miR-29a-3p在制备治疗周围神经损伤药物中的应用
阅读说明：本技术 miR-29a-3p在制备治疗周围神经损伤药物中的应用 (Application of miR-29a-3p in preparation of medicine for treating peripheral nerve injury ) 是由 易晟 张锐锐 沈银莹 成张淳 顾晓松 于 2020-03-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了miR-29a-3p在制备治疗周围神经损伤药物中的应用。本发明首次揭示miR-29a-3p与周围神经损伤的关系,可通过下调miR-29a-3p的表达缓解或治疗周围神经损伤。(The invention provides application of miR-29a-3p in preparation of a medicine for treating peripheral nerve injury. The invention discloses the relation between miR-29a-3p and peripheral nerve injury for the first time, and peripheral nerve injury can be relieved or treated by down-regulating the expression of miR-29a-3 p.)
技术领域
本发明属于生物医药领域。具体地，涉及miR-29a-3p在制备治疗周围神经损伤药物中的应用。
背景技术
周围神经损伤是临床常见病例，且发病率呈逐年增加趋势。受损的周围神经保留一定的再生能力，这有别于有限的中枢神经系统的再生能力，受损神经的有效再生需要神经元的内在再生能力和合适的微环境。施万细胞是周围神经系统的主要胶质细胞，参与Büngner带的形成、生长因子、细胞因子和神经营养因子的分泌，因此，它们为神经再生建立了一个良好的局部微环境。
microRNA(miRNA)是动植物体内普遍存在的内源性表达的一类约含22个核苷酸的短链非编码RNA，通过降解其靶基因的mRNA或抑制蛋白翻译来负向调控基因的表达。miRNA还广泛参与机体的生理及病理过程，在组织细胞的生长发育、增殖、分化、及肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用。越来越多的证据表明miRNA在神经发育、神经退行性变以及神经再生中的作用。
miR-29a-3p属于miR-29家族，在miR-29家族成员中，miR-29a最早由LagosQuintana等人发现。研究表明，在大多数实体肿瘤中发挥抑癌作用。比如miR-29a-3p通过直接靶向OTUB2，抑制NF-κB信号通路抑制甲状腺乳头状癌的生长、增殖和侵袭；miR-29a-3p通过下调肝细胞癌IGF1R抑制细胞增殖和迁移；在神经系统中，miR-29被发现在神经系统肿瘤中下调，如胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤。但是在周围神经损伤方面的作用未见报道。
发明内容
本发明首次报道了miR-29a-3p与周围神经损伤修复之间的关系，可通过下调miR-29a-3p表达来治疗周围神经损伤。
本发明具体技术方案如下：
miR-29a-3p在制备治疗周围神经损伤药物中的应用，miR-29a-3p在人和大鼠间高度保守，本发明所述miR-29a-3p核苷酸序列如5’-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3’(SEQ ID NO:1)所示。
本发明所述的应用，可以以miR-29a-3p为靶点，设计或筛选具有下调miR-29a-3p表达作用的药物。
本发明所述的周围神经损伤选自坐骨神经损伤、臂丛神经损伤、桡神经损伤、腋神经损伤、肌皮神经损伤、正中神经损伤、尺神经损伤、股神经损伤、坐骨神经损伤、腓总神经损伤以及炎症性周围神经病、代谢性周围神经病(如糖尿病性、肾性或或肝性周围神经病)、恶性病性周围神经病中的一种或几种。
本发明另一目的在于提供一种miR-29a-3p抑制剂，为miR-29a-3p的反义核酸或者含有miR-29a-3p的表达载体。
优选的，miR-29a-3p的反义核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述载体选自质粒、病毒、细胞中的一种或几种。
本发明另一目的在于一种治疗周围神经损伤药物，含有下调miR-29a-3p表达的药物。
进一步的，所述药物还含有其他治疗周围神经损伤及其相关疾病的药物中的一种或几种，所述相关疾病为炎症性周围神经病、代谢性周围神经病(如糖尿病性、肾性或或肝性周围神经病)、恶性病性周围神经病。
优选的，所述其他治疗周围神经损伤及其相关疾病的药物选自神经营养药、激素(如糖皮质激素)、降糖药中的一种或几种。如甲钴胺、腺苷钴胺、维生素B1、维生素B12、纳络酮、鼠神经生长因子或其组合。
优选的，所述下调miR-29a-3p表达的药物为miR-29a-3p的反义核酸或者含有miR-29a-3p反义核酸的表达载体。
所述的药物还可以包含药学上可接受的载体。
优选的，所述的药物为液体剂型，优选地为注射剂，更优选为静脉注射剂或腹腔注射剂。
一个优选例中，所述的药物的施用方法包括直接注射miR-29a-3p抑制剂。
本发明另一目的在于提供了一种(i)下调miR-29a-3p表达；和/或(ii)治疗周围神经损伤的方法，包括向需要的对象施用本发明所述药物。
本发明另一目的在于提供了一种筛选(i)下调miR-29a-3p表达；和/或(ii)治疗周围神经损伤药物的方法，包括步骤：
(a)将加入候选化合物的细胞培养体系作为实验组；将不加入候选化合物的细胞培养体系作为对照组。
(b)当实验组中miR-29a-3p相对表达量明显低于对照组，则表明下调miR-29a-3p表达的药物筛选成功。
(c)可进一步测试候选化合物对原代施万细胞的表型影响(表型包括细胞活力、增殖速率和迁移速率)；其中，当实验组中细胞活力、增殖速率和迁移速率高于对照组，则表明该候选化合物为治疗周围神经损伤的物质。
附图说明
图1为转染抑制剂对照(IC)和miR-29a-3p抑制剂(Anti-miR-29a)的施万细胞中miR-29a-3p的相对表达量。
图2为miR-29a-3p抑制剂(Anti-miR-29a)对施万细胞活力的影响。
图3为miR-29a-3p抑制剂(Anti-miR-29a)对施万细胞增殖速率的影响。(图3A为EdU染色结果，图3B为转染miR-29a-3p抑制剂的施万细胞的增殖速率)。
图4为miR-29a-3p抑制剂(Anti-miR-29a)对施万细胞划痕实验的影响。(图4A为高倍显微镜下细胞划痕实验图(比例尺为50μm)，图4B为转染miR-29a-3p抑制剂的施万细胞的迁移速率)。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1
miR-29a-3p抑制剂，抑制剂对照均由广州市锐博生物科技有限公司合成。序列如下：
miR-29a-3p抑制剂：5’-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3’(SEQ ID NO:2)。
抑制剂对照：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3’(SEQ ID NO:3)。
转染试剂lipofectamine RNAima由Invitrogen公司生产。
实施例2原代施万细胞培养
取Sprague-Dawley大鼠(新生1d)坐骨神经，放入含有1mL 3mg/mL胶原酶的EP管中，用灭菌的手术剪将组织剪碎，于37℃消化30min，再加入1mL 0.25％胰酶，37℃消化10min，最后加入完全培养基(含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基)终止反应，用移液器吹打至肉眼基本看不到组织块为止。过40目筛网，用完全培养基清洗两次，然后将细胞种在预先用PLL包被过的培养皿中，放入37℃，5％CO2培养箱中。24h后换成含有10μM阿糖胞苷的完全培养基。两天后换成含2μM forskolin和10ng/mL HRG完全培养基，隔天换液。细胞长满后，用0.125％的胰酶将细胞消化下来，用rabbit complement和anti-thy1.1(1：1000)对细胞进行纯化，然后种在预先用PLL包被过的培养皿中。
实施例3RNA逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
RT-PCR反应体系如下(10μL)：
试剂
使用量
RNA模板量
1.0μg
miRNA RT引物(5μM)
1μL
5X Reverse Transcription Buffer
2μL
RTase Mix
2μL
RNase-free H2O
至10μL
以上体系混匀后，瞬时离心，RT反应程序为：42℃60min，70℃10min。
RT引物购自广州市锐博生物科技有限公司。
qRT-PCR反应体系如下(20μL)：
试剂
使用量
2X SYBR Green Mix
10μL
RT Product
2μL
正向引物(5μM)
0.8μL
反向引物(5μM)
0.8μL
ddH2O
至20μL
qRT-PCR反应程序：95℃预变性2min；40个PCR循环(95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s)；PCR扩增反应结束后，进行产物的溶解曲线分析，以确保PCR产物的质量。U6作为内参。利用ABI StepOne PCR仪及软件进行分析。RNA相对表达＝2-△△CT，△CT＝目标基因CT-内参CT值，其中CT值代表每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所需循环数。
qRT-PCR引物购自广州市锐博生物科技有限公司。
结果如图1所示，结果显示转染miR-29a-3p抑制剂(Anti-miR-29a)的施万细胞中miR-29a-3p的相对表达量明显低于抑制剂对照(IC)组。结果表明本发明设计的miR-29a-3p的反义核酸能够抑制miR-29a-3p的表达。
实施例4细胞转染实验
取原代培养纯化的施万细胞，利用lipofectamine RNAimax试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将设计合成的miR-29a-3p抑制剂以及抑制剂对照分别转入细胞，培养液为Opti-MEM(Gibco)。
实施例5细胞活力检测实验
纯化后的施万细胞种于96孔板，每孔细胞数1-2×104，100μl完全培养基，过夜待细胞贴壁后，每孔加10μl cck8试剂((Beyotime)，2小时后在450nm波长下测吸光度。miR-29a-3p抑制剂(Anti-miR-29a)对施万细胞活力的影响如图2所示，结果显示转染miR-29a-3p抑制剂(Anti-miR-29a)的施万细胞的存活率高于抑制剂对照(inhibitor control,IC)组。结果表明miR-29a-3p抑制剂能提高施万细胞的存活率。
实施例6细胞增殖实验
在转染36h后的96孔板中的加入EdU标记液，完全培养基与EdU标记液体积比为1000：1。培养箱孵育20h小时后4％多聚甲醛固定细胞，室温30min。使用EdU增殖试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)检测增殖细胞。
图3A为EdU染色结果(红色表示EdU染色，蓝色表示Hoechst 33342染色，比例尺代表100μm)。miR-29a-3p抑制剂(Anti-miR-29a)对施万细胞增殖速率的影响如图3B所示。结果显示转染miR-29a-3p抑制剂的施万细胞的增殖速率高于IC组。结果表明miR-29a-3p抑制剂能提高施万细胞的增殖速率。
实施例7细胞划痕实验
将划痕模具放在包被PLL的6孔板中，模具内每孔内加入转染48h后的细胞(含3万个细胞，70μl完全培养基)。待细胞长满后，去除模具，加入适量完培(含0.15μg/ml丝裂酶素C)，9h后观察效果。
图4A为高倍显微镜下细胞划痕实验图(比例尺为50μm)，图4B为转染miR-29a-3p抑制剂的施万细胞的迁移速率。结果显示，转染miR-29a-3p抑制剂的施万细胞的迁移速率高于IC组。结果表明miR-29a-3p抑制剂能提高施万细胞的迁移速率。
序列表
<110> 南通大学
<120> miR-29a-3p在制备治疗周围神经损伤药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人(human)
<400> 1
uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uaaccgauuu cagauggugc ua 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caguacuuuu guguaguaca aa 22