一种预防痛风性关节炎发作的药物
阅读说明：本技术 一种预防痛风性关节炎发作的药物 (Medicine for preventing gouty arthritis from happening ) 是由 林云锋 张梅 于 2020-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种预防痛风性关节炎发作的药物,属于抗炎药物领域。本发明的药物以DNA四面体和姜黄素的复合物为活性成分,能降低活性氧簇、NO的水平,减少炎症因子表达和分泌,起到显著的抗炎效果。(The invention discloses a medicine for preventing gouty arthritis from happening, and belongs to the field of anti-inflammatory medicines. The medicine of the invention takes the compound of the DNA tetrahedron and the curcumin as an active ingredient, can reduce the levels of active oxygen clusters and NO, reduces the expression and secretion of inflammatory factors, and has obvious anti-inflammatory effect.)
技术领域
本发明属于抗炎药物领域。
背景技术
痛风性关节炎是关节腔尿酸盐浓度升高，导致尿酸盐晶体析出，导致滑膜内皮细胞活化，促使单核巨噬细胞的粘附和渗出，吞噬尿酸盐微晶体后分泌炎性因子诱发的炎性反应。痛风性关节炎多为急性发作，病人常于午夜足痛惊醒，其疼痛呈刀割、咬噬样，关节及周围组织红、肿、热、痛。
非甾体消炎药(NSAID)、糖皮质激素和秋水仙碱是治疗痛风性关节炎的一线推荐用药，但这些药物的副作用较强：NSAID可能导致消化不良、血压升高以及神经系统的不良反应；糖皮质素可导致体内物质代谢紊乱、高血压、胃溃疡、白内障等副作用；秋水仙碱会引起食欲不振、腹泻、恶心等消化道症状，严重者还会引起贫血，导致肝肾功能衰竭。
姜黄素(Curcumin)是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种二酮类化合物，化学式为C21H20O6。姜黄素具有抗炎作用，有研究报道姜黄素可抑制氧化酶，清除自由基，从而达到抗氧化作用，进而抑制关节炎的发生和进展；但其生物利用度差，临床疗效十分有限(庹伟,周霖,曹洪,禹志宏.姜黄素对骨关节炎的防治作用及机制的研究进展[J/OL].重庆医学(录用定稿).中国知网网络首发时间：2020-06-29)。
四面体骨架核酸(tetrahedral framework nucleic acids,TFNAs)又称DNA四面体(tetrahedral DNA，TDN)、四面体DNA纳米结构，是一种由4条单链DNA通过链间碱基互补配对形成的一种四面体结构。TFNAs具有一定的抗炎效果，但效果有限，对痛风性关节炎这类以急性发作为主的疾病无法有效治疗或预防。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种新的预防痛风性关节炎发作的药物。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了一种复合物，它是DNA四面体和姜黄素的复合物。
进一步地，所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1～4所述的DNA通过碱基互补配对构成。
进一步地，所述DNA四面体和姜黄素的配比为200nM：40μM～100μM。
进一步地，所述DNA四面体和姜黄素的配比为200nM：40μM。
进一步地，所述复合物的制备方法如下：
将所述TFNAs和姜黄素在室温下均匀震荡6h。
本发明还提供了前述复合物在制备抗炎药物中的用途。
如前述的用途，所述抗炎药物为预防关节炎发作的药物。
进一步地，所述抗炎药物为预防痛风性关节炎发作的药物。
本发明还提供了一种抗炎药物，所述抗炎药物以前述的复合物为活性成分，加上药学上允许的辅助性成分制备得到。
进一步地，所述抗炎药物是预防痛风性关节炎发作的药物。
本发明的有益效果：
本发明的复合物具有良好的抗炎作用。
细胞实验表明本发明的复合物能大幅度降低炎症因素刺激下细胞内活性氧簇的水平(降幅大于TFNAs和姜黄素处理组别之和)，并降低NO的水平，降低TNF-a、IL-1β、IL-6等炎症因子水平(降幅大于TFNAs和姜黄素处理组别之和)。复合物中，TFNAs和姜黄素对抗炎产生了明显的协同增效作用。
动物实验也表明本发明的复合物能明显减弱痛风性关节炎的关节肿胀和炎症。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：姜黄素-TFNAs复合物(Cur-TFNAs)的合成示意图与鉴定。A，合成示意图；B，动态光散射结果；C，PAGE胶结果。
图2：TFNAs、Cur以及Cur-TFNAs的细胞摄取检测。
图3：ROS(A)、NO(B)和细胞活性(cck8)(C)检测结果。数据表示为平均值±SD(n＝4)。学生t检验用于统计分析。统计学分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4：炎性因子的检测结果。A，IL-1β免疫荧光；B，TNF-a分泌水平；C，IL-6的分泌水平；D，IL-6免疫荧光；E，IL-1β的Western blot(简称WB，下同)检测条带；F，IL-1β的WB检测条带信号量化条形图；G，IL-6的WB检测条带；H，IL-6的WB检测条带信号量化条形图。数据表示为平均值±SD(n＝4)。学生t检验用于统计分析。统计学分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5：痛风性关节炎体内实验结果。A，小鼠大体观；B，踝关节HE染色。
具体实施方式
实施例1 Cur-TFNAs的合成与鉴定
1.TFNAs的合成
将四条DNA单链(S1、S2、S3、S4)溶解于TM Buffer(10mM Tris-HCl,50mM MgCl2,pH＝8.0)中，使得四条DNA单链的终浓度为1000nM，充分混匀后迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即可得到四面体骨架核酸TFNAs。
四条单链的序列(5′→3′)如下：
S1：
ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA(SEQID NO.1)
S2：
ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG(SEQID NO.2)
S3：
ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC(SEQID NO.3)
S4：
ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG(SEQID NO.4)
2.复合物的合成
将TFNAs以200nM的浓度与不同比例的姜黄素(40μM，60μM，80μM，100μM，)在室温下均匀震荡6h合成。通过测定载药率，发现40μM时，TFNAs载药效率是最高的。
合成示意图如图1A所示。
3.验证
合成后的四面体骨架核酸，PAGE胶结果可见四面体骨架核酸大小约为180bp，可认为四面体骨架核酸已成功合成(图1C)。动态光散射结果可见，DNA四面体大小为15nm左右，与理论值相符(图1B)。
以下将以实验例的形式对本发明进一步说明。
实验例1细胞和动物模型实验
1.方法
1.1构建炎症模型
巨噬细胞炎症模型：取对数生长期的RAW264.7细胞分成5组：(1)Control：RAW264.7细胞在常规培养环境下培养；(2)LPS：RAW264.7细胞与1μg/mL LPS(脂多糖，下同)孵育24小时；(3)LPS+TFNAs：RAW264.7细胞用TFNAs(100nM)预培养1h，然后用LPS(1μg/mL)模拟培养24h；(4)LPS+Cur：RAW264.7细胞用Cur(20μM)预培养1h，然后用LPS(1μg/mL)模拟24h；(5)LPS+Cur-TFNAs：RAW264.7细胞用Cur-TFNAs(其中Cur：20μM，TFNAs:100nM)预培养1h，然后用LPS(1μg/mL)模拟培养24h。
动物模型：成年CD-1小鼠(雄性，18-22g)分成6组：(1)Sham组：在水合氯醛麻醉下，右踝关节注射20ul PBS，左踝关节注射生理盐水20ul；；(2)MSU组：在水合氯醛麻醉下，右踝关节注射0.5mg MSU(单钠尿酸盐)晶体(以20ul PBS为介质)，左踝关节注射生理盐水20ul；(3)MSU+TFNAs组：在水合氯醛麻醉下，在右踝关节部分注射TFNAs(50ul，200nM)，左踝关节注射等量生理盐水作为对照，1h后，右踝关节注射0.5mg MSU(单钠尿酸盐)晶体(以20ulPBS为介质)，左踝关节注射生理盐水20ul；(4)MSU+Cur组：在水合氯醛麻醉下，在右踝关节部分注射Cur(50ul，40μM)，左踝关节注射等量生理盐水作为对照，1h后，右踝关节注射0.5mg MSU(单钠尿酸盐)晶体(以20ul PBS为介质)，左踝关节注射生理盐水20ul；(5)MSU+CT组：在水合氯醛麻醉下，在右踝关节部分注射Cur-TFNAs(50ul，40μM Cur/200nM TFNAs)，左踝关节注射等量生理盐水作为对照，1h后，右踝关节注射0.5mg MSU(单钠尿酸盐)晶体(以20ul PBS为介质)，左踝关节注射生理盐水20ul；(6)MSU+CO组：，在水合氯醛麻醉下，在右踝关节部分注射CO(50ul，40μM)，左踝关节注射等量生理盐水作为对照，1h后，右踝关节注射0.5mg MSU(单钠尿酸盐)晶体(以20ul PBS为介质)，左踝关节注射生理盐水20ul。各组在术前及术后24小时用游标卡尺测量踝关节直径，并最终经过组织的固定、脱钙、包埋、切片、HE染色得到病理切片。
1.2 CCK8细胞毒性实验
将RAW264.7细胞分组培养于96孔板(5×103/孔)中，按1.1的方法进行分组处理。
再去除培养基，PBS冲洗一次，然后加入无血清DMEM培养基与10％(v/v)CCK-8溶液，在37℃孵育2小时后，在450nm波长下检测样品的OD值。
1.3细胞摄取TFNAs
将RAW264.7细胞接种于6孔板(2×105/孔)和12孔板(2×105/孔)中培养24h，然后用1％(v/v)FBS的高密度DMEM代替含10％(v/v)FBS的培养基进行饥饿培养。然后用20μMCur、100nm TFNAs或20μM Cur-TFNAs孵育4h，用PBS冲洗6孔板，收集流动管。进一步的流式细胞术分析用于获得流式细胞仪(FC500 Beckman，IL，USA)的细胞进入结果。12孔板细胞用PBS洗涤3次，用冷聚甲醛固定15分钟。再次洗涤后，用DAPI染色10分钟。最后，在超高分辨率双光子激光共聚焦显微镜(N-SIM，Nikon，Tokyo，Japan)下观察细胞载玻片。
1.4ELISA实验
用ELISA试剂盒检测细胞上清液中TNF-α和IL-6的含量。具体为：将6孔板(2×105/孔)中的RAW264.7细胞分为5组：(1)Control，(2)LPS，(3)LPS+TFNAs，(4)LPS+Cur，和(5)LPS+Cur-TFNAs。然后，分别处理后，收集上清液。酶联免疫吸附试验(ELISA)预试验结束后，将样品稀释10倍。首先按一定的浓度梯度对标准品进行稀释。然后，在洗板6次后，将样品和稀释后的标准品加入到孔板中。贴上封口膜，37℃孵育1h，洗涤后加入50μl酶标试剂培养30分钟。最后，再次清洗，分别加入显影剂和TMB终止液，间隔10-30分钟。结果在15分钟内得到。
1.5 ROS，SOD(超氧化物歧化酶)测定
用DCFH-DA法测定细胞内ROS水平。具体为：将RAW264.7细胞接种在12孔板(2×105/孔)中培养过夜。细胞饥饿后，按前一组处理24小时，用无血清高DMEM三次清洗后，在37℃下用DCFH-DA(1:1000)高浓度DEME培养20分钟，然后冲洗3次，去除残留的DCFH-DA。接下来，用含Hoechst(1:1000)的无血清高密度DMEM染色10分钟。随后，在显微镜下获得了ROS的荧光图像。
通过SOD试剂盒测定细胞培养上清液的SOD含量。
1.6 NO测定
巨噬细胞中iNOS产生的过量一氧化氮(NO)会导致组织破坏和炎症恶化。因此，用总一氧化氮检测试剂盒测定NO水平，分析炎症反应。收集细胞上清液后，用总一氧化氮检测试剂盒检测。具体为：将收集到的上清液离心后，按相应组别将50μl上清液加入制备的96孔板中，然后在室温下依次加入50μl Griess试剂I和50μl Griess试剂II。最后，在540nm处测定吸光度。
1.7 Westren blotting
总蛋白通过细胞裂解法提取，与5×loading缓冲液混合，加热10min(100℃)。各组样品经12％十二烷基硫酸钠PAGE处理后，转至聚偏氟乙烯膜。这些膜被5％脱脂牛奶在37℃浸泡1h和沉浸到初级抗体4℃过夜。用TBST(0.1％Tween-20,10mM Tris-base和100mMNaCl；pH 7.5)洗涤3次，二抗(1:2000；使用Abcam)孵育1h，然后使用凝胶-Blot成像系统对条带进行可视化，并使用ImageJ软件进行定量。
2.结果
2.1细胞对Cur、Cur-TFNAs的摄取
图2的结果可见，细胞对Cur-TFNAs的摄取明显高于对Cur的摄取。
2.2 cck8、ROS、SOD、NO结果
ROS(活性氧簇)是生物有氧代谢的一种副产品，某些因素刺激下，ROS会急剧增多，进而通过细胞氧化应激引起炎症反应。如图3A所示，LPS诱发对照组巨噬细胞产生炎症产生大量ROS，视野内ROS阳性率为100％，TFNAs预处理组(LPS+TFNAs)视野内ROS荧光阳性率约60％，Cur预处理的组别(LPS+Cur)ROS荧光阳性率约80％，而Cur-TFNAs预处理组(LPS+Cur-TFNAs)ROS荧光阳性率不到10％。Cur-TFNAs预处理组的ROS相比LPS组的降低程度明显高于TFNAs、Cur两组之和。
SOD能清除活性氧，反映了药物对身体抗氧化能力的影响，与ROS水平负相关，SOD越高，ROS则越低。如图3D所示，Cur-TFNAs预处理组的SOD水平相比LPS组有明显恢复，而TFNAs或Cur单独预处理则未能使SOD水平恢复。LPS+Cur-TFNAs组的抗氧化能力最强，也因此ROS呈现最弱的荧光。
由ROS和SOD可见，Cur-TFNAs复合物中TFNAs与Cur在抗氧化上具有协同增效作用。
正常情况下内皮源性NO具有抑制炎症反应的作用，病理情况下诱导型NO合成酶合成大量的NO则有细胞毒作用，加重炎症反应。本实验例的巨噬细胞炎症模型属于病理情况，模型组(LPS)的NO水平远高于对照组。图3B反映了NO水平检测结果，可见Cur-TFNAs预处理组的NO水平低于TFNAs或Cur预处理的组别。
图3C为cck8结果，用于体现Cur-TFNAs对细胞活性的保护作用，可知，Cur-TFNAs能显著预防LPS对细胞的损伤，有效剂量可低至10μM。
前述结果表明，Cur-TFNAs可降低ROS、NO两种介导炎症反应的物质的水平，保护细胞活性，有显著的抗炎活性。
2.3 TFNA对炎症因子的影响
TNF-a、IL-1β、IL-6是巨噬细胞产生的炎症因子，在痛风性关节炎关节损害过程扮演重要角色，患者血清中TNF-a、IL-1β、IL-6的水平与患者疼痛呈正相关的关系。且有研究认为，抑制IL-1β的水平有助于改善痛风结局。
图4AD是对IL-1β和IL-6免疫荧光的分析结果，可见TFNAs或Cur单独预处理对IL-1β和IL-6均无显著影响，但Cur-TFNAs预处理可对IL-1β和IL-6水平产生显著影响。图4BC是对分泌到细胞上清液中的TNF-a和IL-6的ELISA测定结果，可见TFNAs或Cur单独预处理对TNF-a和IL-6均无显著影响，但Cur-TFNAs预处理可对TNF-a和IL-6水平产生显著影响。图4EF和GH分别是细胞总蛋白中IL-1β和IL-6的wb条带展示及其定量分析结果，可见结果与图4AD类似，虽然Cur预处理也导致IL-6在一定程度下降，但降幅明显低于Cur-TFNAs预处理。
从图4BCFH还能看出，TFNAs、Cur单独处理相对于模型组的炎症因子水平降幅之和(图4F甚至出现TFNAs导致IL-β水平升高的情况)，明显低于Cur-TFNAs处理相对于模型组的炎症因子水平降幅。表明在炎症因子的释放和表达上，组成复合物Cur-TFNAs的Cur与TFNAs产生了协同增效作用。
上述结果表明，在炎症因子的释放和表达方面，Cur-TFNA预处理可显著减少炎症因子的释放，具有显著的抗炎作用。
2.4体内实验
如图5所示，A图是小鼠的大体观，左腿都注射生理盐水作为对照，右腿注射了MSU晶体及药物。可见所有小鼠右腿都较为肿胀，其中Cur-TFNA组肿胀要轻一些。B图是对踝关节HE染色结果图，可见到炎症细胞(炎症细胞的细胞核质比较大，而HE染色中，细胞核被染成蓝紫色，细胞质被染成红色)浸润。其中Cur-TFNA组(MSU+CT)和阳性药物秋水仙碱组(MSU+CO)炎症比TFNAs组(MSU+TFNAs)和Cur组(MSU+Cur)明显更轻。
体内实验结果表明，本发明的复合物能明显减弱痛风性关节炎的关节肿胀和炎症。
综上，本发明的Cur-TFNAs可以显著降低细胞ROS和NO的水平，减少炎症因子的表达和分泌，减轻痛风性关节炎。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种预防痛风性关节炎发作的药物
<130> GYKH1118-2020P0111679CC
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
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tcc 63