阅读说明：本技术 一种发酵饲料蛋白及其制备方法与应用 (Fermented feed protein and preparation method and application thereof ) 是由 吴振强 郭志鹏 黄文琪 于 2019-11-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种发酵饲料蛋白及其制备方法与应用。本发明方法利用分步发酵的方式,使辣木籽粕在经过黑曲霉和米根霉发酵后,其纤维素、蛋白质等大分子被降解为小分子,再接种的屎肠球菌可直接利用小分子物质,进一步发酵辣木籽粕,提高发酵效率,更有效地提高辣木籽粕的营养价值。辣木籽粕经过发酵后,产生酸香气味,与单菌发酵相比,其粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性等显著提高,富含益生菌,成为一种优质饲料蛋白。(The invention discloses a fermented feed protein and a preparation method and application thereof. According to the method, a step-by-step fermentation mode is utilized, so that after the moringa seed meal is fermented by aspergillus niger and rhizopus oryzae, macromolecules such as cellulose, protein and the like are degraded into small molecules, and the inoculated enterococcus faecium can directly utilize the small molecular substances to further ferment the moringa seed meal, so that the fermentation efficiency is improved, and the nutritional value of the moringa seed meal is effectively improved. The moringa oleifera seed meal generates acid-fragrant smell after fermentation, compared with single-bacterium fermentation, the moringa oleifera seed meal has the advantages that the crude protein content, the acid-soluble protein content, the neutral protease activity and the like are obviously improved, and the moringa oleifera seed meal is rich in probiotics and becomes high-quality feed protein.)

一种发酵饲料蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于饲料加工技术领域，具体涉及一种发酵饲料蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

饲料蛋白是水产、禽畜养殖的重要资源。目前，世界各国对饲料蛋白的需求量都很大，加上鱼粉等传统饲料蛋白价格提高，寻找潜在的、优质的饲料蛋白是目前养殖业的重要目标之一。因此，优化饲料配方、降低饲料成本是养殖业重要的研究问题。发酵饲料蛋白与传统的饲料蛋白相比，有消化率高、料肉比高等优点，近年来，籽粕、棉籽饼等农牧业废弃物作为发酵原料生产新型发酵饲料蛋白的研究越来越多，发酵饲料蛋白有了更大的开发潜力。

辣木是一种尚未充分开发的多功能新型植物资源，具有产量高、适应性广、栽培简便、抗逆性强等特点。辣木叶和辣木籽常作为饲料添加到常规饲料中。其叶和种子具有提高经济动物生长性能、改善免疫功能、改善肉质的效果。辣木籽在生产辣木油后，剩余的辣木籽粕如果未被充分利用就被丢弃，会造成环境污染和资源的巨大浪费。辣木籽粕本身有较高的粗蛋白含量(25％-36％)，但植物原料常常含有抗营养因子，难以消化，直接饲喂甚至可能导致幼崽死亡。通过发酵的方式，利用微生物分解糟粕类材料，可降解其植物蛋白和抗营养因子，提高其营养价值，是开发辣木籽粕的理想方法。直接利用辣木叶作为饲料或者将辣木叶用于制作青贮饲料的报道较多，但开发利用辣木籽粕固态发酵生产饲料蛋白的报道较少。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种发酵饲料蛋白的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的发酵饲料蛋白。

本发明的再一目的在于提供上述发酵饲料蛋白的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种发酵饲料蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)辣木籽粕预处理：取辣木籽粕，粉碎，过筛，备用；

(2)将步骤(1)得到的辣木籽粕和水混匀，接着接种混合菌剂，混合均匀，密封发酵，得到发酵产物A；混合菌剂包括米根霉和黑曲霉；

(3)在发酵产物A中接种屎肠球菌，混合均匀，密封发酵，得到发酵饲料蛋白。

步骤(1)中所述的过筛优选为，过10～20目筛；更优选为，过10目筛。

步骤(2)中所述的辣木籽粕和水优选为按质量比54～75：25～46的比例混匀。

步骤(2)中所述的混合菌剂的接种量优选为，以辣木籽粕的质量份数为54～75份计，接种混合菌剂10～16份；更优选为13～16质量份。

步骤(2)中所述的混合菌剂优选为米根霉和黑曲霉按质量比5～8：5～8配比得到的混合菌剂。

步骤(2)中所述的米根霉优选为处于对数生长期或稳定期的菌体；更优选通过如下步骤制备得到：将保存的米根霉种接种于平板活化，再接种于种子培养基，振荡培养，得到处于对数生长期或稳定期的米根霉培养液。

所述的平板活化采用的培养基优选为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

所述的平板活化的时间优选为40～50h；更优选为48h。

所述的种子培养基优选为马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。

所述的振荡培养的转速优选为110～130rpm；更优选为120rpm。

所述的振荡培养的温度优选为28～32℃；更优选为30℃。

所述的振荡培养的时间优选为10～14h。

步骤(2)中所述的米根霉优选菌种量为0.8～0.9mg/mL的米根霉菌液；更优选菌种量为0.87mg/mL的米根霉菌液。

步骤(2)中所述的黑曲霉优选为处于对数生长期或稳定期的菌体；更优选通过如下步骤制备得到：将保存的黑曲霉种接种于平板活化，再接种于种子培养基，振荡培养，得到处于对数生长期或稳定期的黑曲霉培养液。

所述的平板活化采用的培养基优选为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

所述的平板活化的时间优选为40～50h；更优选为48h。

所述的种子培养基优选为马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。

所述的振荡培养的转速优选为110～130rpm；更优选为120rpm。

所述的振荡培养的温度优选为28～32℃；更优选为30℃。

所述的振荡培养的时间优选为20～26h。

步骤(2)中所述的黑曲霉优选菌种量为3～4mg/mL的黑曲霉菌液；更优选菌种量为3.7mg/mL的黑曲霉菌液。

步骤(2)中所述的接种混合菌剂后的密封发酵，发酵温度优选为28～32℃；更优选为30℃。

步骤(2)中所述的接种混合菌剂后的密封发酵，发酵时间优选为32～42h。

步骤(3)中所述的屎肠球菌的接种量优选为，以辣木籽粕的质量份数为54～75份计，接种屎肠球菌5～8质量份；更优选为7～8质量份。

步骤(3)中所述的屎肠球菌优选为处于对数生长期或稳定期的菌体；更优选通过如下步骤制备得到：将保存的黑曲霉种接种于平板活化，再接种于种子培养基，振荡培养，得到处于对数生长期或稳定期的屎肠球菌培养液。

所述的平板活化采用的培养基优选为乳酸细菌培养基(MRS medium)。

所述的平板活化的时间优选为40～50h；更优选为48h。

所述的种子培养基优选为乳酸细菌培养基(MRS medium)。

所述的振荡培养的转速优选为110～130rpm；更优选为120rpm。

所述的振荡培养的温度优选为28～32℃；更优选为30℃。

所述的振荡培养的时间优选为12～16h。

步骤(3)中所述的屎肠球菌优选OD₆₀₀值为0.7～0.8的屎肠球菌菌液；更优选OD₆₀₀值为0.76的屎肠球菌菌液。

步骤(3)中所述的接种屎肠球菌后的密封发酵，发酵温度优选为28～32℃；更优选为30℃。

步骤(3)中所述的接种屎肠球菌后的密封发酵，发酵时间优选为32～42h。

一种发酵饲料蛋白，通过上述发酵饲料蛋白的制备方法制备得到。

所述的发酵饲料蛋白中粗蛋白含量为40～50％，酸溶蛋白含量为9～11％、中性蛋白酶活性为700～850U/g。

上述的发酵饲料蛋白在制备饲料中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明方法通过筛选合理的微生物种类及接种方式，利用分步发酵的方式，辣木籽粕在经过黑曲霉和米根霉发酵后，其纤维素、蛋白质等大分子被降解为小分子，再接种的屎肠球菌可直接利用小分子物质，进一步发酵辣木籽粕，提高发酵效率，更有效地提高辣木籽粕的营养价值。辣木籽粕经过发酵后，产生酸香气味，与单菌发酵相比，其粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性等显著提高，富含益生菌，成为一种优质饲料蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中使用的屎肠球菌为取保存的屎肠球菌，刮取一环屎肠球接种于乳酸细菌培养基(MRS medium)平板活化，培养2天；再刮取一环活化后的屎肠球菌接种于50mLMRS液体培养基37℃、120rpm培养12～16h，测得OD600值为0.76(稀释3倍)。

本发明实施例中使用的米根霉为取保存的米根霉，刮取一环米根霉菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板活化，培养2天；用5mm琼脂打孔器打孔，取2孔长有菌丝的琼脂接种到50mL马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)30℃、120rpm培养10～14h，测得菌种量为0.87mg/mL。

本发明实施例中使用的黑曲霉为取保存的黑曲霉，刮取一环黑曲霉菌丝接种于PDA平板活化，培养2天；用5mm琼脂打孔器打孔，取2孔长有菌丝的琼脂接种到50mL PDB液体培养基30℃、120rpm培养20～26h，测得菌种量为3.7mg/mL。

本发明对比例中使用的酿酒酵母为取保存的酿酒酵母，刮取一环酿酒酵母，用平板划线法接种到YPD培养基平板活化，培养48h；刮取1环活化后的酿酒酵母，接种到50mL的YPD培养基，30℃120rpm培养12h，此时OD600值为0.686(稀释6倍)。

本发明实施例或对比例中涉及的微生物：

米根霉A：Rhizopus oryzae E20360、其已在NCBI中公开，登录号为MK267423.1；

米根霉B：米根霉GIM 3.130，可从广东省微生物菌种保藏中心购买得到；

黑曲霉A：Aspergillus niger，其已在NCBI中公开，登录号为MN474007；

黑曲霉B：黑曲霉GIM 3.462，可从广东省微生物菌种保藏中心购买得到；

屎肠球菌A：Enterococcus faecium A1，其已在NCBI中公开，登录号为MN474019；

屎肠球菌B：屎肠球菌GIM 1.391，可从广东省微生物菌种保藏中心购买得到；

酿酒酵母：购于安琪酵母公司。

粗蛋白含量使用文献“张厚锋,张淑萍.缩短凯氏定氮法消化时间的探讨[J].中国畜牧兽医,2008(9):157-158.”记载的方法测定；

酸溶蛋白含量使用文献“侯楠楠,谢全喜,雷春红等.复合益生菌固态发酵对豆粕营养品质影响的研究[J].中国饲料,2018”记载的方法测定；

中性蛋白酶活性按国家标准GB/T 28715-2012测定。

辣木籽粕预处理：取辣木籽粕，粉碎，过10目筛，备用。

实施例1

取辣木籽粕54质量份，加水46质量份，接种米根霉A和黑曲霉A混合菌(比例为质量比1：1)16质量份，发酵温度30℃，密封发酵38h；然后接种屎肠球菌A 8质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵34h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为40.61％、9.34％、752.35U/g。

实施例2

取辣木籽粕75质量份，加水25质量份，接种米根霉A和黑曲霉A混合菌(比例为质量比1：1)14质量份，发酵温度30℃，密封发酵40h；然后接种屎肠球菌A 6质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵32h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为41.88％、9.64％、849.74U/g。

实施例3

取辣木籽粕50质量份，加水50质量份，接种米根霉A和黑曲霉A混合菌(比例为质量比1：1)13质量份，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌A 7质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为46.78％、10.64％、711.93U/g。

实施例4

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉A和黑曲霉A混合菌(比例为质量比1：1)13质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌A 7质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为44.5％、9.55％、744.95U/g。

实施例5

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉B和黑曲霉A混合菌(比例为质量比1：1)13质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌A 7质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为43.33％，9.56％，701.80U/g。

实施例6

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉A和黑曲霉B混合菌(比例为质量比1：1)13质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌A 7质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为42.87％、8.91％、677.52U/g。

实施例7

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉A和黑曲霉A混合菌(比例为质量比1：1)13质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌B 7质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为44.56％、8.95％、760.31U/g。

实施例8

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉B和黑曲霉B混合菌(比例为1：1)13质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌A 7质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为42.18％、9.56％、685.78U/g。

实施例9

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉B和黑曲霉A混合菌(比例为质量比1：1)13质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌B 7质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为41.97％、9.45％、740.74U/g。

实施例10

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉A和黑曲霉B混合菌(比例为质量比1：1)13质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌B 7质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为42.55％、9.33％、666.20U/g。

实施例11

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉B和黑曲霉B混合菌(比例为质量比1：1)13质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌B 7质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为44.06％、8.85％、684.87U/g。

对比例1

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，混合均匀，灭菌后再加水20质量份，密封72h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为35.38％、5.10％、13.91U/g。

对比例2

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种屎肠球菌A 20质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵72h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为31.77％、4.52％、11.11U/g。

对比例3

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种酿酒酵母20份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵72h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为35.17％、4.59％、92.59U/g。

对比例4

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉A 20质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵72h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为38.16％、8.17％、266.67U/g。

对比例5

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种黑曲霉A 20质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵72h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为38.64％、6.46％、114.81U/g。

对比例6

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种黑曲霉A 10质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌A 10质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白活性分别为38.23％、6.85％、503.29U/g。

对比例7

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉A 10质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h；然后接种屎肠球菌A 10质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵36h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白活性分别为39.75％、5.94％、392.38U/g。

对比例8

取辣木籽粕65质量份，加水35质量份，接种米根霉A和黑曲霉A混合菌(比例为质量比1：1)20质量份，混合均匀，发酵温度30℃，密封发酵72h。通过上述方法制备得到的得饲料蛋白的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性分别为40.02％、7.61％、513.34U/g。

将对比例1-8的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性与实施例4比较，结果如表1所示。可见，本发明方法制备得到的饲料蛋白粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、中性蛋白酶活性显著高于对比例。

表1结果对比

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。