaaatag gagcatttaa 10620

ttctaagtgt atttcccatg acttacagtt ttcctgtttt tttccccttt tctctattta 10680

ggttacctac atctcatact tgctttaatg tgcttttact tccggaatac tcaagcaaag 10740

aaaaacttaa agagagattg ttgaaggcca tcacgtatgc caaaggattt ggcatgctgt 10800

aaaacaaaac aaaacaaaat aaaacaaaaa aaaggaagga aaaaaaaaga aaaaatttaa 10860

aaaattttaa aaatataacg agggataaat ttt 10893

<210> 10

<211> 852

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Met Lys Arg Ala Ala Ala Lys His Leu Ile Glu Arg Tyr Tyr His Gln

1 5 10 15

Leu Thr Glu Gly Cys Gly Asn Glu Ala Cys Thr Asn Glu Phe Cys Ala

20 25 30

Ser Cys Pro Thr Phe Leu Arg Met Asp Asn Asn Ala Ala Ala Ile Lys

35 40 45

Ala Leu Glu Leu Tyr Lys Ile Asn Ala Lys Leu Cys Asp Pro His Pro

50 55 60

Ser Lys Lys Gly Ala Ser Ser Ala Tyr Leu Glu Asn Ser Lys Gly Ala

65 70 75 80

Pro Asn Asn Ser Cys Ser Glu Ile Lys Met Asn Lys Lys Gly Ala Arg

85 90 95

Ile Asp Phe Lys Asp Val Thr Tyr Leu Thr Glu Glu Lys Val Tyr Glu

100 105 110

Ile Leu Glu Leu Cys Arg Glu Arg Glu Asp Tyr Ser Pro Leu Ile Arg

115 120 125

Val Ile Gly Arg Val Phe Ser Ser Ala Glu Ala Leu Val Gln Ser Phe

130 135 140

Arg Lys Val Lys Gln His Thr Lys Glu Glu Leu Lys Ser Leu Gln Ala

145 150 155 160

Lys Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Lys Glu Lys Ala Ala Cys Ser

165 170 175

Ala Ala Ala Met Glu Glu Asp Ser Glu Ala Ser Ser Ser Arg Ile Gly

180 185 190

Asp Ser Ser Gln Gly Asp Asn Asn Leu Gln Lys Leu Gly Pro Asp Asp

195 200 205

Val Ser Val Asp Ile Asp Ala Ile Arg Arg Val Tyr Thr Arg Leu Leu

210 215 220

Ser Asn Glu Lys Ile Glu Thr Ala Phe Leu Asn Ala Leu Val Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Pro Asn Val Glu Cys Asp Leu Thr Tyr His Asn Val Tyr Ser Arg

245 250 255

Asp Pro Asn Tyr Leu Asn Leu Phe Ile Ile Val Met Glu Asn Arg Asn

260 265 270

Leu His Ser Pro Glu Tyr Leu Glu Met Ala Leu Pro Leu Phe Cys Lys

275 280 285

Ala Met Ser Lys Leu Pro Leu Ala Ala Gln Gly Lys Leu Ile Arg Leu

290 295 300

Trp Ser Lys Tyr Asn Ala Asp Gln Ile Arg Arg Met Met Glu Thr Phe

305 310 315 320

Gln Gln Leu Ile Thr Tyr Lys Val Ile Ser Asn Glu Phe Asn Ser Arg

325 330 335

Asn Leu Val Asn Asp Asp Asp Ala Ile Val Ala Ala Ser Lys Cys Leu

340 345 350

Lys Met Val Tyr Tyr Ala Asn Val Val Gly Gly Glu Val Asp Thr Asn

355 360 365

His Asn Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro Ile Pro Glu Ser Ser Glu Leu

370 375 380

Thr Leu Gln Glu Leu Leu Gly Glu Glu Arg Arg Asn Lys Lys Gly Pro

385 390 395 400

Arg Val Asp Pro Leu Glu Thr Glu Leu Gly Val Lys Thr Leu Asp Cys

405 410 415

Arg Lys Pro Leu Ile Pro Phe Glu Glu Phe Ile Asn Glu Pro Leu Asn

420 425 430

Glu Val Leu Glu Met Asp Lys Asp Tyr Thr Phe Phe Lys Val Glu Thr

435 440 445

Glu Asn Lys Phe Ser Phe Met Thr Cys Pro Phe Ile Leu Asn Ala Val

450 455 460

Thr Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Tyr Asp Asn Arg Ile Arg Met Tyr Ser

465 470 475 480

Glu Arg Arg Ile Thr Val Leu Tyr Ser Leu Val Gln Gly Gln Gln Leu

485 490 495

Asn Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Val Arg Arg Asp His Ile Ile Asp Asp

500 505 510

Ala Leu Val Arg Leu Glu Met Ile Ala Met Glu Asn Pro Ala Asp Leu

515 520 525

Lys Lys Gln Leu Tyr Val Glu Phe Glu Gly Glu Gln Gly Val Asp Glu

530 535 540

Gly Gly Val Ser Lys Glu Phe Phe Gln Leu Val Val Glu Glu Ile Phe

545 550 555 560

Asn Pro Asp Ile Gly Met Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Thr Lys Leu Phe

565 570 575

Trp Phe Asn Pro Ser Ser Phe Glu Thr Glu Gly Gln Phe Thr Leu Ile

580 585 590

Gly Ile Val Leu Gly Leu Ala Ile Tyr Asn Asn Cys Ile Leu Asp Val

595 600 605

His Phe Pro Met Val Val Tyr Arg Lys Leu Met Gly Lys Lys Gly Thr

610 615 620

Phe Arg Asp Leu Gly Asp Ser His Pro Val Leu Tyr Gln Ser Leu Lys

625 630 635 640

Asp Leu Leu Glu Tyr Glu Gly Asn Val Glu Asp Asp Met Met Ile Thr

645 650 655

Phe Gln Ile Ser Gln Thr Asp Leu Phe Gly Asn Pro Met Met Tyr Asp

660 665 670

Leu Lys Glu Asn Gly Asp Lys Ile Pro Ile Thr Asn Glu Asn Arg Lys

675 680 685

Glu Phe Val Asn Leu Tyr Ser Asp Tyr Ile Leu Asn Lys Ser Val Glu

690 695 700

Lys Gln Phe Lys Ala Phe Arg Arg Gly Phe His Met Val Thr Asn Glu

705 710 715 720

Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Phe Arg Pro Glu Glu Ile Glu Leu Leu Ile

725 730 735

Cys Gly Ser Arg Asn Leu Asp Phe Gln Ala Leu Glu Glu Thr Thr Glu

740 745 750

Tyr Asp Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Ser Val Leu Ile Arg Glu Phe Trp

755 760 765

Glu Ile Val His Ser Phe Thr Asp Glu Gln Lys Arg Leu Phe Leu Gln

770 775 780

Phe Thr Thr Gly Thr Asp Arg Ala Pro Val Gly Gly Leu Gly Lys Leu

785 790 795 800

Lys Met Ile Ile Ala Lys Asn Gly Pro Asp Thr Glu Arg Leu Pro Thr

805 810 815

Ser His Thr Cys Phe Asn Val Leu Leu Leu Pro Glu Tyr Ser Ser Lys

820 825 830

Glu Lys Leu Lys Glu Arg Leu Leu Lys Ala Ile Thr Tyr Ala Lys Gly

835 840 845

Phe Gly Met Leu

850

<210> 11

<211> 72

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac 60

ccagccgcag cc 72

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 12

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类免疫缺陷病毒

<400> 13

Tyr Ala Arg Lys Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 2767

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 14

acagtatgac atctgatgct ggagggtcgc actttcacaa atgagtcagc tggtacatgg 60

ggttatcatc aatttttagc tcttctgtct gggagataca agtttggaag caatcttggg 120

gtacttaccc acaaggctgg tggagaccag atcaggagaa cctcagtctg acgacattga 180

agctagccga atgaagcgag cagctgcaaa gcatctaata gaacgctact accaccagtt 240

aactgagggc tgtggaaatg aagcctgcac gaatgagttt tgtgcttcct gtccaacttt 300

tcttcgtatg gataataatg cagcagctat taaagccctc gagctttata agattaatgc 360

aaaactctgt gatcctcatc cctccaagaa aggagcaagc tcagcttacc ttgagaactc 420

gaaaggtgcc cccaacaact cctgctctga gataaaaatg aacaagaaag gcgctagaat 480

tgattttaaa gatgtgactt acttaacaga agagaaggta tatgaaattc ttgaattatg 540

tagagaaaga gaggattatt cccctttaat ccgtgttatt ggaagagttt tttctagtgc 600

tgaggcattg gtacagagct tccggaaagt taaacaacac accaaggaag aactgaaatc 660

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tgctgctatg gaagaagact cagaagcatc ttcctcaagg ataggtgata gctcacaggg 780

agacaacaat ttgcaaaaat taggccctga tgatgtgtct gtggatattg atgccattag 840

aagggtctac accagattgc tctctaatga aaaaattgaa actgcctttc tcaatgcact 900

tgtatatttg tcacctaacg tggaatgtga cttgacgtat cacaatgtat actctcgaga 960

tcctaattat ctgaatttgt tcattatcgt aatggagaat agaaatctcc acagtcctga 1020

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ccaaggaaaa ctgatcagac tgtggtctaa atacaatgca gaccagattc ggagaatgat 1140

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aaaaccactt atcccttttg aagagtttat taatgaacca ctgaatgagg ttctagaaat 1500

ggataaagat tatacttttt tcaaagtaga aacagagaac aaattctctt ttatgacatg 1560

tccctttata ttgaatgctg tcacaaagaa tttgggatta tattatgaca atagaattcg 1620

catgtacagt gaacgaagaa tcactgttct ctacagctta gttcaaggac agcagttgaa 1680

tccatatttg agactcaaag ttagacgtga ccatatcata gatgatgcac ttgtccggct 1740

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gtttaatcca tcttcttttg aaactgaggg tcagtttact ctgattggca tagtactggg 1980

tctggctatt tacaataact gtatactgga tgtacatttt cccatggttg tctacaggaa 2040

gctaatgggg aaaaaaggaa cttttcgtga cttgggagac tctcacccag ttctatatca 2100

gagtttaaaa gatttattgg agtatgaagg gaatgtggaa gatgacatga tgatcacttt 2160

ccagatatca cagacagatc tttttggtaa cccaatgatg tatgatctaa aggaaaatgg 2220

tgataaaatt ccaattacaa atgaaaacag gaaggaattt gtcaatcttt attctgacta 2280

cattctcaat aaatcagtag aaaaacagtt caaggctttt cggagaggtt ttcatatggt 2340

gaccaatgaa tctcccttaa agtacttatt cagaccagaa gaaattgaat tgcttatatg 2400

tggaagccgg aatctagatt tccaagcact agaagaaact acagaatatg acggtggcta 2460

taccagggac tctgttctga ttagggagtt ctgggaaatc gttcattcat ttacagatga 2520

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gagattgttg aaggccatca cgtatgccaa aggatttggc atgctgtaaa acaaaacaaa 2760

acaaaat 2767

<210> 15

<211> 5276

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 15

agccagtcct cccgtcttgc gccgcggccg cgagatccgt gtgtctccca agatggtggc 60

gctgggctcg gggtgactac aggagacgac ggggcctttt cccttcgcca ggacccgaca 120

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gttaaaaatc tgtaagagcc tgattttaga attcaccagc tcctcagaag tttggcgaaa 600

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ttttaatcag tgactcaaag ctgtgatcac cctgatgtca ccgaatggcc acagcttgta 720

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ttattggaaa tcaggagaac ctcagtctga cgacattgaa gctagccgaa tgaagcgagc 840

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agcagctatt aaagccctcg agctttataa gattaatgca aaactctgtg atcctcatcc 1020

ctccaagaaa ggagcaagct cagcttacct tgagaactcg aaaggtgccc ccaacaactc 1080

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cattatcgta atggagaata gaaatctcca cagtcctgaa tatctggaaa tggctttgcc 1680

attattttgc aaagcgatga gcaagctacc ccttgcagcc caaggaaaac tgatcagact 1740

gtggtctaaa tacaatgcag accagattcg gagaatgatg gagacatttc agcaacttat 1800

tacttataaa gtcataagca atgaatttaa cagtcgaaat ctagtgaatg atgatgatgc 1860

cattgttgct gcttcgaagt gcttgaaaat ggtttactat gcaaatgtag tgggagggga 1920

agtggacaca aatcacaatg aagaagatga tgaagagccc atccctgagt ccagcgagct 1980

gacacttcag gaacttttgg gagaagaaag aagaaacaag aaaggtcctc gagtggaccc 2040

cctggaaact gaacttggtg ttaaaaccct ggattgtcga aaaccactta tcccttttga 2100

agagtttatt aatgaaccac tgaatgaggt tctagaaatg gataaagatt atactttttt 2160

caaagtagaa acagagaaca aattctcttt tatgacatgt ccctttatat tgaatgctgt 2220

cacaaagaat ttgggattat attatgacaa tagaattcgc atgtacagtg aacgaagaat 2280

cactgttctc tacagcttag ttcaaggaca gcagttgaat ccatatttga gactcaaagt 2340

tagacgtgac catatcatag atgatgcact tgtccggcta gagatgatcg ctatggaaaa 2400

tcctgcagac ttgaagaagc agttgtatgt ggaatttgaa ggagaacaag gagttgatga 2460

gggaggtgtt tccaaagaat tttttcagct ggttgtggag gaaatcttca atccagatat 2520

tggtatgttc acatacgatg aatctacaaa attgttttgg tttaatccat cttcttttga 2580

aactgagggt cagtttactc tgattggcat agtactgggt ctggctattt acaataactg 2640

tatactggat gtacattttc ccatggttgt ctacaggaag ctaatgggga aaaaaggaac 2700

ttttcgtgac ttgggagact ctcacccagt tctatatcag agtttaaaag atttattgga 2760

gtatgaaggg aatgtggaag atgacatgat gatcactttc cagatatcac agacagatct 2820

ttttggtaac ccaatgatgt atgatctaaa ggaaaatggt gataaaattc caattacaaa 2880

tgaaaacagg aaggaatttg tcaatcttta ttctgactac attctcaata aatcagtaga 2940

aaaacagttc aaggcttttc ggagaggttt tcatatggtg accaatgaat ctcccttaaa 3000

gtacttattc agaccagaag aaattgaatt gcttatatgt ggaagccgga atctagattt 3060

ccaagcacta gaagaaacta cagaatatga cggtggctat accagggact ctgttctgat 3120

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agccaaaaat ggcccagaca cagaaaggtt acctacatct catacttgct ttaatgtgct 3300

tttacttccg gaatactcaa gcaaagaaaa acttaaagag agattgttga aggccatcac 3360

gtatgccaaa ggatttggca tgctgtaaaa caaaacaaaa caaaataaaa caaaaaaaag 3420

gaaggaaaaa aaaagaaaaa atttaaaaaa ttttaaaaat ataacgaggg ataaattttt 3480

ggtggtgata gtgtcccagt acaaaaaggc tgtaagatag tcaaccacag tagtcaccta 3540

tgtctgtgcc tcccttcttt attggggaca tgtgggctgg aacagcagat ttcagctaca 3600

tatatgaaca aatcctttat tattattata attatttttt tgcgtgaaag tgttacatat 3660

tctttcactt gtatgtacag agaggttttt ctgaatattt attttaaggg ttaaatcact 3720

tttgcttgtg tttattactg cttgaggttg agccttttga gtatttaaaa aatatatacc 3780

aacagaacta ctctcccaag gaaaatattg ccaccatttg tagaccacgt aaccttcaag 3840

tatgtgctac ttttttgtcc ctgtatctaa ctcaaatcag gaactgtatt ttttttaatg 3900

atttgctttt gaaacttgaa gtcttgaaaa cagtgtgatg caattactgc tgttctagcc 3960

cccaaagagt tttctgtgca aaatcttgag aatcaatcaa taaagaaaga tggaaggaag 4020

ggagaaattg gaatgtttta actgcagccc tcagaacttt agtaacagca caacaaatta 4080

aaaacaaaaa caactcatgc cacagtatgt cgtcttcatg tgtcttgcaa tgaactgttt 4140

cagtagccaa tcctctttct tagtatatga aaggacaggg atttttgttc ttgttgttct 4200

cgttgttgtt ttaagtttac tggggaaagt gcatttggcc aaatgaaatg gtagtcaagc 4260

ctattgcaac aaagttagga agtttgttgt ttgtttatta taaacaaaaa gcatgtgaaa 4320

gtgcacttaa gatagagttt ttattaatta cttacttatt acctagattt taaatagaca 4380

atccaaagtc tccccttcgt gttgccatca tcttgttgaa tcagccattt tatcgaggca 4440

cgtgatcagt gttgcaacat aatgaaaaag atggctactg tgccttgtgt tacttaatca 4500

tacagtaagc tgacctggaa atgaatgaaa ctattactcc taagaattac attgtatagc 4560

cccacagatt aaatttaatt aattaattca aaacatgtta aacgttactt tcatgtacta 4620

tggaaaagta caagtaggtt tacattactg atttccagaa gtaagtagtt tcccctttcc 4680

tagtcttctg tgtatgtgat gttgttaatt tcttttattg cattataaaa taaaaggatt 4740

atgtattttt aactaaggtg agacattgat atatcctttt gctacaagct atagctaatg 4800

tgctgagctt gtgccttggt gattgattga ttgattgact gattgtttta actgattact 4860

gtagatcaac ctgatgattt gtttgtttga aattggcagg aaaaatgcag ctttcaaatc 4920

attgggggga gaaaaaggat gtctttcagg attattttaa ttaatttttt tcataattga 4980

gacagaactg tttgttatgt accataatgc taaataaaac tgtggcactt ttcaccataa 5040

tttaatttag tggaaaaaga agacaatgct ttccatattg tgataaggta acatggggtt 5100

tttctgggcc agcctttaga acactgttag ggtacatacg ctaccttgat gaaagggacc 5160

ttcgtgcaac tgtagtcatc ttaaaggctt ctcatccact gtgcttctta atgtgtaatt 5220

aaagtgagga gaaattaaat actctgaggg cgttttatat aataaattcg tgaaga 5276

<210> 16

<211> 875

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 16

Met Glu Lys Leu His Gln Cys Tyr Trp Lys Ser Gly Glu Pro Gln Ser

1 5 10 15

Asp Asp Ile Glu Ala Ser Arg Met Lys Arg Ala Ala Ala Lys His Leu

20 25 30

Ile Glu Arg Tyr Tyr His Gln Leu Thr Glu Gly Cys Gly Asn Glu Ala

35 40 45

Cys Thr Asn Glu Phe Cys Ala Ser Cys Pro Thr Phe Leu Arg Met Asp

50 55 60

Asn Asn Ala Ala Ala Ile Lys Ala Leu Glu Leu Tyr Lys Ile Asn Ala

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Lys Leu Cys Asp Pro His Pro Ser Lys Lys Gly Ala Ser Ser Ala Tyr

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Leu Glu Asn Ser Lys Gly Ala Pro Asn Asn Ser Cys Ser Glu Ile Lys

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Met Asn Lys Lys Gly Ala Arg Ile Asp Phe Lys Asp Val Thr Tyr Leu

115 120 125

Thr Glu Glu Lys Val Tyr Glu Ile Leu Glu Leu Cys Arg Glu Arg Glu

130 135 140

Asp Tyr Ser Pro Leu Ile Arg Val Ile Gly Arg Val Phe Ser Ser Ala

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Glu Ala Leu Val Gln Ser Phe Arg Lys Val Lys Gln His Thr Lys Glu

165 170 175

Glu Leu Lys Ser Leu Gln Ala Lys Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu

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Lys Glu Lys Ala Ala Cys Ser Ala Ala Ala Met Glu Glu Asp Ser Glu

195 200 205

Ala Ser Ser Ser Arg Ile Gly Asp Ser Ser Gln Gly Asp Asn Asn Leu

210 215 220

Gln Lys Leu Gly Pro Asp Asp Val Ser Val Asp Ile Asp Ala Ile Arg

225 230 235 240

Arg Val Tyr Thr Arg Leu Leu Ser Asn Glu Lys Ile Glu Thr Ala Phe

245 250 255

Leu Asn Ala Leu Val Tyr Leu Ser Pro Asn Val Glu Cys Asp Leu Thr

260 265 270

Tyr His Asn Val Tyr Ser Arg Asp Pro Asn Tyr Leu Asn Leu Phe Ile

275 280 285

Ile Val Met Glu Asn Arg Asn Leu His Ser Pro Glu Tyr Leu Glu Met

290 295 300

Ala Leu Pro Leu Phe Cys Lys Ala Met Ser Lys Leu Pro Leu Ala Ala

305 310 315 320

Gln Gly Lys Leu Ile Arg Leu Trp Ser Lys Tyr Asn Ala Asp Gln Ile

325 330 335

Arg Arg Met Met Glu Thr Phe Gln Gln Leu Ile Thr Tyr Lys Val Ile

340 345 350

Ser Asn Glu Phe Asn Ser Arg Asn Leu Val Asn Asp Asp Asp Ala Ile

355 360 365

Val Ala Ala Ser Lys Cys Leu Lys Met Val Tyr Tyr Ala Asn Val Val

370 375 380

Gly Gly Glu Val Asp Thr Asn His Asn Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro

385 390 395 400

Ile Pro Glu Ser Ser Glu Leu Thr Leu Gln Glu Leu Leu Gly Glu Glu

405 410 415

Arg Arg Asn Lys Lys Gly Pro Arg Val Asp Pro Leu Glu Thr Glu Leu

420 425 430

Gly Val Lys Thr Leu Asp Cys Arg Lys Pro Leu Ile Pro Phe Glu Glu

435 440 445

Phe Ile Asn Glu Pro Leu Asn Glu Val Leu Glu Met Asp Lys Asp Tyr

450 455 460

Thr Phe Phe Lys Val Glu Thr Glu Asn Lys Phe Ser Phe Met Thr Cys

465 470 475 480

Pro Phe Ile Leu Asn Ala Val Thr Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Tyr Asp

485 490 495

Asn Arg Ile Arg Met Tyr Ser Glu Arg Arg Ile Thr Val Leu Tyr Ser

500 505 510

Leu Val Gln Gly Gln Gln Leu Asn Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Val Arg

515 520 525

Arg Asp His Ile Ile Asp Asp Ala Leu Val Arg Leu Glu Met Ile Ala

530 535 540

Met Glu Asn Pro Ala Asp Leu Lys Lys Gln Leu Tyr Val Glu Phe Glu

545 550 555 560

Gly Glu Gln Gly Val Asp Glu Gly Gly Val Ser Lys Glu Phe Phe Gln

565 570 575

Leu Val Val Glu Glu Ile Phe Asn Pro Asp Ile Gly Met Phe Thr Tyr

580 585 590

Asp Glu Ser Thr Lys Leu Phe Trp Phe Asn Pro Ser Ser Phe Glu Thr

595 600 605

Glu Gly Gln Phe Thr Leu Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ala Ile Tyr

610 615 620

Asn Asn Cys Ile Leu Asp Val His Phe Pro Met Val Val Tyr Arg Lys

625 630 635 640

Leu Met Gly Lys Lys Gly Thr Phe Arg Asp Leu Gly Asp Ser His Pro

645 650 655

Val Leu Tyr Gln Ser Leu Lys Asp Leu Leu Glu Tyr Glu Gly Asn Val

660 665 670

Glu Asp Asp Met Met Ile Thr Phe Gln Ile Ser Gln Thr Asp Leu Phe

675 680 685

Gly Asn Pro Met Met Tyr Asp Leu Lys Glu Asn Gly Asp Lys Ile Pro

690 695 700

Ile Thr Asn Glu Asn Arg Lys Glu Phe Val Asn Leu Tyr Ser Asp Tyr

705 710 715 720

Ile Leu Asn Lys Ser Val Glu Lys Gln Phe Lys Ala Phe Arg Arg Gly

725 730 735

Phe His Met Val Thr Asn Glu Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Phe Arg Pro

740 745 750

Glu Glu Ile Glu Leu Leu Ile Cys Gly Ser Arg Asn Leu Asp Phe Gln

755 760 765

Ala Leu Glu Glu Thr Thr Glu Tyr Asp Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Ser

770 775 780

Val Leu Ile Arg Glu Phe Trp Glu Ile Val His Ser Phe Thr Asp Glu

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Gln Lys Arg Leu Phe Leu Gln Phe Thr Thr Gly Thr Asp Arg Ala Pro

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Val Gly Gly Leu Gly Lys Leu Lys Met Ile Ile Ala Lys Asn Gly Pro

820 825 830

Asp Thr Glu Arg Leu Pro Thr Ser His Thr Cys Phe Asn Val Leu Leu

835 840 845

Leu Pro Glu Tyr Ser Ser Lys Glu Lys Leu Lys Glu Arg Leu Leu Lys

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Ala Ile Thr Tyr Ala Lys Gly Phe Gly Met Leu

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<210> 17

<211> 2970

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 17

tttttccgga taaggaagcg cgggtcccgc atgagccccg gcggtggcgg cagcgaaaga 60

gaacgaggcg gtggcgggcg gaggcggcgg gcgagggcga ctacgaccag tgaggcggcc 120

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attcaccagc tcctcagaag tttggcgaaa tatgagttat taagcctacg ctcagatcaa 240

ggtagcagct agactggtgt gacaacctgt ttttaatcag tgactcaaag ctgtgatcac 300

cctgatgtca ccgaatggcc acagcttgta aaagatcagg agaacctcag tctgacgaca 360

ttgaagctag ccgaatgaag cgagcagctg caaagcatct aatagaacgc tactaccacc 420

agttaactga gggctgtgga aatgaagcct gcacgaatga gttttgtgct tcctgtccaa 480

cttttcttcg tatggataat aatgcagcag ctattaaagc cctcgagctt tataagatta 540

atgcaaaact ctgtgatcct catccctcca agaaaggagc aagctcagct taccttgaga 600

actcgaaagg tgcccccaac aactcctgct ctgagataaa aatgaacaag aaaggcgcta 660

gaattgattt taaagatgtg acttacttaa cagaagagaa ggtatatgaa attcttgaat 720

tatgtagaga aagagaggat tattcccctt taatccgtgt tattggaaga gttttttcta 780

gtgctgaggc attggtacag agcttccgga aagttaaaca acacaccaag gaagaactga 840

aatctcttca agcaaaagat gaagacaaag atgaagatga aaaggaaaaa gctgcatgtt 900

ctgctgctgc tatggaagaa gactcagagg catcttcctc aaggataggt gatagctcac 960

agggagacaa caatttgcaa aaattaggcc ctgatgatgt gtctgtggat attgatgcca 1020

ttagaagggt ctacaccaga ttgctctcta atgaaaaaat tgaaactgcc tttctcaatg 1080

cacttgtata tttgtcacct aacgtggaat gtgacttgac gtatcacaat gtatactctc 1140

gagatcctaa ttatctgaat ttgttcatta tcgtaatgga gaatagaaat ctccacagtc 1200

ctgaatatct ggaaatggct ttgccattat tttgcaaagc gatgagcaag ctaccccttg 1260

cagcccaagg aaaactgatc agactgtggt ctaaatacaa tgcagaccag attcggagaa 1320

tgatggagac atttcagcaa cttattactt ataaagtcat aagcaatgaa tttaacagtc 1380

gaaatctagt gaatgatgat gatgccattg ttgctgcttc gaagtgcttg aaaatggttt 1440

actatgcaaa tgtagtggga ggggaagtgg acacaaatca caatgaagaa gatgatgaag 1500

agcccatccc tgagtccagc gagctgacac ttcaggaact tttgggagaa gaaagaagaa 1560

acaagaaagg tcctcgagtg gaccccctgg aaactgaact tggtgttaaa accctggatt 1620

gtcgaaaacc acttatccct tttgaagagt ttattaatga accactgaat gaggttctag 1680

aaatggataa agattatact tttttcaaag tagaaacaga gaacaaattc tcttttatga 1740

catgtccctt tatattgaat gctgtcacaa agaatttggg attatattat gacaatagaa 1800

ttcgcatgta cagtgaacga agaatcactg ttctctacag cttagttcaa ggacagcagt 1860

tgaatccata tttgagactc aaagttagac gtgaccatat catagatgat gcacttgtcc 1920

ggctagagat gatcgctatg gaaaatcctg cagacttgaa gaagcagttg tatgtggaat 1980

ttgaaggaga acaaggagtt gatgagggag gtgtttccaa agaatttttt cagctggttg 2040

tggaggaaat cttcaatcca gatattggta tgttcacata cgatgaatct acaaaattgt 2100

tttggtttaa tccatcttct tttgaaactg agggtcagtt tactctgatt ggcatagtac 2160

tgggtctggc tatttacaat aactgtatac tggatgtaca ttttcccatg gttgtctaca 2220

ggaagctaat ggggaaaaaa ggaacttttc gtgacttggg agactctcac ccagttctat 2280

atcagagttt aaaagattta ttggagtatg aagggaatgt ggaagatgac atgatgatca 2340

ctttccagat atcacagaca gatctttttg gtaacccaat gatgtatgat ctaaaggaaa 2400

atggtgataa aattccaatt acaaatgaaa acaggaagga atttgtcaat ctttattctg 2460

actacattct caataaatca gtagaaaaac agttcaaggc ttttcggaga ggttttcata 2520

tggtgaccaa tgaatctccc ttaaagtact tattcagacc agaagaaatt gaattgctta 2580

tatgtggaag ccggaatcta gatttccaag cactagaaga aactacagaa tatgacggtg 2640

gctataccag ggactctgtt ctgattaggg agttctggga aatcgttcat tcatttacag 2700

atgaacagaa aagactcttc ttgcagttta caacgggcac agacagagca cctgtgggag 2760

gactaggaaa attaaagatg attatagcca aaaatggccc agacacagaa aggttaccta 2820

catctcatac ttgctttaat gtgcttttac ttccggaata ctcaagcaaa gaaaaactta 2880

aagagagatt gttgaaggcc atcacgtatg ccaaaggatt tggcatgctg taaaacaaaa 2940

caaaacaaaa taaaacaaaa aaaaggaagg 2970

<210> 18

<211> 24

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 18

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 19

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 20

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 21

Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg

1 5

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 22

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1 5 10 15

Ser Lys