具体实施方式

本发明涉及包括对抗体、其片段、其变体或其组合进行编码的重组核酸序列的组合物。可以将组合物施用于有需要的受试者以促进合成抗体的体内表达和形成。

具体地，从重组核酸序列表达的重链多肽和轻链多肽可以组装成合成抗体。重链多肽和轻链多肽可以相互作用，使得组装导致合成抗体能够结合抗原，与没有如本文所述组装的抗体相比更具有免疫原性，并且能够引发或诱导针对抗原的免疫应答。

另外，与响应于抗原诱导的免疫应答而产生的抗体相比，这些合成抗体在受试者中产生得更快。合成抗体能够有效地结合和中和一系列抗原。合成抗体还能够有效地防止疾病和/或促进疾病的存活率。

在一方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物可以用于通过施用检查点抑制剂，如针对PD-1的经工程化或合成抗体(例如，呈合成DNA质粒形式的经工程化MAb；“DMAb”)来增加或增强免疫应答，即产生更有效的免疫应答。

关于呈合成DNA质粒形式的经工程化MAb，本发明涉及包括对抗体、其片段、其变体或其组合进行编码的重组核酸序列的组合物。可以将组合物施用于有需要的受试者以促进合成抗体的体内表达和形成。在一个实施例中，核苷酸序列包括本文所述的一个或多个核苷酸序列。在一个实施例中，核苷酸序列包括对SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6的多肽序列进行编码的序列或其变体或其片段。在一个实施例中，核苷酸序列包括从本文所述的DNA序列转录的RNA序列。例如，在一个实施例中，核苷酸序列包括由对SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6的多肽序列进行编码的DNA序列转录的RNA序列或其变体或其片段。

在一个实施例中，核苷酸序列对在氨基酸序列的整个长度上与选自组SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同一性的氨基酸序列进行编码。在一个实施例中，核苷酸序列对在氨基酸序列的整个长度上与选自组SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同一性的氨基酸序列的片段进行编码。

在一个实施例中，核苷酸序列在核苷酸序列的整个长度上与对SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中的一个或多个进行编码的一个或多个核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同一性。在一个实施例中，核苷酸序列是在核苷酸序列的整个长度上与对SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中的一个或多个进行编码的一个或多个核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％同一性的核苷酸序列的片段。

在一个实施例中，核苷酸序列在选自SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的组的至少一个核苷酸序列的整个长度内具有至少约80％同一性。在一些情况下，本发明的抗体包括对此类抗体进行编码的DNA序列，所述抗体至少包含免疫球蛋白的可变区。

在一些情况下，本发明的抗体可以与靶向检查点分子的一种或多种另外的抗体(例如，抗CTLA4抗体)组合施用以产生协同效应；然而，在其它情况下，抗体可以单独施用。

在一些情况下，本发明的抗体可以与包括如TERT等抗原的期望组合物组合施用以产生协同效应；然而，在其它情况下，抗体可以与包括抗原的组合物分开施用。

与不包含检查点抑制剂的疫苗相比，本发明的组合物可以通过增加CD8⁺T细胞应答来增加受试者对疫苗抗原的免疫应答。这种增加的CD8⁺T细胞应答具有溶细胞活性并且分泌细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)。

本文提供的组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。

本发明的各方面还包含通过向受试者施用本文提供的组合物中的任何组合物来增加有需要的受试者的免疫应答的方法。增加免疫应答的方法还可以包含电穿孔步骤。

1.定义

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在有冲突的情况下，将以本文件(包含定义)为准。本文描述了示例性方法和材料，但是与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体并入。本文所公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在是限制性的。

如本文所用，术语“包括(comprise(s))”、“包含(include(s))”、“具有(having)”、“具有(has)”“可以(can)”、“含有(contain(s))”和其变体旨在是不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡性短语、术语或词语。除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个/种(a)”、“和(and)”以及“所述(the)”包含复数指代物。本公开还设想了“包括”本文所呈现的实施例或元件、“由本文所呈现的实施例或元件组成”和“基本上由本文所呈现的实施例或元件组成”的其它实施例，无论是否明确地阐述。

“抗体”可以意指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类的抗体或片段、片段或衍生物，包含Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体和其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样本中分离的抗体，多克隆抗体，亲合纯化的抗体或其混合物，所述抗体或其混合物对期望的表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。

“抗原”是指能够在宿主中产生免疫应答的蛋白质。抗原可以由抗体识别和结合。抗原可以源自体内或外部环境。

“CDR”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，所述互补决定区氨基酸序列是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见例如，Kabat等人,具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第4版,美国卫生与公共服务部(Department of Health and Human Services),国家卫生研究院(National Institutesof Health)(1987)。在免疫球蛋白的可变部分中有三个重链CDR(或CDR区)和三个轻链CDR。因此，如本文所使用的，“CDR”是指所有三个重链CDR或者所有三个轻链CDR(如果合适的话，或者所有重链CDR和所有轻链CDR)。抗体的结构和蛋白质折叠可能意味着，其它残基被认为是抗原结合区的一部分，并且技术人员将会这样理解。参见例如Chothia等人,(1989)免疫球蛋白高变区的构象(Conformations of immunoglobulin hypervariable regions)；自然(Nature)342,第877-883页。

如本文可互换使用的“抗体片段”或“抗体的片段”是指包括抗原结合位点或可变区的完整抗体的部分。所述部分不包含完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3或CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽以及含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。

如本文所使用的，“佐剂”意指添加到本文所述的疫苗中以增强抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所使用的，“检查点抑制剂”意指如癌症免疫疗法领域通常理解的阻断免疫检查点的抑制剂或分子。更常见地，检查点抑制剂是阻断这些免疫检查点的抗体。

如本文所使用的，“编码序列”或“编码核酸”可以是指包括对如本文所阐述的抗体进行编码的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可以包括对RNA序列进行编码的DNA序列。编码序列可以进一步包含与调节元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调节元件包含能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中直接表达的启动子和聚腺苷酸化信号。编码序列可以进一步包含对信号肽进行编码的序列。

如本文所使用的，“补体”或“互补”可能意味着核酸可能在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间具有沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或胡格斯丁(Hoogsteen)碱基配对。

如本文所使用的，“恒定电流”定义组织或限定所述组织的细胞在递送到同一组织的电脉冲的持续时间内接收或经历的电流。电脉冲从本文所述的电穿孔装置递送。此电流在电脉冲的寿命内在所述组织中保持恒定的安培数，因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，其优选地具有瞬时反馈。反馈元件可以在整个脉冲持续时间内测量组织(或细胞)的电阻并且使电穿孔装置改变其电能输出(例如，增加电压)，因此，相同组织中的电流在整个电脉冲期间(按照微秒的顺序)并且从脉冲到脉冲保持恒定。在一些实施例中，反馈元件包括控制器。

本文使用的“电流反馈”或“反馈”可互换使用并且可以意指所提供的电穿孔装置的主动响应，其包括测量电极之间的组织电流并且相应地改变由EP装置递送的能量输出，以便将电流保持处于恒定水平。此恒定水平由用户在启动脉冲序列或电治疗之前预设。反馈可以由电穿孔装置的电穿孔组件(例如，控制器)来完成，因为其中的电路能够连续监测电极之间的组织电流并且将所监测的电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较，并且不断做出能量输出调节，以将所监测的电流保持处于预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为其是模拟闭环反馈。

如本文所使用的，“分散的电流”可以意指从本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流模式，其中所述模式最小化，或优选地消除在被电穿孔的任何组织区域上出现电穿孔相关的热应力。

本文中可互换地使用的“电穿孔，”“电透化”或“电动态增强”(“EP”)可以是指跨膜电场脉冲在生物膜中诱导显微途径(孔)的用途；显微途径的存在允许如质粒、寡核苷酸、siRNA、药品、离子和水等生物分子从细胞膜的一侧穿到另一侧。

如本文所使用的，“内源性抗体”可以指在受试者中产生的抗体，所述受试者被施用有效剂量的抗原以诱导体液免疫应答。

如本文所使用的，“反馈机制”可以指由软件或硬件(或固件)执行的过程，所述过程接收期望组织的阻抗(在递送能量脉冲之前、期间和/或之后)并将所述阻抗与预设值(优选地电流)进行比较，并且调节所递送的能量脉冲以实现预设值。反馈机制可以由模拟闭环电路执行。

“片段”可以意指用于，即可以与期望的靶标结合并且具有与全长抗体相同的预期效果的抗体的多肽的片段。在具有或不具有位于位置1处的信号肽和/或甲硫氨酸的每种情况下，抗体的片段可以与全长100％相同，除了从N和/或C端缺失至少一个氨基酸之外。片段可以包括特定全长抗体(不包含所添加的任何异源信号肽)的长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比。片段可以包括与抗体95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多相同的多肽的片段，并且另外包括在计算百分比同一性时不包含的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段可以进一步包括N端甲硫氨酸和/或信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可以与抗体片段连接。

在具有或不具有对位于位置1处的信号肽和/或甲硫氨酸进行编码的序列的每种情况下，对抗体进行编码的核酸序列的片段可以与全长100％相同，除了从5'和/或3'端缺失至少一个核苷酸。片段可以包括特定全长编码序列(不包含所添加的任何异源信号肽)的长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比。片段可以包括对与抗体95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多相同的多肽进行编码的片段，并且另外任选地包括对在计算百分比同一性时不包含的N端甲硫氨酸或异源信号肽进行编码的序列。片段可以进一步包括N端甲硫氨酸和/或信号肽(如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽)的编码序列。对N端甲硫氨酸和/或信号肽进行编码的编码序列可以与编码序列的片段连接。

如本文所使用的，“遗传构建体”是指包括对蛋白质(如抗体)进行编码的核苷酸序列的DNA或RNA分子。遗传构建体也可以是指转录RNA的DNA分子。编码序列包含与调节元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调节元件包含能够在施用核酸分子的个体的细胞中直接表达的启动子和聚腺苷酸化信号。如本文所使用的，术语“可表达形式”是指含有必需的调节元件的基因构建体，所述必需的调节元件与对蛋白质进行编码的编码序列可操作地连接，使得当存在于个体的细胞中时，将表达编码序列。

如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所使用的，“相同”或“同一性”可以意指序列在指定区域内具有相同的指定残基百分比。可以通过以下计算百分比：优化比对两个序列、比较指定区域内的两个序列、确定两个序列中出现相同残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、将匹配位置数除以指定区域中的总位置数以及将结果乘以100得出序列同一性的百分比。在两个序列长度不同或比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包含单个序列的情况下，单个序列的残基包含在分母中但不包含在计算的分子中。在比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可能被认为是等同的。可以手动或通过使用计算机序列算法(如BLAST或BLAST 2.0)执行同一性。

在讨论反馈机制时，可以使用本文使用的“阻抗”，并且可以根据欧姆定律将阻抗转换为电流值，从而实现与预设电流进行比较。

如本文所使用的“免疫应答”可以意指响应于一种或多种核酸和/或肽的引入而激活宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统。免疫应答可以呈细胞或体液应答的形式，或两者兼有。

如本文所使用的，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。对单链的描绘也定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以出于与给定核酸相同的目的而使用。因此，核酸还涵盖基本上相同的核酸和其补体。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链序列和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA两者)、RNA或杂交体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及包含尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基组合。可以通过化学合成法或通过重组方法获得核酸。

如本文所使用的，“可操作地连接”可以意指基因的表达是与其在空间上连接的启动子的控制下进行。启动子可以定位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)处。启动子与基因之间的距离可能与所述启动子与所述启动子在其来源的基因中控制的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的，可以在不损失启动子功能的情况下适应此距离的变化。

如本文所使用的，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接的序列并且可以是天然的、合成的或天然和合成的修饰或组合。

如本文所使用的，“启动子”可以意指能够赋予、激活或增强细胞中核酸的表达的合成或天然源性分子。启动子可以包括一个或多个具体转录调节序列以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包括远侧增强子或阻遏子元件，这些元件可以定位在与转录起始位点相距多达数千个碱基对处。启动子可以来源于包含病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官或相对于表达发生的发育阶段或响应于如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂等外部刺激而组成性地或差异性地调节基因组分的表达。启动子的代表性实例包含噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子和CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用并且是指可以在本文阐述的蛋白质的氨基端处连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文使用的信号肽/前导序列可以促使蛋白质从产生所述蛋白质的细胞中分泌。在从细胞中分泌时，信号肽/前导序列通常从通常被称为成熟蛋白质的蛋白质剩余部分切割。信号肽/前导序列在蛋白质的N端处连接。

如本文所用的“严格杂交条件”可以意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)如在核酸的复杂混合物中杂交的条件。严格条件取决于序列并且将在不同情况下会有所不同。严格条件可以在限定的离子强度pH下被选择为比具体序列的热熔点(T_m)低约5-10℃。T_m可以是50％的与靶标互补的探针在平衡时与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)(当靶序列存在过量时，在T_m处，在平衡时占据50％的探针)。严格条件可以是其中盐浓度在pH 7.0到8.3下小于约1.0M钠离子，如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)并且短探针(例如，约10-50个核苷酸)的温度为至少约30℃并且长探针(例如，大于约50个核苷酸)的温度为至少约60℃。严格条件还可以通过添加如甲酰胺等去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可能是背景杂交的至少2到10倍。示例性严格杂交条件包含以下：在42℃下温育的50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS或在65℃下温育的5x SSC、1％SDS，其中在65℃下于0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。

如本文中可互换使用的“受试者”和“患者”是指任何脊椎动物，包含但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如，猴子，如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人)。在一些实施例中，受试者可以是人或非人。受试者或患者可能正在进行其它形式的治疗。

如本文所使用的，“基本上互补”可以意指第一序列在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的补体至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。

如本文所使用的，“基本上相同”可以意指第一序列和第二序列在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内或相对于核酸至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，如果第一序列与第二序列的补体基本上互补的话。

如本文使用的，“合成抗体”是指由本文所述的重组核酸序列编码并且在受试者中产生的抗体。

如本文所使用的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏或完全消除疾病的方式来保护受试者免于疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向受试者施用本发明的疫苗。抑制疾病涉及在诱导疾病之后但在疾病的临床表现之前向受试者施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床表现之后向受试者施用本发明的疫苗。

本文所用的关于核酸的“变体”可以意指：(i)所引用的核苷酸序列的部分或片段；(ii)所引用的核苷酸序列或其部分的补体；(iii)与所引用的核酸或其补体基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与所引用的核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

关于肽或多肽的“变体”可以指示肽或多肽在氨基酸序列上因氨基酸的插入、缺失或保守取代而不同，但保留至少一种生物活性。变体还可以意指与具有氨基酸序列的保留至少一种生物活性的所引用的蛋白质基本上相同的具有氨基酸序列的蛋白质。氨基酸的保守取代，即用具有类似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸在本领域中被认为典型地涉及微小变化。如本领域所理解的，可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定这些微小变化。Kyte等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知具有类似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将产生保留生物学功能的蛋白质的取代基。在肽的上下文中对氨基酸亲水性的考虑允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，这是已经报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用测量。本文通过引用全部并入的美国专利第4,554,101号。如本领域所理解的，具有类似亲水性值的氨基酸的取代可以导致保留生物学活性(例如，免疫原性)的肽。可以用亲水性值处于彼此±2内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受到所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致，与生物学功能相容的氨基酸取代应理解为取决于氨基酸的相对类似性，并且尤其是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质所揭示的。

变体可以是在全基因序列或其片段的全长上基本上相同的核酸序列。核酸序列可以在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列可以在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

如本文所使用的“载体”可以意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体或掺入到宿主基因组中的载体。

对于本文列举数值范围，明确地考虑了在其之间具有相同的精确程度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，设想了数字7和8；并且对于范围6.0-7.0，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。无论范围的广度如何，这都适用。

2.组合物

本发明还包含用于产生抗体的用途的新颖序列。在一个实施例中，本发明的抗体可以在哺乳动物细胞中产生或用于在包含细菌、酵母以及病毒载体的DNA或RNA载体中递送。

本发明涉及一种包括对抗体、其片段、其变体或其组合进行编码的重组核酸序列的组合物。当施用于有需要的受试者时，组合物可以导致在受试者中产生合成抗体。合成抗体可以结合存在于受试者中的靶分子(即抗原，如PD-1)。此类结合可以中和抗原、阻断另一个分子(例如蛋白质或核酸)对抗原的识别以及引发或诱导对抗原的免疫应答。

在一个实施例中，组合物包括对合成抗体进行编码的核苷酸序列。在一个实施例中，组合物包括核酸分子，所述核酸分子包括对第一合成抗体进行编码的第一核苷酸序列和对第二合成抗体进行编码的第二核苷酸序列。在一个实施例中，核酸分子包括切割结构域进行编码的核苷酸序列。

在一个实施例中，核酸分子包括对一种或多种抗PD-1抗体进行编码的核苷酸序列。

在一个实施例中，对抗PD-1抗体进行编码的核苷酸序列包括对如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中所示的一个或多个氨基酸序列或如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中所示的一个或多个氨基酸序列的片段进行编码的一个或多个密码子优化的核酸序列。

在一个实施例中，核苷酸序列在选自SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的组的至少一个核苷酸序列的整个长度上具有至少约80％同一性。

在一个实施例中，对抗PD-1抗体进行编码的核苷酸序列包括从一个或多个DNA序列转录的一个或多个RNA序列，所述一个或多个DNA序列对与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中的一个或多个至少90％同源的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中的一个或多个至少90％同源的氨基酸序列的片段进行编码。在一个实施例中，对抗PD-1抗体进行编码的核苷酸序列包括从一个或多个DNA序列转录的一个或多个RNA序列，所述一个或多个DNA序列对如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中所示的氨基酸序列的片段进行编码。

在一个实施例中，对抗PD-1抗体进行编码的核苷酸序列包括与对SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中的一个或多个进行编码的一个或多个核酸序列至少90％同源的一个或多个密码子优化的核酸序列或与对SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6中的一个或多个进行编码的一个或多个核酸序列至少90％同源的核酸序列的片段。

本发明的组合物可以治疗、预防和/或防止与PD-1活性相关的任何疾病、病症或病状。在某些实施例中，组合物可以治疗、预防和/或防止癌症。

在一个实施例中，本发明的组合物与至少一种其它药剂(如抗原)组合提供。在一个实施例中，组合可以是单个调配物或可以是单独的调配物并按顺序施用(先抗原然后抗PD-1抗体，或先抗PD-1抗体然后抗原)。组合物可以增加受试者的抗原呈递和对抗原的整体免疫应答。抗原和抗PD-1抗体的组合比单独包括抗原的组合物更有效地诱导免疫系统。这种更有效的免疫应答在如癌症等疾病的治疗和/或预防中提供了增加的功效。

本发明的组合物可以包括检查点抑制剂。检查点抑制剂可以是一种或多种抗PD-1抗体。抗原可以是hTERT、mTERT、PSA、PSMA、STEAP、PSCA和PAP、WT1、酪氨酸酶、NYES01、PRAME和MAGE中的一种或多种。组合物的一种或多种检查点抑制剂和一种或多种抗原可以以核酸或多肽的形式一起或单独地施用于有需要的受试者。在一些情况下，所述一种或多种检查点抑制剂可以与组合物的一种或多种抗原单独施用。

组合物可以在至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时或96小时内导致在受试者中产生合成抗体。可以在向受试者施用所述一种或多种抗原之前或之后施用组合物。在一些实施例中，可以在向受试者施用所述一种或多种抗原之前或之后的至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或90天施用所述一种或多种检查点抑制剂。

在仍其它实施例中，可以在向受试者施用所述一种或多种抗原之前或之后的至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周施用所述一种或多种检查点抑制剂。在其它实施例中，可以在向受试者施用所述一种或多种抗原之前或之后约12小时到约15周、约12小时到约10周、约12小时到约5周、约12小时到约1周、约12小时到约60小时、约12小时到约48小时、约24小时到约15周、约60小时到约15周、约96小时到约15周、约1天到约15周、约5天到约15周、约10天到约15周、约15天到约15周、约20天到约15周、约25天到约15周、约30天到约15周、约1周到约15周、约5周到约15周或约10周到约15周施用所述一种或多种检查点抑制剂。

当施用于有需要的受试者时，组合物可以导致比在施用抗原以诱导体液免疫应答的受试者中产生内源性抗体更快地在受试者中产生合成抗体。所述组合物可以导致在施用抗原以诱导体液免疫应答的受试者中产生内源性抗体之前的至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天产生合成抗体。

本发明的组合物可以具有有效组合物所需的特征，如安全，使得组合物不会引起患病或死亡；防止患病；并且提供易于施用、副作用少、生物稳定性和每剂量低成本。组合物可以通过将所述一种或多种抗原与所述一种或多种检查点抑制剂(如本文讨论的抗PD-1抗体)组合来实现这些特征的一些或全部。

a.检查点抑制剂

检查点抑制剂可以是各种免疫检查点的任何拮抗剂，并且可以是阻断免疫检查点的抗体。抗体可以是包含Fab、单克隆或多克隆的蛋白质。抗体也可以是所编码的DNA表达构建体并且可以表达功能抗体。除了一种或多种抗原之外，疫苗可以进一步包括PD-1抗体。抗体可以是包含至少对免疫球蛋白的可变区进行编码的DNA序列的合成抗体。此类抗体可以通过鉴定或筛选与本文所述的与本文所述的抗原反应或结合的抗体来产生。鉴定或筛选抗体的方法可以使用本领域的技术人员已知的方法中的抗原来鉴定或筛选抗体。此类方法可以包含但不限于从文库中选择抗体(例如，噬菌体呈现)和使动物免疫，之后分离和/或纯化抗体。参见例如可在以其整体并入本文的Rajan,S.和Sidhu,S.,酶学方法(Methods inEnzymology),第502卷,第一章“简化的合成抗体文库(Simplified Synthetic AntibodyLibraries)”(2012)中获得的方法。

本发明的任何抗体还可以与一种或多种另外的检查点抑制剂抗体组合，所述一种或多种另外的检查点抑制剂抗体包含针对PD-L1、CTLA-4、LAG-3、GITR、CD40、OX40、TIM-3、4-1BB和其它中的一种或多种的抗体。检查点抑制剂可以是已知产品，例如伊匹单抗(ipilimumab)、替西利姆单抗(tremelimumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、BMS-936559(参见ClinicalTrials.gov标识符：NCT02028403)、MPDL3280A(罗氏(Roche)，参见ClinicalTrials.gov标识符：NCT02008227)、MDX1105-01(百时美施贵宝(Bristol MyersSquibb)，参见ClinicalTrials.gov标识符：NCT00729664)、MEDI4736(医学免疫(MedImmune)，参见ClinicalTrials.gov标识符：NCT01693562)和MK-3475(默克(Merck)，参见ClinicalTrials.gov标识符：NCT02129556)。

b.重组核酸序列

如上所述，组合物可以包括重组核酸序列。重组核酸序列可以对抗体、其片段、其变体或其组合进行编码。抗体在本文其它地方更详细地描述。

重组核酸序列可以是异源核酸序列。重组核酸序列可以包含一个或多个异源核酸序列。

重组核酸序列可以是优化的核酸序列。此类优化可以增加或改变抗体的免疫原性。优化还可以改善转录和/或翻译。优化可以包含以下各项中的一个或多个：用于增加转录的低GC含量前导序列；mRNA稳定性和密码子优化；添加kozak序列(例如，GCC ACC)以增加翻译；添加对信号肽进行编码的免疫球蛋白(Ig)前导序列；添加内部IRES序列并尽可能消除顺式作用序列基序(即内部TATA盒)。

c.重组核酸序列构建体

重组核酸序列可以包含一个或多个重组核酸序列构建体。重组核酸序列构建体可以包含一种或多种组分，其在本文中更详细地描述。

重组核酸序列构建体可以包含对重链多肽、其片段、其变体或其组合进行编码的异源核酸序列。重组核酸序列构建体可以包含对轻链多肽、其片段、其变体或其组合进行编码的异源核酸序列。重组核酸序列构建体还可以包含对蛋白酶或肽酶切割位点进行编码的异源核酸序列。重组核酸序列构建体还可包含对内部核糖体进入位点(IRES)进行编码的异源核酸序列。IRES可以是病毒IRES或真核IRES。重组核酸序列构建体可以包含一个或多个前导序列，其中每个前导序列对信号肽进行编码。重组核酸序列构建体可以包含一个或多个启动子、一个或多个内含子、一个或多个转录终止区、一个或多个起始密码子、一个或多个终止或停止密码子和/或一个或多个聚腺苷酸化信号。重组核酸序列构建体还可以包含一个或多个连接子或标签序列。标签序列可以对血凝素(HA)标签进行编码。

(1)重链多肽

重组核酸序列构建体可以包含对重链多肽、其片段、其变体或其组合进行编码的异源核酸。重链多肽可以包含可变重链(VH)区和/或至少一个恒定重链(CH)区。所述至少一个恒定重链区可以包含恒定重链区1(CH1)、恒定重链区2(CH2)和恒定重链区3(CH3)和/或铰链区。

在一些实施例中，重链多肽可以包含VH区和CH1区。在其它实施例中，重链多肽可以包含VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。

重链多肽可以包含互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以含有VH区的三个高变区。从重链多肽的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以有助于抗原的结合或识别。

(2)轻链多肽

重组核酸序列构建体可以包含对轻链多肽、其片段、其变体或其组合进行编码的异源核酸序列。轻链多肽可以包含可变轻链(VL)区和/或恒定轻链(CL)区。

轻链多肽可以包含互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以含有VL区的三个高变区。从轻链多肽的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以有助于抗原的结合或识别。

(3)蛋白酶切割位点

重组核酸序列构建体可以包含对蛋白酶切割位点进行编码的异源核酸序列。蛋白酶切割位点可以由蛋白酶或肽酶识别。蛋白酶可以是内肽酶或内切蛋白酶，例如但不限于弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、HtrA、钙蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。蛋白酶可以是弗林蛋白酶。在其它实施例中，蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或切割内部肽键(即不切割N端或C端肽键)的任何酶。

蛋白酶切割位点可以包含促进或增加切割效率的一个或多个氨基酸序列。所述一个或多个氨基酸序列可以促进或增加形成或产生离散多肽的效率。所述一个或多个氨基酸序列可以包含2A肽序列。

(4)连接子序列

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个连接子序列。连接子序列可以在空间上分离或连接本文所述的一种或多种组分。在其它实施例中，连接子序列可以对在空间上分离或连接两个或更多个多肽的氨基酸序列进行编码。

(5)启动子

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个启动子。所述一个或多个启动子可以是能够驱动基因表达和调节基因表达的任何启动子。此类启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件。用于指导基因表达的启动子的选择取决于特定应用。启动子可以定位于与重组核酸序列构建体中的转录起始点和与在其天然环境中的转录起始点相距约相同的距离。然而，可以在不损失启动子功能的情况下适应此距离的变化。

启动子可以与对重链多肽和/或轻链多肽进行编码的异源核酸序列可操作地连接。启动子可以是示出有效用于在真核细胞中表达的启动子。与编码序列可操作地连接的启动子可以是CMV启动子、来自猿猴病毒40(SV40)的启动子，如SV40早期启动子和SV40晚期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子，如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV立即早期启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus，EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子也可以是来自人基因的启动子，如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸、人多角体蛋白或人金属硫蛋白。

启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，其仅在宿主细胞暴露于某种特定外部刺激时才启动转录。在多细胞生物体的情况下，启动子还可以特异于特定组织或器官或发育阶段。启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例在美国专利申请公开第US20040175727号中描述，所述美国专利申请的内容以其整体并入本文。

启动子可以与增强子相关。增强子可以定位于编码序列的上游。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。多核苷酸功能增强在美国专利第5,593,972号、第5,962,428号和W094/016737中进行描述，每个专利的内容通过引用完全并入。

(6)内含子

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个内含子。每个内含子可以包含功能剪接供体和受体位点。内含子可以包含剪接增强子。内含子可以包含有效剪接所需的一个或多个信号。

(7)转录终止区

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个转录终止区。转录终止区可以定位于编码序列的下游以提供有效的终止。转录终止区可以从与本文描述的启动子相同的基因获得，或者可以从一个或多个不同的基因获得。

(8)起始密码子

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个起始密码子。起始密码子可以定位于编码序列的上游。起始密码子可以与编码序列同框。起始密码子可以与有效翻译起始所需的一个或多个信号(例如但不限于核糖体结合位点)相关。

(9)终止密码子

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个终止或停止密码子。终止密码子可以位于编码序列的下游。终止密码子可以与编码序列同框。终止密码子可以与有效翻译终止所需的一个或多个信号相关。

(10)聚腺苷酸化信号

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可以包含转录物的有效聚腺苷酸化所需的一个或多个信号。聚腺苷酸化信号可以定位于编码序列的下游。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA))的聚腺苷酸化信号。

(11)前导序列

重组核酸序列构建体可以包含一个或多个前导序列。前导序列可以对信号肽进行编码。信号肽可以是免疫球蛋白(Ig)信号肽，例如但不限于IgG信号肽和IgE信号肽。

d.重组核酸序列构建体的排列

如上文所述，重组核酸序列可以包含一个或多个重组核酸序列构建体，其中每个重组核酸序列构建体可以包含一种或多种组分。上文详细描述了所述一种或多种组分。当包含在重组核酸序列构建体中时，所述一种或多种组分可以相对于彼此以任何顺序排列。在一些实施例中，所述一种或多种组分可以排列在如本文所述的重组核酸序列构建体中。

(1)排列1

在一种排列中，第一重组核酸序列构建体可以包含对重链多肽进行编码的异源核酸序列，并且第二重组核酸序列构建体可以包含对轻链多肽进行编码的异源核酸序列。

第一重组核酸序列构建体可以置于载体中。第二重组核酸序列构建体可以置于第二载体或单独的载体中。本文更详细地描述了将重组核酸序列构建体置入载体中。

第一重组核酸序列构建体还可以包含启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。第一重组核酸序列构建体可以进一步包含前导序列，其中前导序列定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由前导序列编码的信号肽可以通过肽键与重链多肽连接。

第二重组核酸序列构建体还可以包含启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。第二重组核酸序列构建体可以进一步包含前导序列，其中前导序列定位于对轻链多肽进行编码的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由前导序列编码的信号肽可以通过肽键与轻链多肽连接。

因此，排列1的一个实例可以包含对包含VH和CH1的重链多肽进行编码的第一载体(并且因此第一重组核酸序列构建体)，以及对包含VL和CL的轻链多肽进行编码的第二载体(并且因此第二重组核酸序列构建体)。排列1的第二实例可以包含对包含VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽进行编码的第一载体(并且因此第一重组核酸序列构建体)，以及对包含VL和CL的轻链多肽进行编码的第二载体(并且因此第二重组核酸序列构建体)。

(2)排列2

在第二种排列中，重组核酸序列构建体可以包含对重链多肽进行编码的异源核酸序列和对轻链多肽进行编码的异源核酸序列。对重链多肽进行编码的异源核酸序列可以定位于对轻链多肽进行编码的异源核酸序列的上游(或5')。可替代地，对轻链多肽进行编码的异源核酸序列可以定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列的上游(或5')。

重组核酸序列构建体可以置于载体中，如本文更详细地描述。

重组核酸序列构建体可以包含对蛋白酶切割位点进行编码的异源核酸序列和/或连接子序列。如果包含在重组核酸序列构建体中，则对蛋白酶切割位点进行编码的异源核酸序列可以定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列与对轻链多肽进行编码的异源核酸序列之间。因此，蛋白酶切割位点允许在表达时将重链多肽和轻链多肽分离成不同的多肽。在其它实施例中，如果连接子序列包含在重组核酸序列构建体中，则连接子序列可以定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列与对轻链多肽进行编码的异源核酸序列之间。

重组核酸序列构建体还可以包含启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。重组核酸序列构建体可以包含一个或多个启动子。重组核酸序列构建体可以包含两个启动子，使得一个启动子可以与对重链多肽进行编码的异源核酸序列相关，并且第二启动子可以与对轻链多肽进行编码的异源核酸序列相关。在仍其它实施例中，重组核酸序列构建体可以包含与对重链多肽进行编码的异源核酸序列和对轻链多肽进行编码的异源核酸序列相关的一个启动子。

重组核酸序列构建体可以进一步包含两个前导序列，其中第一前导序列定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列的上游(或5')，并且第二前导序列定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由第一前导序列编码的第一信号肽可以通过肽键与重链多肽连接，并且由第二前导序列编码的第二信号肽可以通过肽键与轻链多肽连接。

因此，排列2的一个实例可以包含对包含VH和CH1的重链多肽和包含VL和CL的轻链多肽进行编码的载体(并且因此重组核酸序列构建体)，其中连接子序列定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列与对轻链多肽进行编码的异源核酸序列之间。

排列2的第二实例可以包含对包含VH和CH1的重链多肽和包含VL和CL的轻链多肽进行编码的载体(并且因此重组核酸序列构建体)，其中对蛋白酶切割位点进行编码的异源核酸序列定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列与对轻链多肽进行编码的异源核酸序列之间。

排列2的第三实例可以包含对包含VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽和包含VL和CL的轻链多肽进行编码的载体(并且因此重组核酸序列构建体)，其中连接子序列定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列与对轻链多肽进行编码的异源核酸序列之间。

排列2的第四实例可以包含对包含VH、CH1、铰链区、CH2和CH3的重链多肽和包含VL和CL的轻链多肽进行编码的载体(并且因此重组核酸序列构建体)，其中对蛋白酶切割位点进行编码的异源核酸序列定位于对重链多肽进行编码的异源核酸序列与对轻链多肽进行编码的异源核酸序列之间。

e.从重组核酸序列构建体的表达

如上文所述，在所述一种或多种组分中，重组核酸序列构建体可以包含对重链多肽进行编码的异源核酸序列和/或对轻链多肽进行编码的异源核酸序列。因此，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和/或轻链多肽的表达。

当利用如上文所述的排列1时，第一重组核酸序列构建体可以促进重链多肽的表达，而第二重组核酸序列构建体可以促进轻链多肽的表达。当利用如上文所述的排列2时，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和轻链多肽的表达。

在例如但不限于在细胞、生物体或哺乳动物中表达时，重链多肽和轻链多肽可以组装成合成抗体。具体地，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用，使得组装导致合成抗体能够结合抗原。在其它实施例中，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用，使得与未如本文所述组装的抗体相比，组装导致合成抗体更具免疫原性。在其它实施例中，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用，使得组装导致合成抗体能够引发或诱导针对抗原的免疫应答。

f.载体

上述重组核酸序列构建体可以置于一个或多个载体中。所述一个或多个载体可以含有复制起点。所述一个或多个载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。所述一个或多个载体可以是自我复制的染色体外的载体或掺入到宿主基因组中的载体。

载体包含但不限于质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等。“载体”包括可以感染、转染、瞬时地或永久地转导细胞的核酸。应认识到，载体可以是裸核酸或与蛋白质或脂质复合的核酸。载体任选地包括病毒或细菌核酸和/或蛋白质和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜等)。载体包含但不限于DNA片段可以连接并且被复制的复制子(例如，RNA复制子、噬菌体)。因此，载体包含但不限于RNA、自主自我复制的环形或线性DNA或RNA(例如，质粒、病毒等，参见例如美国专利第5,217,879号)，并且包含表达质粒和非表达质粒两者。在一些实施例中，载体包含线性DNA、酶促DNA或合成DNA。当重组微生物或细胞培养物被描述为具有“表达载体”时，这包含染色体外环形和线性DNA以及已掺入到一个或多个宿主染色体中的DNA。在载体由宿主细胞维持的情况下，载体可以在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定地复制，或者掺入到宿主的基因组中。

所述一个或多个载体可以是异源表达构建体，其通常是用于将特异性基因引入到靶细胞中的质粒。一旦表达载体位于细胞内，由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽由细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生。所述一个或多个载体可以表达大量稳定的信使RNA并且因此表达蛋白质。

(1)表达载体

所述一个或多个载体可以是环形质粒或线性核酸。环形质粒和线性核酸能够指导特定核苷酸序列在适当的受试者细胞中表达。包括重组核酸序列构建体的所述一个或多个载体可以是嵌合的，这意味着其组分中的至少一种组分相对于其它组分中的至少一种组分是异源的。

(2)质粒

所述一个或多个载体可以是质粒。质粒可用于用重组核酸序列构建体转染细胞。质粒可用于将重组核酸序列构建体引入到受试者中。质粒还可以包括调节序列，所述调节序列可以很好地适用于在施用质粒的细胞中的基因表达。

质粒还可以包括哺乳动物复制起点以在染色体外维持质粒并在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是来自英杰公司(加利福尼亚州圣地亚哥)的pVAX、pCEP4或pREP4，其可以包括爱泼斯坦巴尔病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，所述复制起点和编码区可以在没有掺入的情况下产生高拷贝附加型复制(high copy episomal replication)。质粒的骨架可以是pAV0242。质粒可以是复制缺陷型5型腺病毒(Ad5)质粒。

质粒可以是pSE420(加利福尼亚圣地亚哥，英杰公司)，其可以用于在大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中产生蛋白质。质粒还可以是p YES2(加利福尼亚圣地亚哥，英杰公司)，其可以用于在酵母的酿酒酵母菌株中产生蛋白质。质粒还可以是MAXBAC^TM完整的杆状病毒表达系统(加利福尼亚圣地亚哥，英杰公司)，其可以用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒还可以是pcDNAI或pcDNA3(加利福尼亚圣地亚哥，英杰公司)，其可以用于在如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等哺乳动物细胞中产生蛋白质。

(3)RNA

在一个实施例中，核酸是RNA分子。在一个实施例中，RNA分子从本文所述的DNA序列转录。例如，在一些实施例中，RNA分子由与对SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6之一进行编码的DNA序列至少90％同源的DNA序列或其变体或其片段编码。因此，在一个实施例中，本发明提供了对MAb或DMAb中的一种或多种进行编码的RNA分子。RNA可以是正链的。因此，在一些实施例中，RNA分子可以由细胞翻译，而无需任何中间复制步骤，如逆转录。可用于本发明的RNA分子可以具有5'帽(例如7-甲基鸟苷)。这种帽可以增强RNA的体内翻译。可用于本发明的RNA分子的5'核苷酸可以具有5'三磷酸基团。在加帽的RNA中，这可以通过5'到5'桥与7-甲基鸟苷连接。RNA分子可以具有3'聚-A尾。所述分子还可以在其3'端附近包含聚-A聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。可用于本发明的RNA分子可以是单链的。可用于本发明的RNA分子可以包含合成RNA。在一些实施例中，RNA分子是裸RNA分子。在一个实施例中，RNA分子包括在载体内。

在一个实施例中，RNA具有5'UTR和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR的长度介于0个与3000个核苷酸之间。要添加到编码区的5'UTR和3'UTR序列的长度可以通过包含但不限于设计用于与UTR的不同区域退火的PCR引物的不同的方法改变。使用这种方法，本领域的普通技术人员可以在转染转录的RNA后修改实现最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。

5'UTR和3'UTR可以是所关注基因的天然存在的内源性5'UTR和3'UTR。可替代地，可以通过将UTR序列掺入到正向引物和反向引物中或通过模板的任何其它修饰来添加对于所关注基因来说不是内源性的UTR序列。使用对于所关注基因来说不是内源性的UTR序列可用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，众所周知，3'UTR序列中富含AU的元素可以降低RNA的稳定性。因此，基于本领域公知的UTR的特性，可以选择或设计3'UTR以增加转录的RNA的稳定性。

在一实施例中，5'UTR可以含有内源性基因的Kozak序列。可替代地，当如上所述通过PCR添加对于所关注基因来说不是内源性的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列来重新设计共识Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并不是所有RNA都需要实现高效翻译。许多RNA对Kozak序列的要求是本领域已知的。在其它实施例中，5'UTR可以来源于RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施例中，可以在3'UTR或5'UTR中使用各种核苷酸类似物以阻止RNA的外切核酸酶降解。

在一个实施例中，RNA在5'端和3'聚(A)尾均具有帽，所述端和尾决定核糖体结合、翻译起始和RNA在细胞中的稳定性。

在一个实施例中，RNA是经过核苷修饰的RNA。经过核苷修饰的RNA比未经修饰的RNA具有特定优势，包含例如增加的稳定性、低或不存在先天免疫原性以及增强的翻译。

(4)环形和线性载体

所述一个或多个载体可以是一个或多个环形质粒，其可以通过掺入到细胞基因组中来转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其它表达载体。

本文还提供了线性核酸或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效地递送到受试者并且通过表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。LEC可以是缺乏任何磷酸骨架的任何线性DNA。LEC可以不含有任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可以不含有与期望基因表达无关的其它核酸序列。

LEC可以来源于能够线性化的任何质粒。质粒可以能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其它表达载体。质粒可以是pNP(波多黎各/34)或pM2(新喀里多尼亚/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其它表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别来源于pNP(波多黎各/34)和pM2(新喀里多尼亚/99)。

(5)病毒载体

在一个实施例中，本文提供了能够将本发明的核酸递送到细胞的病毒载体。可以将表达载体以病毒载体的形式提供到细胞。病毒载体技术是本领域公知的并且在例如Sambrook等人(2001)和Ausubel等人(1997)和其它病毒学和分子生物学手册中进行描述。可用作载体的病毒包含但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包括在至少一种生物体中有复制功能的起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择的标志物。(参见例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体已成为用于将基因插入到哺乳动物(例如人类细胞)中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。

(6)制备载体的方法

本文提供了一种用于制备其中已经放置重组核酸序列构建体的一个或多个载体的方法。在最后的亚克隆步骤之后，可以使用本领域已知的方法将载体用于在大规模发酵罐中接种细胞培养物。

在其它实施例中，在最后的亚克隆步骤之后，载体可以与一个或多个电穿孔(EP)装置一起使用。EP装置在本文中更详细地描述。

所述一个或多个载体可以使用已知装置和技术的组合来调配或制造，并且可以使用于2007年5月23日提交的美国临时申请美国序列号60/939,792中描述的质粒制造技术来制造。在一些实例中，本文所述的DNA质粒可以以大于或等于10mg/mL的浓度调配。除了美国序列号60/939792中描述的那些装置和方案，包含于2007年7月3日发布的美国专利第7,238,522号中描述的那些装置和方案，制造技术还包含或结合了本领域的普通技术人员公知的各种装置和方案。上文引用的申请和专利，分别是美国序列号60/939,792和美国专利第7,238,522号据此以其整体并入。

3.抗体

如本文所述，重组核酸序列可以对抗体、其片段、其变体或其组合进行编码。抗体可以与抗原结合或反应，这在本文中更详细地描述。

抗体可以包括分别插置于为CDR提供支撑并限定CDR相对于彼此的空间关系的重链与轻链框架(“FR”)组之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N端开始，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包含六个CDR，包括来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。

在施用本发明的组合物的受试者中，抗体可以治疗、预防和/或防止疾病，如癌症。通过结合抗原，抗体可以治疗、预防和/或防止施用组合物的受试者出现疾病。抗体可以促进在施用组合物的受试者中的疾病存活率。在一个实施例中，与未施用抗体的患有疾病的受试者的预期存活率相比，所述抗体可以增加受试者的疾病存活率。在各个实施例中，与在缺少组合物下的预期存活率相比，所述抗体可以使施用组合物的受试者的疾病存活率增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一个实施例中，与未施用抗体的受试者的预期保护相比，所述抗体可以提供对受试者的疾病增强的保护。在各个实施例中，与在缺少组合物下的预期保护相比，所述抗体可以防止至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的施用组合物的受试者出现疾病。

蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生若干片段，所述片段(F(ab)片段)中的两个片段各自包括包含完整抗原结合位点的共价异源二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供若干片段，包含包括两个抗原结合位点的F(ab')₂片段。因此，抗体可以是Fab或F(ab')₂。Fab可以包含重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可以包含VH区和CH1区。Fab的轻链可以包含VL区和CL区。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包含重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包含VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包含VL区和CL区。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的抗体，所述抗体结合具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的期望的抗原。

抗体可以是如本文更详细地描述的双特异性抗体。抗体可以是也如本文更详细地描述的双功能抗体。

如上所述，可以在向受试者施用组合物时在受试者中产生抗体。抗体在受试者中可能具有半衰期。在一些实施例中，可以修饰抗体以延长或缩短其在受试者中的半衰期。此类修改在本文中更详细地描述。

抗体可以如本文中更详细描述的去岩藻糖基化。

可以修饰抗体以减少或预防与抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ADE)，如本文更详细地描述。

a.双特异性抗体

重组核酸序列可以对双特异性抗体、其片段、其变体或其组合进行编码。双特异性抗体可以与两种抗原(例如本文中更详细描述的两种抗原)结合或反应。双特异性抗体可以包含本文所述抗体中的两种抗体的片段，由此允许双特异性抗体与两个期望的靶分子结合或反应，所述靶分子可以包含本文更详细地描述的抗原、配体(包含受体的配体)、受体(包含受体上的配体结合位点)、配体-受体复合物和标记物(包含癌症标记物)。

b.双功能抗体

重组核酸序列可以对双功能抗体、其片段、其变体或其组合进行编码。双功能抗体可以与本文所述的抗原结合或反应。还可以修饰双功能抗体以赋予抗体超出对抗原的识别和与抗原结合的另外的功能。此类修饰可以包含但不限于与因子H或其片段偶联。因子H是补体激活的可溶性调节剂，并且因此可以通过补体介导溶解(CML)帮助免疫应答。

c.延长抗体半衰期

如上文所述，可以修饰抗体以延长或缩短抗体在受试者中的半衰期。修饰可以延长或缩短抗体在受试者的血清中的半衰期。

修饰可以存在于抗体的恒定区中。修饰可以是抗体的恒定区中的一个或多个氨基酸取代，与不含有所述一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比，所述一个或多个氨基酸取代延长了抗体的半衰期。修饰可以是抗体的CH2结构域中的一个或多个氨基酸取代，与不含有所述一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比，所述一个或多个氨基酸取代延长了抗体的半衰期。

在一些实施例中，恒定区中的所述一个或多个氨基酸取代可以包含将恒定区中的甲硫氨酸残基替换为酪氨酸残基、将恒定区中的丝氨酸残基替换为苏氨酸残基、将恒定区中的苏氨酸残基替换为谷氨酸残基或其任何组合，由此延长抗体的半衰期。

在其它实施例中，恒定区中的所述一个或多个氨基酸取代可以包含将CH2结构域中的甲硫氨酸残基替换为酪氨酸残基、将CH2结构域中的丝氨酸残基替换为苏氨酸残基、将CH2结构域中的苏氨酸残基替换为谷氨酸残基或其任何组合，由此延长抗体的半衰期。

d.去岩藻糖基化

重组核酸序列可以对未岩藻糖基化的抗体(即去岩藻糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体)、其片段、其变体或其组合进行编码。岩藻糖基化包含将糖岩藻糖添加到分子中，例如，将岩藻糖与N-聚糖、O-聚糖和糖脂连接。因此，在去岩藻糖基化抗体中，岩藻糖不与恒定区的糖链连接。进而，与岩藻糖基化抗体相比，这种岩藻糖基化的缺乏可以提高抗体对FcγRIIIa的结合和针对抗体的细胞毒(ADCC)活性。因此，在一些实施例中，与岩藻糖基化抗体相比，非岩藻糖基化抗体可能表现出增加的ADCC活性。

可以修饰抗体以预防或抑制抗体的岩藻糖基化。在一些实施例中，与未经修饰的抗体相比，此类经过修饰的抗体可能表现出增加的ADCC活性。修饰可以在重链、轻链或其组合中。修饰可以是重链中的一种或多种氨基酸取代，轻链中的一种或多种氨基酸取代或其组合。

e.降低的ADE应答

可以修饰抗体以减少或预防与抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ADE)，但仍然中和抗原。

在一些实施例中，可以修饰抗体以包含减少或预防抗体与FcγR1a结合的一种或多种氨基酸取代。所述一个或多个氨基酸取代可以在抗体的恒定区中。所述一种或多种氨基酸取代可以包含在抗体的恒定区中用丙氨酸残基替换亮氨酸残基，即本文中也称为LA、LA突变或LA取代。所述一种或多种氨基酸取代可以包含在抗体的恒定区中用丙氨酸残基各自替代两个亮氨酸残基，并且在本文中也称为LALA、LALA突变或LALA取代。LALA取代的存在可以预防或阻断抗体与FcγR1a结合，并且因此，经过修饰的抗体不增强或引起与抗原相关的疾病的ADE，但仍然中和抗原。

4.单克隆抗体

在一个实施例中，本发明提供了抗PD-1抗体。所述抗体可以是完整的单克隆抗体和免疫活性片段(例如，Fab或(Fab)₂片段)、单克隆抗体重链或单克隆抗体轻链。

抗体可以包括分别插置于为CDR提供支撑并限定CDR相对于彼此的空间关系的重链与轻链框架(“FR”)组之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N端开始，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包含六个CDR，包括来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包含重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包含VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包含VL区和CL区。

5.产生合成抗体的方法

本发明还涉及产生合成抗体的方法。所述方法可以包含通过使用本文更详细描述的递送方法向有需要的受试者施用所述组合物。因此，在向受试者施用组合物时，在受试者中或体内产生合成抗体。

所述方法还可以包含将组合物引入到一个或多个细胞中，并且因此，可以在所述一个或多个细胞中产生(generate)或产生(produce)合成抗体。所述方法可以进一步包含将组合物引入到所述一个或多个组织(例如，但不限于皮肤和肌肉)中，并且因此，可以在所述一个或多个组织中产生或产生合成抗体。

6.癌抗原

本发明的组合物和方法可以与抗原或其片段或变体组合使用。

标记是相对于某些癌细胞存在或上调的已知的蛋白质。通过产生表示此类标志物打破对自身的耐受性的抗原的方法，可以产生癌症疫苗。此类癌症疫苗可以包含用于增强免疫应答的一种或多种检查点抑制剂。

本发明的各方面包含用于增强针对有需要的受试者的抗原的免疫应答的组合物，所述组合物包括与能够在受试者中产生免疫应答的合成抗原的合成抗体或其生物功能片段或变体。在一些实施例中，抗原包括mTERT。在一些实施例中，抗原包括hTERT。

合成抗原可以是对抗原进行编码的分离的DNA。在一个实施例中，抗原是肿瘤相关的表面抗原。肿瘤相关的表面抗原的说明性实例是CD10、CD19、CD20、CD22、CD33、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her2neu、Her3、IGFR、CD133、IL3R、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CDCP1、Derlin1、生腱蛋白、卷曲蛋白1-10、血管抗原VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4，CD309)，PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)内皮糖蛋白、CLEC14、Tem1-8和Tie2。另外的实例可以包含A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐酶IX(CarboanhydraseIX，MN/CA IX)、CD21、CD25、CD30、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、de2-7 EGFR、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、叶酸结合蛋白、G250、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑色素瘤相关的细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)和TAG-72。在肿瘤的细胞外基质上表达的抗原的实例是生腱蛋白和成纤维细胞激活蛋白(FAP)。

在一个实施例中，合成抗原可以选自包含以下的组：hTERT、PSA、PSMA、STEAP、PSCA和PAP、WT1、酪氨酸酶、NYES01、PRAME和MAGE。以下是一些示例性癌抗原：

a.hTERT

hTERT是在端粒末端上合成TTAGGG标签以防止由于染色体缩短而导致的细胞死亡的人端粒酶逆转录酶。hTERT异常高表达的过度增殖性细胞可以通过免疫疗法靶向。最近的研究表明，在用hTERT基因转染的树突细胞中的hTERT表达可以诱导CD8+细胞毒性T细胞并且以抗原特异性方式引发CD4+T细胞。

hTERT可以在本文所述的载体中施用，并在各种疫苗接种方案(包含本文实例中的方案)中与检查点抑制剂组合。

b.前列腺抗原

以下是能够针对前列腺抗原引发哺乳动物的免疫应答的抗原。共识抗原可以包括使其特别有效的表位，因为可以诱导针对前列腺癌细胞的免疫原。共识前列腺抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。

前列腺抗原可以包含以下各项中的一种或多种：PSA抗原、PSMA抗原、STEAP抗原、PSCA抗原、前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原和其它已知的前列腺癌标志物。蛋白质可以包括与前列腺抗原同源的序列、前列腺抗原的片段和具有与前列腺抗原的片段同源的序列的蛋白质。

前列腺抗原可以在本文所述的载体中施用，并在各种疫苗接种方案(包含本文实例中的方案)中与检查点抑制剂组合。

c.WT1

抗原可以是维尔姆氏肿瘤(Wilm's tumor)抑制基因1(WT1)、其片段、其变体或其组合。WT1是在N端处含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合结构域和在C端处含有四个锌指基序的转录因子。WT1在泌尿生殖系统的正常发育中发挥作用并且与许多因子相互作用，例如，p53(一种已知的肿瘤抑制因子)和在用细胞毒性药物治疗后在多个位点处切割WT1的丝氨酸蛋白酶HtrA2。

WT1的突变可以导致肿瘤或癌症的形成，例如维尔姆氏肿瘤或表达WT1的肿瘤。在转移到其它组织(例如但不限于肝组织、尿路系统组织、淋巴组织和肺组织)之前，维尔姆氏肿瘤通常在一个或两个肾脏中形成。因此，维尔姆氏肿瘤可以被认为是转移性肿瘤。维尔姆氏肿瘤通常发生在年幼的儿童(例如，小于5岁)中并且呈散发性和遗传性两种形式。因此，所述疫苗可以用于治疗患有维尔姆氏肿瘤的受试者。所述疫苗还可以用于治疗患有表达WT1的癌症或肿瘤的受试者，以防止此类肿瘤在受试者中的发育。WT1抗原可以不同于天然的、“正常”的WT1基因，并且因此可以提供针对表达WT1抗原的肿瘤的疗法或预防。蛋白质可以包括与WT1抗原同源的序列、WT1抗原的片段和具有与WT1抗原的片段同源的序列的蛋白质。

WT1抗原可以在本文所述的载体中施用，并在各种疫苗接种方案(包含本文实例中的方案)中与检查点抑制剂组合。

d.酪氨酸酶抗原

抗原酪氨酸酶(Tyr)抗原是通过以下进行免疫介导清除的重要靶标：(1)通过B细胞应答诱导体液免疫以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生的抗体，由此阻止骨髓源性抑制细胞(MDSC)并且抑制肿瘤生长；(2)增加如CD8⁺(CTL)等细胞毒性T淋巴细胞以攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞应答；(4)并且通过IFN-γ和TFN-α或前面提到的全部来增加炎性反应。

酪氨酸酶是可以在植物和动物组织中找到的含铜酶。酪氨酸酶通过如酪氨酸等苯酚的氧化来催化黑色素和其它色素的产生。在黑色素瘤中，酪氨酸酶可能不受调节，从而导致黑色素合成增加。酪氨酸酶也是患有黑色素瘤的受试者中细胞毒性T细胞识别的靶标。因此，酪氨酸酶可以是与黑色素瘤相关的抗原。

抗原可以包括蛋白质表位，所述蛋白质表位使其作为针对可以诱导抗Tyr免疫应答的免疫原特别有效。Tyr抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。

Tyr抗原可以包括共识蛋白。Tyr抗原诱导抗原特异性T细胞应答和高滴度抗体应答，两者均全身性地针对所有癌症和肿瘤相关的细胞。如此，由包括Tyr共识抗原的疫苗提供针对肿瘤形成的保护性免疫应答。因此，任何用户都可以将本发明的疫苗设计为包含Tyr抗原以提供针对肿瘤形成、肿瘤转移和肿瘤生长的广泛免疫。蛋白质可以包括与Tyr抗原同源的序列、Tyr抗原的片段和具有与Tyr抗原的片段同源的序列的蛋白质。

Tyr抗原可以在本文所述的载体中施用，并在各种疫苗接种方案(包含本文实例中的方案)中与检查点抑制剂组合。

e.NYES01

NY-ESO-1是在各种癌症中表达的癌症-睾丸抗原，在所述癌症中，其可以诱导细胞免疫和体液免疫两者。基因表达研究表明，NY-ESO-1、CTAG1B基因在粘液样和圆细胞脂肪肉瘤中上调。蛋白质可以包括与NYES01抗原同源的序列、NYES01抗原的片段和具有与NYES01抗原的片段同源的序列的蛋白质。

NYES01抗原可以在本文所述的载体中施用，并在各种疫苗接种方案(包含本文实例中的方案)中与检查点抑制剂组合。

f.PRAME

在肿瘤中优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME抗原)是在人类中由PRAME基因编码的蛋白质。此基因对主要在人黑色素瘤中表达并且由溶细胞性T淋巴细胞识别的抗原进行编码。除睾丸外，此基因在正常组织中不表达。所述基因也在急性白血病中表达。已经观察此基因的对同一蛋白质进行编码的五种替代剪接的转录物变体。蛋白质可以包括与PRAME抗原同源的序列、PRAME抗原的片段和具有与PRAME抗原的片段同源的序列的蛋白质。

PRAME抗原可以在本文所述的载体中施用，并在各种疫苗接种方案(包含本文实例中的方案)中与检查点抑制剂组合。

g.MAGE

MAGE代表黑色素瘤相关抗原，并且具体地是黑色素瘤相关抗原4(MAGEA4)。MAGE-A4在各种组织学类型的雄性生殖细胞和肿瘤细胞(如胃肠癌、食管癌和肺癌)中表达。MAGE-A4结合癌蛋白Gankyrin。这种MAGE-A4特异性结合是由其C端介导的。研究表明，外源性MAGE-A4可以在体外部分地抑制Gankyrin过度表达细胞的非粘附依赖性生长，并且抑制迁移肿瘤在裸鼠中的这些细胞中的形成。这种抑制作用取决于MAGE-A4与Gankyrin之间的结合，这表明Gankyrin与MAGE-A4之间的相互作用抑制了Gankyrin介导的致癌作用。肿瘤组织中的MAGE表达很可能不是肿瘤发生的原因而是结果，并且MAGE基因通过靶向早期肿瘤细胞进行破坏来参与到免疫过程中。

黑色素瘤相关抗原4蛋白(MAGEA4)可以参与胚胎发育和肿瘤转化和/或进展。MAGEA4通常在睾丸和胎盘中表达。然而，MAGEA4可以在许多不同类型的肿瘤(例如黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、肺癌和乳腺癌)中表达。因此，MAGEA4可以是与各种肿瘤相关的抗原。

MAGEA4抗原可以诱导抗原特异性T细胞应答和/或高滴度抗体应答，由此诱导或引发针对表达抗原的癌症或肿瘤或与其反应的免疫应答。在一些实施例中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞应答、体液应答或细胞应答和体液免疫应答两者。在一些实施例中，诱导或引发的细胞免疫应答可以包含干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施例中，诱导或引发的免疫应答可以减少或抑制促进表达抗原的肿瘤或癌症生长的一种或多种免疫抑制因子，例如但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)、PD-L1、FasL、如IL-10和TFG-β等细胞因子、肿瘤相关的巨噬细胞、肿瘤相关的成纤维细胞的因子。

MAGEA4抗原可以包括蛋白质表位，所述蛋白质表位使其作为针对可以诱导抗MAGEA4免疫应答的免疫原特别有效。MAGEA4抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。MAGEA4抗原可以包括共识蛋白。

对共识MAGEA4抗原进行编码的核酸序列可以在密码子使用和相应的RNA转录物方面进行优化。对共识MAGEA4抗原进行编码的核酸可以是针对表达而优化的密码子和RNA。在一些实施例中，对共识MAGEA4抗原进行编码的核酸序列可以包含Kozak序列(例如，GCCACC)以提高翻译效率。对共识MAGEA4抗原进行编码的核酸可以包含多个停止密码子(例如，TGA TGA)以提高翻译终止的效率。

MAGE抗原可以在本文所述的载体中施用，并在各种疫苗接种方案(包含本文实例中的方案)中与检查点抑制剂组合。

h.肿瘤抗原

在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性病状抗原”或“与过度增殖性病状相关的抗原”是指如癌症等特异性过度增殖性病状常见的抗原。本文讨论的抗原仅通过举例包含在内。列表并不旨在是排他性的，并且另外的实例对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。

肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，所述蛋白质引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。本发明的抗原结合部分的选择可以取决于待治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域公知的，并且包含例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、α-胎甲球蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺(prostase)、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、蛋白质(prostein)、PSMA、Her2/神经鞘、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

在一个实施例中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一种或多种抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达可以充当免疫攻击的靶抗原的许多蛋白质。这些分子包含但不限于组织特异性抗原，如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP 100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子组，如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。又另一组靶抗原是癌胚胎抗原，如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了单个肿瘤所特有的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原如CD19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选物。这些抗原中的一些抗原(CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)已被用作利用单克隆抗体进行的被动免疫疗法的靶标，但成功率有限。

本发明中提及的肿瘤抗原的类型还可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞独有的并且不会发生在体内其它细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独有的，而是在不能诱导针对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可以是当免疫系统不成熟并且无法应答时在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者可以是在正常细胞上通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。

TSA或TAA抗原的非限制性实例包含以下：分化抗原，如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多向性抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过度表达的胚胎抗原，如CEA；过度表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER-2/neu；染色体易位导致的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA和人乳头状瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它基于蛋白质的大抗原包含TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎甲球蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

7.组合物的赋形剂和其它组分

组合物可以进一步包括药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，如媒剂、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包含表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freunds incompleteadjuvant)、包含单磷酰脂质A的LPS类似物、胞壁酰肽、醌类似物、如鲨烯和鲨烯等囊泡、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包含聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸，并且聚-L-谷氨酸可以以小于6mg/ml的浓度存在于组合物中。转染促进剂还可以包含表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、包含单磷酰脂质A的LPS类似物、胞壁酰肽、醌类似物和如鲨烯和鲨烯等囊泡，并且透明质酸还可以与组合物组合施用。组合物还可以包含转染促进剂，如脂质、脂质体，包含卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包含聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。组合物中转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

除了本发明的检查点抑制剂抗体之外，药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。另外的佐剂可以是在替代质粒中表达或作为蛋白质与组合物中的上述质粒组合递送的其它基因。佐剂可以选自由以下组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包含具有缺失的信号序列的IL-15并且任选地包含来自IgE的信号肽。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、PD-1、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

除了本发明的抗体外可用作佐剂的其它基因包含对以下进行编码的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2和其功能片段。

组合物可以进一步包括如于1994年4月1日提交的美国序列号021,579中描述的遗传促进剂，所述文献通过引用完全并入。

组合物可以包括量为约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；或优选地约0.1微克到约10毫克；或更优选地约1毫克到约2毫克的DNA。在一些优选的实施例中，根据本发明的组合物包括约5纳克到约1000微克的DNA。在一些优选的实施例中，组合物可以含有约10纳克到约800微克的DNA。在一些优选的实施例中，组合物可以含有约0.1到约500微克的DNA。在一些优选的实施例中，组合物可以含有约1到约350微克的DNA。在一些优选的实施例中，组合物可以含有约25到约250微克、约100到约200微克、约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；约0.1微克到约10毫克；约1毫克到约2毫克、约5纳克到约1000微克、约10纳克到约800微克、约0.1到约500微克、约1到约350微克、约25到约250微克、约100到约200微克的DNA。

所述组合物可以根据所使用的施用方式进行调配。可注射药物组合物可以是无菌、无热原和无颗粒的。可以使用等渗调配物或溶液。等渗性添加剂可以包含氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。组合物可以包括血管收缩剂。等渗溶液可以包含磷酸盐缓冲盐水。组合物可以进一步包括包含明胶和白蛋白的稳定剂。稳定剂可以使包含LGS或聚阳离子或聚阴离子的调配物在室温或环境温度下在延长的时间段稳定。

8.疫苗接种方法

本发明还涉及一种增加受试者的免疫应答的方法。增加免疫应答可用于治疗和/或预防受试者的疾病。所述方法可以包含向受试者施用本文公开的疫苗。与单独施用抗原的受试者相比，施用疫苗的受试者可以具有增加或提升的免疫应答。在一些实施例中，免疫应答可以增加约0.5倍到约15倍、约0.5倍到约10倍或约0.5倍到约8倍。可替代地，施用疫苗的受试者的免疫应答可以增加至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍或至少约15.0倍。

在仍其它替代性实施例中，施用疫苗的受试者的免疫应答可以增加约50％到约1500％、约50％到约1000％或约50％到约800％。在其它实施例中，施用疫苗的受试者的免疫应答可以增加至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1050％、至少约1100％、至少约至少约1150％、至少约1200％、至少约1250％、至少约1300％、至少约1350％、至少约1450％或至少约1500％。

疫苗剂量可以介于1μg与10mg活性组分/kg体重/次，并且可以为20μg到10mg组分/kg体重/次。疫苗可以每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天施用。用于有效治疗的疫苗剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

9.组合物的递送方法

本发明还涉及一种将组合物递送到有需要的受试者的方法。所述递送方法可以包含向受试者施用组合物。施用可以包含但不限于，利用或不利用体内电穿孔的DNA注射、脂质体介导的递送和纳米颗粒促进的递送。

接受组合物递送的哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、奶牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。

组合物可以通过包含以下的不同途径施用：口服、肠胃外、舌下、经皮、直肠、经粘膜、局部、通过吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。对于兽医用途，组合物可以根据正常兽医实践作为合适地可接受的调配物施用。兽医可以很容易地确定最适合用于特定动物的给药方案和施用途径。组合物可以通过传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其它物理方法如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声施用。

a.电穿孔

可以使用可以被配置成向哺乳动物的期望组织递送有效用于使可逆孔在细胞膜中形成的能量脉冲的电穿孔装置来实现通过电穿孔的组合物施用，并且优选地所述能量脉冲是与用户输入的预设电流类似的恒定电流。电穿孔装置可以包括电穿孔组件和电极组合件或手柄组合件。电穿孔组件可以包含并结合电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包含：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件、电源和电力开关。可以使用体内电穿孔装置，例如CELLECTRA EP系统(Inovio制药公司(Inovio Pharmaceuticals)，费城普利茅斯会议(Plymouth Meeting,PA))或Elgen电穿孔仪(Inovio制药公司，费城普利茅斯会议)来实现电穿孔，以促进质粒转染细胞。

电穿孔组件可以用作电穿孔装置的一个元件，而其它元件是与电穿孔组件连通的单独的元件(或组件)。电穿孔组件可以用作电穿孔装置的多于一个元件，其可以与电穿孔装置的与电穿孔组件分开的仍其它元件连通。作为一种机电或机械装置的部分存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为所述元件可以用作一个装置或相互连通的单独的元件。电穿孔组件可以能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包含反馈机制。电极组合件可以包含具有在空间排列中的多个电极的电极阵列，其中电极组合件从电穿孔组件接收能量脉冲并通过电极将其递送到期望组织。所述多个电极中的至少一个电极在能量脉冲的递送期间是中性的，并且测量期望组织中的阻抗并将阻抗传送到电穿孔组件。反馈机制可以接收所测量的阻抗并且可以调节由电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。

多个电极可以以分散的模式递送能量脉冲。所述多个电极可以通过按照程序性序列控制电极以分散的模式递送能量脉冲，并且程序性序列由用户输入到电穿孔组件。程序性序列可以包括按顺序递送的多个脉冲，其中所述多个脉冲中的每个脉冲由具有一个测量阻抗的中性电极的至少两个有源电极递送，并且其中所述多个脉冲中的后续脉冲由具有一个测量阻抗的中性电极的至少两个有源电极中的不同的一个电极递送。

反馈机制可以由硬件或软件来执行。反馈机制可以由模拟闭环电路执行。反馈每50微秒、20微秒、10微秒或1微秒发生一次，但优选地是实时反馈或瞬时的(即，如由用于确定响应时间的可用技术确定的，基本上是瞬时的)。中性电极可以测量期望组织中的阻抗并且将阻抗传达到反馈机制，并且反馈机制响应于阻抗并调节能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流类似的值下。反馈机制可以在能量脉冲的传递期间持续且瞬时地维持恒定电流。

可以促进本发明的组合物的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包含Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号、由Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630中描述的那些电穿孔装置和方法，所述专利的内容据此通过引用以其整体并入。可以用于促进组合物的递送的其它电穿孔装置和电穿孔方法包含于2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的那些电穿孔装置和方法，所述美国专利申请根据35USC 119(e)要求于2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和于2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982的权益，所述美国临时申请中的全部美国临时申请据此以其整体并入。

Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号描述了模块化电极系统和其用于促进生物分子引入身体或植物中的所选组织的细胞中的用途。模块化电极系统可以包括多个针电极；皮下注射针；电连接器，所述电连接器提供了从可编程恒流脉冲控制器到所述多个针电极的导电连接；和电源。操作者可以握住安装在支撑结构上的所述多个针电极并且将其牢固地插入身体或植物中的所选组织中。然后通过皮下注射针将生物分子递送到所选组织中。激活可编程恒流脉冲控制器并且向所述多个针电极施加恒流电脉冲。施加的恒流电脉冲促使将生物分子引入到所述多个电极之间的细胞中。美国专利第7,245,963号的全部内容据此通过引用并入。

由Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述了可以用于有效地促使将生物分子引入到身体或植物中的所选组织中的细胞中的电穿孔装置。电穿孔装置包括电动态装置(“EKD装置”)，通过软件或固件来指定所述电动态装置的操作。EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输出以阵列的方式在电极之间产生一系列可编程恒流脉冲图案并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包括具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中央注射通道以及可移除的引导盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容据此通过引用并入。

美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法不仅可以适用于深度穿透到如肌肉等组织中，还适用于深度穿透到其它组织或器官中。由于电极阵列的配置，还将注射针(用于递送选中的生物分子)完全插入到靶器官中，并且注射是在由电极预先描绘的区域中以垂直于靶组织的方式施用的。美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/005263中描述的电极优选地是20mm长和21规格。

另外，在并入电穿孔装置和其用途的一些实施例中考虑在以下专利中描述的那些电穿孔装置的电穿孔装置：于1993年12月28日发布的美国专利5,273,525、于2000年8月29日发布的美国专利6,110,161、于2001年7月17日发布的6,261,281和于2005年10月25日发布的美国6,958,060以及于2005年9月6日发布的美国专利6,939,862。此外，本文考虑了涵盖于2004年2月24日发布的涉及使用各种装置中的任何装置递送DNA的美国专利6,697,669和于2008年2月5日发布的涉及注射DNA的方法的美国专利7,328,064中提供的主题的专利。以上专利通过引用以其整体并入。

10.癌症疗法

本发明提供了治疗和预防癌症的方法，或治疗和预防肿瘤生长或转移的方法。本发明的相关方面提供了在个体中预防、帮助预防和/或减少增生细胞或肿瘤细胞转移的方法。

本发明的一个方面提供了一种在有需要的个体中抑制转移的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本发明的组合物。本发明进一步提供了一种在有需要的个体中抑制转移的方法，所述方法包括向个体施用有效抑制转移量的本文所述的组合物中的任何一种组合物。

在治疗或预防有需要的个体的癌症或治疗和预防肿瘤转移的一些实施例中，向个体施用第二药剂，如抗肿瘤剂。在一些实施例中，第二药剂包括第二转移抑制剂，如纤溶酶原拮抗剂或腺苷脱氨酶拮抗剂。在其它实施例中，第二药剂是血管生成抑制剂。

本发明的组合物可以用于预防、减轻、最小化、控制和/或减少人和动物的癌症。本发明的组合物还可以用于减缓原发性肿瘤的生长速率。在施用于需要治疗的受试者时，本发明的组合物可以用于阻止癌细胞的扩散。因此，本发明的组合物可以作为与一种或多种药物或其它药剂的组合疗法的一部分施用。当用作组合疗法的一部分时，本发明组合物提供的转移减少和原发性肿瘤生长的减少允许更有效和高效地使用任何药物或药物疗法来治疗患者。另外，通过本发明的组合物控制转移为受试者提供了将疾病集中在一个位置中的更大能力。

在一个实施例中，本发明提供了用于预防恶性肿瘤或其它癌细胞转移以及降低肿瘤生长速率的方法。所述方法包括向诊断出患有恶性肿瘤或癌细胞的受试者或患有肿瘤或具有癌细胞的受试者施用有效量的本发明的组合物中的一种或多种组合物。

以下是可以通过本发明的方法和组合物治疗的癌症的非限制性实例：急性淋巴细胞；急性髓性白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；阑尾癌；基底细胞癌；肝外胆管癌；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；儿童脑干胶质瘤；成人脑肿瘤；儿童脑肿瘤、脑干胶质瘤；儿童脑肿瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤样/横纹肌样肿瘤；中枢神经系统胚胎肿瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞/恶性胶质瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；中分化松果体实质肿瘤；幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤；视觉通路和下丘脑胶质瘤；脑和脊髓肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌；胃肠道类癌；中枢神经系统非典型畸胎瘤样/横纹肌样肿瘤；中枢神经系统胚胎肿瘤；中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；宫颈癌；儿童脊索瘤；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性病症；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；食管癌；尤文肉瘤家族(Ewing Family of Tumors)；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼内黑色素瘤眼癌；视网膜母细胞瘤眼癌；胆囊癌；胃(胃)癌；胃肠道类癌；胃肠道间质瘤(GIST)；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；卵巢生殖细胞瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；胶质瘤；儿童脑干胶质瘤；儿童脑星形细胞瘤胶质瘤；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Histiocytosis,Langerhans Cell)；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞肿瘤；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；急性淋巴细胞白血病；急性髓性白血病；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞性白血病；毛细胞白血病；唇癌和口腔癌；肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；AIDS相关淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；骨和骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤；髓母细胞瘤；黑色素瘤；眼内(眼)黑色素瘤；梅克尔细胞癌；间皮瘤；原发灶不明的转移性鳞状颈癌；口腔癌(Mouth Cancer)；儿童多发性内分泌腺瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；真菌病；真菌类；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；慢性粒细胞白血病；成人急性髓性白血病；儿童急性髓性白血病；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性疾病；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；成神经细胞瘤；非小细胞肺癌；口腔癌(Oral Cancer)；口腔癌(Oral Cavity Cancer)；口咽癌；骨的骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰岛细胞肿瘤胰腺癌；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；中分化松果体实质肿瘤；松果体瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；涉及15号染色体NUT基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；尤文肉瘤家族肿瘤；卡波西肉瘤(Sarcoma,Kaposi)；软组织肉瘤；子宫肉瘤；塞扎里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌(黑色素瘤)；梅克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；转移性鳞状细胞癌、原发灶不明的转移性鳞状颈癌；胃(胃)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；尿道癌；子宫内膜子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；以及维尔姆斯肿瘤(Wilms Tumor)。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗癌症转移的方法，所述方法包括在用本发明的组合物进行治疗之前、与此同时或在此之后，利用针对癌症的互补疗法(如手术、化学疗法、化学治疗剂、放射疗法或激素疗法或其组合)治疗受试者。

化学治疗剂包含细胞毒剂(例如，5-氟尿嘧啶、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、氧柔比星(oxorubicin)、卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、阿糖胞苷USP、环磷酰胺(cyclophosphamide)、雌莫司汀磷酸钠(estramucine phosphate sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、羟基脲(hydroxyurea)、异环磷酰胺(ifosfamide)、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素(mitomycin)、白消安(busulfan)、环磷酰胺、米托蒽醌(mitoxantrone)、卡铂、顺铂、干扰素α-2a重组体、紫杉醇、替尼泊苷(teniposide)和链脲菌素(streptozoci))、细胞毒性烷化剂(例如，白消安、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺、美法仑(melphalan)或乙基磺酸(ethylesulfonic acid))、烷化剂(例如，亮氨酸溶肉瘤素(asaley)、AZQ、BCNU、白消安、马利兰(bisulphan)、羧基邻苯二甲酸铂(carboxyphthalatoplatinum)、CBDCA、CCNU、CHIP、苯丁酸氮芥、氯脲霉素(chlorozotocin)、顺铂、氯乙矾(clomesone)、氰基吗啉代多柔比星(cyanomorpholinodoxorubicin)、环迪丰公(cyclodisone)、环磷酰胺、脱水半乳糖醇(dianhydrogalactitol)、氟多潘(fluorodopan)、合普素凡(hepsulfam)、海恩酮(hycanthone)、异环磷酰胺(iphosphamide)、美法仑、甲基CCNU、丝裂霉素C、米托唑胺(mitozolamide)、氮芥(nitrogen mustard)、PCNU、哌嗪、哌嗪二酮、哌泊溴烷(哌泊溴烷)、甲基丝裂霉素(porfiromycin)、螺乙内酰脲芥剂(spirohydantoin mustard)、链脲霉素(streptozotocin)、替罗昔隆(teroxirone)、四铂(tetraplatin)、噻替派(thiotepa)、曲他胺(triethylenemelamine)、尿嘧啶氮芥和吉雄864(Yoshi-864))、抗有丝分裂剂(例如，别秋水仙碱(allocolchicine)、软海绵素M、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、多拉司他汀10(dolastatin 10)、美登素(maytansine)、根霉素(rhizoxin)、紫杉醇衍生物、紫杉醇、硫代秋水仙碱(thiocolchicine)、三苯甲基半胱氨酸(trityl cysteine)、硫酸长春碱和硫酸长春新碱)、植物生物碱(例如，放线菌素D、博来霉素(bleomycin)、L-天冬酰胺酶、伊达比星(idarubicin)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、光神霉素(mitramycin)、丝裂霉素、柔红霉素、VP-16-213、VM-26、诺维本(navelbine)和泰索帝(taxotere))、生物制剂(例如，α干扰素、BCG、G-CSF、GM-CSF和白介素-2)、拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱、喜树碱衍生物和吗啉代多柔比星)、拓扑异构酶II抑制剂(例如，米托蒽醌、氨萘非特(amonafide)、m-AMSA、蒽吡唑衍生物、吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)、必桑郡HCL、柔红霉素、脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin)、美诺立尔(menogaril)、N,N-二苄基道诺霉素(N,N-dibenzyldaunomycin)、氧蒽唑(oxanthrazole)、红比腙(rubidazone)、VM-26和VP-16)和合成物(例如，羟基脲、丙卡巴肼、o,p'-DDD、达卡巴嗪(dacarbazine)、CCNU、BCNU、顺式二氨二氯合铂(cis-diamminedichloroplatimun)、米托蒽醌、CBDCA、左旋咪唑(levamisole)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、全反式维甲酸、膜剂(gliadel)和卟吩姆钠)。

抗增殖剂是降低细胞增殖的化合物。抗增殖剂包含烷化剂、抗代谢物、酶、生物应答调节剂、其它药剂、激素和拮抗剂、雄激素抑制剂(例如，氟他胺和醋酸亮丙瑞林)、抗雌激素(例如，柠檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)和其类似物、托瑞米芬(toremifene)、屈洛昔芬(droloxifene)和雷洛昔芬(roloxifene))。特异性抗增殖剂的另外的实例包含但不限于左旋咪唑、硝酸镓、格拉司琼(granisetron)、沙格司亭氯化锶-89(sargramostimstrontium-89chloride)、非格司亭(filgrastim)、毛果芸香碱、右雷佐生(dexrazoxane)和昂丹司琼(ondansetron)。

本发明的化合物可以单独施用或与包含细胞毒性/抗肿瘤剂和抗血管生成剂的其它抗肿瘤剂组合施用。细胞毒性/抗肿瘤剂被定义为攻击和杀死癌细胞的药剂。一些细胞毒性/抗肿瘤剂是烷化剂，所述烷化剂使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，例如顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、布洛司汀、乌拉莫司汀(uracilmustard)、氯苯匹嗪(chlomaphazin)和达卡巴嗪。其它细胞毒性/抗肿瘤剂是肿瘤细胞的抗代谢物，例如，阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其它细胞毒性/抗肿瘤剂是抗生素，例如多柔比星、博来霉素、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素(daunomycin)。存在许多用于这些化合物的可商购的脂质体调配物。仍其它细胞毒性/抗肿瘤剂是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包含长春新碱、长春碱和依托泊苷(etoposide)。其它细胞毒性/抗肿瘤剂包含紫杉醇和其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷(azacytidine)、安吖啶(amsacrine)、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛(vindesine)。

抗血管生成剂是本领域的技术人员众所周知的。用于本发明的方法和组合物的合适的抗血管生成剂包含抗VEGF抗体，包含人源化抗体和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其它已知的血管生成抑制剂包含血管抑素、内皮抑素、干扰素、白介素1(包含α和β)、白介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(TIMP-1和-2)。还可以使用小分子，包含拓扑异构酶，如雷佐生，一种具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。

可以与本发明的组合物组合使用的其它抗癌剂包含但不限于：阿西维辛(acivicin)；阿柔比星(aclarubicin)；盐酸阿可达佐(acodazole hydrochloride)；阿克罗宁(acronine)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；六甲蜜胺；安波霉素(ambomycin)；醋酸阿美坦醌(ametantrone acetate)；氨鲁米特(aminoglutethimide)；安吖啶；阿那曲唑(anastrozole)；氨茴霉素(anthramycin)；天冬酰胺酶；曲林菌素(asperlin)；阿扎胞苷(azacitidine)；阿扎替派(azetepa)；阿佐霉素(azotomycin)；巴马司他(batimastat)；苄替哌(benzodepa)；比卡鲁胺(bicalutamide)；盐酸必桑郡(bisantrene hydrochloride)；二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新(bizelesin)；硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)；布喹那钠(brequinar sodium)；溴匹立明(bropirimine)；白消安；放线菌素C(cactinomycin)；卡普睾酮(calusterone)；卡醋胺(caracemide)；卡贝替姆(carbetimer)；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡米诺霉素(carubicinhydrochloride)；卡折来新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；苯丁酸氮芥；西罗霉素(cirolemycin)；顺铂；克拉屈滨(cladribine)；甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)；地西他滨(decitabine)；右奥马铂(dexormaplatin)；地扎胍宁(dezaguanine)；甲磺酸地扎胍宁(dezaguanine mesylate)；亚丝醌(diaziquone)；多西他赛(docetaxel)；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)；达佐霉素(duazomycin)；依达曲沙(edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(eflornithinehydrochloride)；依沙芦星(elsamitrucin)；恩洛铂(enloplatin)；恩普氨酯(enpromate)；依匹哌啶(epipropidine)；盐酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)；厄布洛唑(erbulozole)；盐酸依索比星(esorubicin hydrochloride)；雌莫司汀(estramustine)；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑(etanidazole)；依托泊苷；磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)；艾托卜宁(etoprine)；盐酸法屈唑(fadrozole hydrochloride)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维A胺(fenretinide)；氟尿苷(floxuridine)；磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)；氟尿嘧啶；氟环胞苷(fluorocitabine)磷喹酮(fosquidone)；福司曲星钠(fostriecin sodium)；吉西他滨(gemcitabine)；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新(ilmofosine)；白介素II(包含重组白介素II，或rIL2)，干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂(iproplatin)；盐酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)；醋酸兰瑞肽(lanreotideacetate)；来曲唑(letrozole)；醋酸亮丙瑞林盐酸利阿唑(liarozole hydrochloride)；洛美曲索钠(lometrexol sodium)；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌(losoxantronehydrochloride)；马索罗酚(masoprocol)；美登素；盐酸氮芥(mechlorethaminehydrochloride)；醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)；醋酸美仑孕酮(melengestrolacetate)；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶(metoprine)；美妥替哌(meturedepa)；米丁度胺(mitindomide)；丝裂霉素；密脱克罗明(mitocromin)；丝裂菌褶素(mitogillin)；丝裂马菌素(mitomalcin)；丝裂霉素；米托司培(mitosper)；米托坦(mitotane)；盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)；霉酚酸(mycophenolic acid)；诺考达唑(nocodazole)；诺加霉素(nogalamycin)；奥马铂(ormaplatin)；奥昔舒仑(oxisuran)；紫杉醇；培门冬酶(pegaspargase)；培利霉素(peliomycin)；戊氮芥(pentamustine)；硫酸培洛霉素(peplomycin sulfate)；培磷酰胺(perfosfamide)；哌泊溴烷；哌泊舒凡(piposulfan)；盐酸吡罗蒽醌(piroxantronehydrochloride)；普卡霉素(plicamycin)；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆钠；甲基丝裂霉素；泼尼莫司汀(prednimustine)；盐酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)；嘌呤霉素(puromycin)；盐酸嘌呤霉素(puromycin hydrochloride)；吡唑霉素(pyrazofurin)；利波腺苷(riboprine)；罗谷亚胺(rogletimide)；沙芬戈(safingol)；盐酸沙芬戈(safingolhydrochloride)；司莫司汀(semustine)；辛曲秦(simtrazene；)；斯巴佛斯酸钠(sparfosate sodium)；司帕霉素(sparsomycin)；盐酸螺旋锗(spirogermaniumhydrochloride)；螺莫司汀(spiromustine)；螺铂(spiroplatin)；链黑菌素(streptonigrin)；链脲菌素(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；他利霉素(talisomycin)；替可加兰钠(tecogalan sodium)；喃氟啶(tegafur)；盐酸替洛蒽醌(teloxantrone hydrochloride)；替莫卟吩(temoporfin)；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯(testolactone)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；硫鸟嘌呤(thioguanine)；噻替派；噻唑羧胺核苷(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；枸橼酸托瑞米芬(toremifene citrate)；醋酸曲托龙(trestolone acetate)；磷酸曲西瑞宾(triciribine phosphate)；三甲曲沙(trimetrexate)；葡萄糖醛酸三甲曲沙(trimetrexate glucuronate)；曲普瑞林(triptorelin)；盐酸妥布氯唑(tubulozole hydrochloride)；乌拉莫司汀；乌瑞替派(uredepa)；伐普肽(vapreotide)；维替泊芬(verteporfin)；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸长春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸长春罗新(vinleurosine sulfate)；酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)；硫酸长春罗定(vinrosidine sulfate)；硫酸长春利定(vinzolidine sulfate)；伏氯唑(vorozole)；折尼铂(zeniplatin)；净司他丁(zinostatin)；盐酸佐柔比星(zorubicin hydrochloride)。其它抗癌药物包含但不限于：20-表-1,25二羟基维生素D3(20-epi-1,25dihydroxyvitamin D3)；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙(abiraterone)；阿柔比星；阿斯扶威(acylfulvene)；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀(ambamustine)；氨密多西(amidox)；氨磷汀(amifostine)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶；阿那格雷(anagrelide)；阿那曲唑；穿心莲内酯(andrographolide)；血管生成抑制剂(angiogenesis inhibitor)；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯(antarelix)；抗背侧化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1)；前列腺癌抗雄激素；抗雌激素；抗瘤酮(antineoplaston)；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)；细胞凋亡基因调制剂；细胞凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；阿宿拉克林(asulacrine)；阿他美坦(atamestane)；阿莫司汀(atrimustine)；阿西那斯它汀1(axinastatin 1)；阿西那斯它汀2(axinastatin 2)；阿西那斯它汀3(axinastatin 3)；阿扎司琼(azasetron)；阿扎脱辛；重氮酪氨酸(azatyrosine)；浆果赤霉素III衍生物(baccatin III derivative)；巴拉诺尔(balanol)；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯唑氯辛(benzochlorins)；苯甲酰星形孢菌素(benzoylstaurosporine)；β内酰胺衍生物(betalactam derivative)；β-阿类汀(beta-alethine)；亚阿克拉霉素B(betaclamycin B)；桦木酸(betulinic acid)；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；必桑郡；双吖丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)；双萘法德；双脱汀尼A(bistratene A)；比折来新；布赖氟雷(breflate)；溴匹立明；布朵替坦(budotitane)；丁硫氨酸亚砜胺(buthioninesulfoximine)；钙泊三醇(calcipotriol)；钙磷酸蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2(canarypox IL-2)；卡培他滨(capecitabine)；甲酰胺-氨基-三唑(carboxamide-amino-triazole)；羧基胺基三唑(carboxyamidotriazole)；CaRest M3；CARN 700；软骨源性抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(casein kinase inhibitors，ICOS)；粟树精胺(castanospermine)；杀菌肽B(cecropin B)；西曲瑞克(cetrorelix)；卟酚(chlorins)；磺酰胺氯代喹喔啉(chloroquinoxaline sulfonamide)；西卡前列素(cicaprost)；顺卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物(clomifene analogue)；克霉唑(clotrimazole)；克林斯姆汀A(collismycin A)；克林斯姆汀B；康普瑞汀A4(combretastatin A4)；康普瑞汀类似物(combretastatin analogue)；康那根宁(conagenin)；克拉泊西汀(crambescidin 816)；克立那托(crisnatol)；念珠藻素8(cryptophycin 8)；念珠藻素A衍生物；克由若辛A(curacinA)；环戊烷拉喹(cyclopentanthraquinones)；环铂(cycloplatam)；噻泊米辛(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷酯(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子(cytolytic factor)；噻脱斯汀(cytostatin)；达昔单抗(dacliximab)；地西他滨；脱水膜海鞘素B(dehydrodidemnin B)；德舍瑞林(deslorelin)；地塞米松(dexamethasone)；第西佛斯米(dexifosfamide)；右雷佐生；右维拉帕米(dexverapamil)；亚丝醌；膜海鞘素B；第多克斯(didox)；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮杂胞苷(dihydro-5-azacytidine)；9-二氢紫杉醇(dihydrotaxol,9-)；二氧杂霉菌素(dioxamycin)；二苯螺莫司汀(diphenylspiromustine)；多西他赛；二十二醇(docosanol)；多拉司琼(dolasetron)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；屈洛昔芬；屈大麻酚(dronabinol)；多卡米辛SA(duocarmycin SA)；依布硒啉(ebselen)；依考莫司汀(ecomustine)；依地福新(edelfosine)；依决可单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸；榄香烯(elemene)；乙嘧替氟(emitefur)；表柔比星；爱普列特(epristeride)；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂(estrogen agonist)；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦(exemestane)；法屈唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺(finasteride)；氟拉沃匹瑞多(flavopiridol)；氟卓斯汀(flezelastine)；福噜斯特酮(fluasterone)；氟达拉滨；氟代柔红霉素盐酸盐(fluorodaunorunicinhydrochloride)；福酚美克(forfenimex)；福美司坦(formestane)；福司曲星福莫司汀(fotemustine)；四非丁钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨(galocitabine)；加尼瑞克(ganirelix)；白明胶酶抑制剂(gelatinase inhibitor)；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂(glutathione inhibitor)；合普素凡；调蛋白(heregulin)；六亚甲基二乙酰胺(hexamethylene bisacetamide)；金丝桃素(hypericin)；伊班膦酸(ibandronic acid)；伊达比星；艾多昔芬(idoxifene)；伊决孟酮(idramantone)；伊莫福新；伊洛马司他(ilomastat)；以密达唑阿瑞酮(imidazoacridones)；咪喹莫特(imiquimod)；免疫增强药肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂(insulin-like growth factor-1receptorinhibitor)；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍(iobenguane)；碘多柔比星(iododoxorubicin)；4-甘薯黑斑霉醇(ipomeanol,4-)；伊罗普拉(iroplact)；伊索拉定(irsogladine)；艾索本加唑(isobengazole)；艾索合莫哈力抗林B(isohomohalicondrinB)；伊他司琼(itasetron)；亚普拉可诺林(jasplakinolide)；卡哈拉莱F(kahalalide F)；三乙酸片螺素N(lamellarin-N triacetate)；兰瑞肽；莱那米辛(leinamycin)；来格司亭(lenograstim)；香菇多糖硫酸酯(lentinan sulfate)；莱普脱斯达汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞干扰素α；亮丙瑞林+雌性激素+黄体酮；抑那通(leuprorelin)；左旋咪唑；利阿唑；线性聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；例索克林安7(lissoclinamide 7)；洛铂(lobaplatin)；蚯蚓磷脂(lombricine)；洛美曲索；氯尼达明(lonidamine)；洛索蒽醌；洛伐他汀(lovastatin)；洛索立宾(loxoribine)；勒托替康(lurtotecan)；特可萨啡林镏(lutetium texaphyrin)；力索啡林(lysofylline)；裂解肽；美坦辛(maitansine)；吗诺斯它汀A(mannostatin A)；马马司他(marimastat)；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白(maspin)；基质溶解因子抑制剂(matrilysin inhibitor)；基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloproteinase inhibitor)；美诺立尔；美巴伦(merbarone)；美特莱林(meterelin)；蛋氨酸酶；胃复安(metoclopramide)；MIF抑制剂；米非司酮(mifepristone)；米替福新(miltefosine)；米立司亭(mirimostim)；错配的双链RNA；米托胍腙(mitoguazone)；二溴卫矛醇(mitolactol)；丝裂霉素类似物；米托萘胺(mitonafide)；丝裂毒素成纤维细胞生长因子-皂草素(mitotoxin fibroblast growth factor-saporin)；米托蒽醌；莫法罗汀(mofarotene)；莫格拉莫斯提(molgramostim)；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；单磷酰脂质A+肌红蛋白细菌细胞壁sk；莫哌达醇(mopidamol)；多重耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制因子1的疗法；芥末抗癌剂(mustard anticanceragent)；米卡泊氧化物B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；密瑞泊伦(myriaporone)；N-乙酰基地那林(N-acetyldinaline)；N取代的苯甲酰胺；那法瑞林(nafarelin)；那格瑞斯第(nagrestip)；纳洛酮+戊唑辛；纳帕林(napavin)；纳啡特品(naphterpin)；那托司亭(nartograstim)；奈达铂(nedaplatin)；奈莫柔比星(nemorubicin)；奈立膦酸(neridronic acid)；中性肽链内切酶(neutralendopeptidase)；尼鲁米特(nilutamide)；尼萨米辛(nisamycin)；一氧化氮调节剂(nitricoxide modulator)；硝基氧抗氧化剂(nitroxide antioxidant)；尼图林(nitrullyn)；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽(octreotide)；奥可森诺(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮(onapristone)；昂丹司琼；昂丹司琼；奥拉辛(oracin)；口腔细胞因子诱导物；奥马铂；奥沙特隆(osaterone)；奥沙利铂(oxaliplatin)；奥呷诺辛(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕拉氨(palauamine)；帕密脱合唑辛(palmitoylrhizoxin)；帕米膦酸(pamidronic acid)；人参炔三醇(panaxytriol)；帕诺米芬(panomifene)；帕拉巴汀(parabactin)；泊泽尼普定(pazelliptine)；培门冬酶；培地辛(peldesine)；木聚硫钠(pentosan polysulfate sodium)；喷司他丁(pentostatin)；朋脱若唑(pentrozole)；全氟溴烷(perflubron)；培磷酰胺；紫苏醇(perillyl alcohol)；芬那兹诺辛(phenazinomycin)；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；毕西巴尼(picibanil)；盐酸毛果芸香碱(pilocarpine hydrochloride)；吡柔比星(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；普莱斯汀A(placetin A)；普莱斯汀B；纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activatorinhibitor)；铂复合体；铂化合物；铂-三胺复合体；卟吩姆钠；甲基丝裂霉素；强的松(prednisone)；丙基双茚酮(propyl bis-acridone)；前列腺素J2(prostaglandin J2)；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂、微藻；蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素(purpurins)；吡唑吖啶(pyrazoloacridine)；吡啶氧基化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞(raltitrexed)；雷莫司琼(ramosetron)；ras法尼斯基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化瑞替普汀(retelliptine demethylated)；依替膦酸铼Re 186(rhenium Re 186etidronate)；根霉素；酶性核酸(ribozymes)；RII维甲酰胺(RIIretinamide)；罗谷亚胺；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽(romurtide)；罗喹美克(roquinimex)；噜必吉诺B1(rubiginone B1)；噜泊基(ruboxyl)；沙芬戈；萨因脱匹(saintopin)；SarCNU；萨考啡脱A(sarcophytol A)；沙格司亭；Sdi1模拟物；司莫司汀；衰老源性抑制剂1；义寡核苷酸转染；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃(sizofuran)；索布佐生(sobuzoxane)；硼卡钠(sodium borocaptate)；苯乙酸钠；索沃罗(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明(sonermin)；斯帕磷酸(sparfosic acid)；霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀；斯耐潘定(splenopentin)；软海绵素1；角鲨胺(squalamine)；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；斯第匹氨(stipiamide)；溶基质素抑制剂(stromelysin inhibitor)；素飞诺辛(sulfinosine)；超活性血管活性肠肽拮抗剂；素若第斯它(suradista)；苏拉明(suramin)；苦马豆素(swainsonine)；合成粘多糖(syntheticglycosaminoglycans)；他莫司汀(tallimustine)；他莫昔芬甲碘化物(tamoxifenmethiodide)；牛磺莫司汀(tauromustine)；他扎罗汀(tazarotene)；替可加兰钠；喃氟啶；呔鲁拉利(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；替莫唑胺(temozolomide)；替尼泊苷；四氯脱氧化物；四唑茗(tetrazomine)；萨力巴拉斯汀(thaliblastine)；西奥考拉林(thiocoraline)；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新(thymalfasin)；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南(thymotrinan)；促甲状腺激素(thyroid stimulatinghormone)；乙基初卟啉锡(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明；二氯二茂钛(titanocenebichloride)；脱普森汀(topsentin)；托瑞米芬；全能干细胞因子；转译抑制剂；维甲酸(tretinoin)；三乙酰尿苷(triacetyluridine)；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼(tropisetron)；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司(ubenimex)；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；瓦瑞奥林B(variolin B)；载体系统、红细胞基因疗法；维拉雷琐(velaresol)；藜芦胺(veramine)；维尔丁斯(verdins)；维替泊芬；长春瑞滨；长春花碱(vinxaltine)；维它汀(vitaxin)；伏氯唑；扎诺特隆(zanoterone)；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；以及净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)。在一个实施例中，抗癌药物是5-氟尿嘧啶、紫杉醇或甲酰四氢叶酸(leucovorin)。

在以下实例中进一步说明了本发明。应当理解，这些实例虽然指示本发明的示例性实施例，但仅通过说明的方式给出。通过以上讨论和这些实例，本领域的技术人员可以确定本发明的必要特征，并且可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明进行各种改变和修改，以使本发明适用于各种用途和条件。因此，除了本文示出和描述的那些之外，根据以上描述，本发明的各种修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

11.实例

实例1

使用DNA编码的抗体简化检查点阻断递送

CTLA-4阻断和PD-1阻断在临床前小鼠模型和患者中都证明了协同作用和非冗余。由于这些免疫检查点途径中的非冗余，纳武单抗和伊匹单抗的组合疗法导致了改善的疗效，包含与单一疗法相比的总体存活率和无进展生存期，从而导致在2015年对晚期黑素瘤的这种组合疗法的FDA批准。

DMAb递送简化了抗体疗法和组合，包含检查点阻断并且可以使其可用于远远更大的群体。保证了用于癌症治疗的DMAb的临床发展。

对不同抗PD-1抗体(派姆单抗和纳武单抗)的序列进行修饰，以优化其表达，同时保留其结合能力和功能(图1和表1)。对抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体进行编码的优化DMAb质粒不仅简化检查点阻断疗法的施用和方案，从而将每三周施用90分钟的静脉内输注转变为单一肌肉内注射。DMAb还将简化组合疗法，从而允许利用单一肌肉内注射或与其它疗法的组合施用抗CTLA4和抗PD-1组合作为DNA疫苗。

表1：在这些实验中使用的DMAbs的序列。

本文所引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。

虽然已经参考特定实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不偏离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计出本发明的其它实施方式和变体。所附权利要求旨在被理解为包含所有此类实施方式和等效变化。

序列表

<110> 威斯塔解剖学和生物学研究所（The Wistar Institute of Anatomy andBiology）

大卫·B·韦纳（Weiner, David B）

阿尔弗雷多·佩拉莱斯·普查尔特（Perales-Puchalt, Alfredo）

<120> 靶向PD-1以治疗和预防癌症的DNA单克隆抗体

<130> 206194-0036-00WO

<150> US 62/791,146

<151> 2019-01-11

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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<223> 化学合成，纳武单抗hIgG4 DMAb原始

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100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser

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Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

275 280 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

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Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

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Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

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545 550 555 560

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Glu Cys

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 化学合成，纳武单抗hIgG4 DMAb修饰2

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Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

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Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

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100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

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180 185 190

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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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580 585 590

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caggtcagcc tgacatgtct ggtgaaaggg ttctatcctt ctgatatcgc tgtggagtgg 1200

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<210> 8

<211> 2205

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 化学合成，派姆单抗hIgG4 DMAb修饰1

<400> 8

atggactgga catggagaat cctgttcctg gtcgccgccg caactgggac tcacgcagaa 60

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tccagtccag tgaccaagtc cttcaataga ggcgaatgct gataa 2205

<210> 9

<211> 2205

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 化学合成，派姆单抗hIgG4 DMAb修饰2

<400> 9

atggactgga catggagaat cctgttcctg gtcgccgccg caaccgggac tcacgccgaa 60

gtgcagctgg tgcagagtgg ggtcgaagtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggcct ctggctacac attcaccaac tactatatgt attgggtgcg gcaggcacca 180

ggacagggcc tggagtggat gggcggcatc aaccccagca atggcggaac caacttcaat 240

gagaagttta agggccgcgt gacactgacc acagatagct ccaccacaac cgcctacatg 300

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agattcgata tgggctttga ctattggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gtctagcgcc 420

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acatgcaacg tggatcacaa gccaagcaat acaaaggtgg acaagagggt ggagtccaag 720

tacggccctc cctgcccttc ttgtccagca cctgagttcc tgggcggccc atccgtgttc 780

ctgtttccac ccaagcctaa ggatacactg atgatctcca gaacccccga ggtgacatgc 840

gtggtggtgg acgtgagcca ggaggaccct gaggtgcagt tcaactggta cgtggacggc 900

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aaggtgagca ataagggcct gccctctagc atcgagaaga ccatctccaa ggcaaaggga 1080

cagccccgcg agcctcaggt gtacacactg cctccatctc aggaggagat gaccaagaac 1140

caggtgagcc tgacatgtct ggtgaagggc ttctatccta gcgatatcgc cgtggagtgg 1200

gagtccaatg gccagccaga gaacaattac aagacaaccc ctcccgtgct ggactccgat 1260

ggctctttct ttctgtatag caggctgacc gtggacaagt ccagatggca ggagggcaac 1320

gtgtttagct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacaccca gaagtctctg 1380

agcctgtccc tgggcaagag gggaagaaag cggcgctctg gcagcggagc cacaaacttc 1440

agcctgctga agcaggccgg cgatgtggag gagaatccag gccccatggt gctgcagacc 1500

caggtgttta tctccctgct gctgtggatc tctggcgcct acggcgagat cgtgctgacc 1560

cagagccctg ccacactgtc cctgtctcca ggagagaggg ccaccctgag ctgtagggca 1620

tccaagggcg tgagcacatc cggatactcc tatctgcact ggtatcagca gaagccagga 1680

caggccccca ggctgctgat ctacctggcc tcttatctgg agagcggagt gccagcacgc 1740

ttctctggca gcggctccgg caccgacttt accctgacaa tctcctctct ggagccagag 1800

gatttcgccg tgtactattg ccagcacagc agggacctgc cactgacctt cggcggcggc 1860

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tctgtgaccg agcaggacag caaggattcc acatattctc tgagctccac cctgacactg 2100

agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tatgcctgcg aggtcaccca ccaggggctg 2160

tcatctccag tcactaaatc tttcaatcgg ggcgaatgct gataa 2205

<210> 10

<211> 2172

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 化学合成，纳武单抗hIgG4 DMAb原始

<400> 10

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tgtccagcac ctgaattcct gggcggacca agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa 780

gacaccctga tgatctccag aacacctgag gtcacttgcg tggtcgtgga cgtgtctcag 840

gaggaccccg aagtccagtt caactggtac gtggatggcg tcgaagtgca caatgctaag 900

acaaaaccac gagaggaaca gtttaacagc acatacaggg tcgtgtccgt cctgactgtg 960

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ccctcaagca tcgagaaaac cattagcaag gccaaaggcc agccccggga acctcaggtg 1080

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tatagtctgt ctagtacact gactctgagc aaagccgact acgagaagca taaagtgtat 2100

gcttgcgagg tcacccacca ggggctgtca agtccagtca caaagtcctt caatagggga 2160

gaatgttgat aa 2172

<210> 11

<211> 2172

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 化学合成，纳武单抗hIgG4 DMAb修饰1

<400> 11

atggactgga cttggaggat tctgtttctg gtcgctgctg ccactggaac tcacgctgag 60

gtgcagctgg tcgaatcagg aggaggggtg gtccagcctg gccgaagcct gaggctggac 120

tgcaaggcct ccggaatcac cttctcaaac agcggaatgc actgggtgcg ccaggctcca 180

gggaaaggac tggagtgggt cgcagtgatc tggtacgacg ggtcaaagcg atactatgct 240

gatagcgtga aaggcagatt cactatttca cgggacaaca gcaagaatac cctgtttctg 300

cagatgaact ccctgcgggc tgaggatacc gcagtgtact attgtgcaac aaatgacgat 360

tactggggac aggggaccct ggtcacagtg agctccgcta gtaccaaggg gccttcagtg 420

tttcctctgg caccatgctc ccgctctact agtgagtcaa ccgccgctct gggctgtctg 480

gtgaaagatt atttccctga accagtcaca gtgtcatgga atagcggggc actgaccagc 540

ggcgtccaca catttccagc cgtgctgcag tctagtgggc tgtacagcct gtcaagcgtg 600

gtcacagtcc catcctctag tctgggcact aagacctata catgcaacgt ggaccataaa 660

ccctccaata ctaaggtcga taaaagggtg gagtctaagt acggaccccc ttgcccaagt 720

tgtccagcac ctgaattcct gggcggacca agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa 780

gacaccctga tgatctccag aacacctgag gtcacttgcg tggtcgtgga cgtgtctcag 840

gaggaccccg aagtccagtt caactggtac gtggatggcg tcgaagtgca caatgctaag 900

acaaaaccac gagaggaaca gtttaacagc acatacaggg tcgtgtccgt cctgactgtg 960

ctgcatcagg actggctgaa cggaaaggag tataagtgca aagtgagcaa taaggggctg 1020

ccctcaagca tcgagaaaac cattagcaag gccaaaggcc agccccggga acctcaggtg 1080

tacacactgc ctccaagcca ggaggaaatg actaagaacc aggtcagcct gacctgtctg 1140

gtgaaaggct tctatccatc cgacattgct gtggagtggg aatctaatgg acagcccgag 1200

aacaattaca agaccacacc ccctgtcctg gactccgatg gctctttctt tctgtattcc 1260

aggctgaccg tggataaatc tagatggcag gagggaaacg tctttagctg ctccgtgatg 1320

cacgaagccc tgcacaatca ttacacccag aagtctctga gtctgtcact gggaaagcga 1380

ggacgaaaaa ggagaagcgg ctccggagcc acaaacttca gcctgctgaa gcaggctggc 1440

gacgtggagg aaaatccagg acccatggtc ctgcagactc aggtgtttat ctctctgctg 1500

ctgtggatta gtggcgccta cggagagatc gtgctgactc agtcccctgc taccctgtct 1560

ctgagtccag gcgaacgcgc aaccctgtct tgtcgagcct cacagagcgt gtcctcttac 1620

ctggcatggt atcagcagaa gccaggacag gcccccaggc tgctgatcta tgatgccagc 1680

aaccgggcta cagggattcc tgcacgcttc tccgggtctg gcagtggaac tgactttact 1740

ctgaccatta gttcactgga gcccgaagat ttcgccgtgt actattgcca gcagagctcc 1800

aattggccta gaacatttgg gcagggcact aaggtggaga tcaaacggac tgtcgcagcc 1860

cccagcgtgt tcatctttcc accctcagac gaacagctga agtccggaac cgcctctgtg 1920

gtgtgcctgc tgaacaattt ctaccctaga gaggctaagg tccagtggaa agtggataac 1980

gcactgcaga gtgggaattc acaggagagc gtgaccgaac aggactccaa ggattctaca 2040

tatagtctgt ctagtacact gactctgagc aaagccgact acgagaagca taaagtgtat 2100

gcttgcgagg tcacccacca ggggctgtca agtccagtca caaagtcctt caatagggga 2160

gaatgttgat aa 2172

<210> 12

<211> 2172

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 化学合成，纳武单抗hIgG4 DMAb修饰2

<400> 12

atggactgga cttggaggat tctgtttctg gtcgctgctg ccactggaac tcacgctgag 60

gtgcagctgg tcgaatcagg aggaggggtg gtccagcctg gccgaagcct gaggctgagc 120

tgcgccgcct ccggaatcac cttctcaaac agcggaatgc actgggtgcg ccaggctcca 180

gggaaaggac tggagtgggt cgcagtgatc tggtacgacg ggtcaaagcg atactatgct 240

gatagcgtga aaggcagatt cactatttca cgggacaaca gcaagaatac cctgtacctg 300

cagatgaact ccctgcgggc tgaggatacc gcagtgtact attgtgcaac aaatgacgat 360

tactggggac aggggaccct ggtcacagtg agctccgcta gtaccaaggg gccttcagtg 420

tttcctctgg caccatgctc ccgctctact agtgagtcaa ccgccgctct gggctgtctg 480

gtgaaagatt atttccctga accagtcaca gtgtcatgga atagcggggc actgaccagc 540

ggcgtccaca catttccagc cgtgctgcag tctagtgggc tgtacagcct gtcaagcgtg 600

gtcacagtcc catcctctag tctgggcact aagacctata catgcaacgt ggaccataaa 660

ccctccaata ctaaggtcga taaaagggtg gagtctaagt acggaccccc ttgcccaagt 720

tgtccagcac ctgaattcct gggcggacca agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa 780

gacaccctga tgatctccag aacacctgag gtcacttgcg tggtcgtgga cgtgtctcag 840

gaggaccccg aagtccagtt caactggtac gtggatggcg tcgaagtgca caatgctaag 900

acaaaaccac gagaggaaca gtttaacagc acatacaggg tcgtgtccgt cctgactgtg 960

ctgcatcagg actggctgaa cggaaaggag tataagtgca aagtgagcaa taaggggctg 1020

ccctcaagca tcgagaaaac cattagcaag gccaaaggcc agccccggga acctcaggtg 1080

tacacactgc ctccaagcca ggaggaaatg actaagaacc aggtcagcct gacctgtctg 1140

gtgaaaggct tctatccatc cgacattgct gtggagtggg aatctaatgg acagcccgag 1200

aacaattaca agaccacacc ccctgtcctg gactccgatg gctctttctt tctgtattcc 1260

aggctgaccg tggataaatc tagatggcag gagggaaacg tctttagctg ctccgtgatg 1320

cacgaagccc tgcacaatca ttacacccag aagtctctga gtctgtcact gggaaagcga 1380

ggacgaaaaa ggagaagcgg ctccggagcc acaaacttca gcctgctgaa gcaggctggc 1440

gacgtggagg aaaatccagg acccatggtc ctgcagactc aggtgtttat ctctctgctg 1500

ctgtggatta gtggcgccta cggagagatc gtgctgactc agtcccctgc taccctgtct 1560

ctgagtccag gcgaacgcgc aaccctgtct tgtcgagcct cacagagcgt gtcctcttac 1620

ctggcatggt atcagcagaa gccaggacag gcccccaggc tgctgatcta tgatgccagc 1680

aaccgggcta cagggattcc tgcacgcttc tccgggtctg gcagtggaac tgactttact 1740

ctgaccatta gttcactgga gcccgaagat ttcgccgtgt actattgcca gcagagctcc 1800

aattggccta gaacatttgg gcagggcact aaggtggaga tcaaacggac tgtcgcagcc 1860

cccagcgtgt tcatctttcc accctcagac gaacagctga agtccggaac cgcctctgtg 1920

gtgtgcctgc tgaacaattt ctaccctaga gaggctaagg tccagtggaa agtggataac 1980

gcactgcaga gtgggaattc acaggagagc gtgaccgaac aggactccaa ggattctaca 2040

tatagtctgt ctagtacact gactctgagc aaagccgact acgagaagca taaagtgtat 2100

gcttgcgagg tcacccacca ggggctgtca agtccagtca caaagtcctt caatagggga 2160

gaatgttgat aa 2172