阅读说明：本技术 一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品 (Euphausia superba oil polypeptide biological product capable of benefiting spleen and invigorating stomach ) 是由 付鹏磊 朱晶晶 鲍宏刚 孔元萍 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品及其制备工艺,属于海洋生物技术领域。本发明以南极磷虾油加工下脚料为原料,集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术,研制开发出具有显著益脾健胃保健功效的南极磷虾多肽生物制品,其中混菌好氧发酵菌种主要包括黑曲霉和枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌。所得南极磷虾多肽具有较强的益脾健胃保健功效,提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理,满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。该工艺技术简单高效、所得产品抗氧化能力和益脾健胃保健功效强,产品稳定性强,生产成本低,易于工业化规模生产。(The invention discloses a euphausia superba oil polypeptide biological product capable of benefiting spleen and invigorating stomach and a preparation process thereof, and belongs to the technical field of marine organisms. The euphausia superba polypeptide biological product with remarkable spleen tonifying and stomach invigorating health care effects is developed by taking euphausia superba oil processing leftovers as raw materials and integrating the modern bioseparation technology, the biological enzymolysis technology and the mixed bacteria microbial fermentation technology, wherein the mixed bacteria aerobic fermentation strain mainly comprises aspergillus niger, bacillus subtilis and bacillus cereus. The obtained antarctic krill polypeptide has strong health care effects of benefiting spleen and invigorating stomach, and the extract can be subjected to concentration, adsorption drying, alcohol precipitation or resin purification and other treatments according to application ways, so that the efficient utilization in the fields of health care, food, medicine and the like is met. The process is simple and efficient, the obtained product has strong oxidation resistance, strong spleen-tonifying and stomach-invigorating health care effects, strong product stability and low production cost, and is easy for industrial mass production.)

一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品

技术领域

本发明涉及一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品及其制备工艺，尤其是一种利用微生物协同发酵制备高抗氧化能力的南极磷虾多肽生物制品，属于海洋生物技术领域。

背景技术

南极洲是地球上唯一没有受到污染的大陆，曾被誉为“洁白无瑕”的世界，是地球上的最后一块“净土”。南极大陆周围的海洋被称为富饶、洁净的“海上牧场”，海洋里充满了生机，那里有海藻、珊瑚、海星和海绵，大海里还有许许多多叫做磷虾的微小生物，它是南极洲众多的鱼类、海鸟、海豹、企鹅以及鲸类赖以生存的食物，它在南大洋食物链中起着十分重要的作用。南极磷虾是继粮食、石油、煤炭之后的地区第四大资源。南极磷虾的蕴藏量十分惊人，而且营养价值极高。它是人们今天已经发现的含蛋白质最高的生物，蛋白质含量达百分之五十以上，而且还含有极为丰富的人体组织所必需的氨基酸和维生素A。

目前南极磷虾在医药、食品中的应用以南极磷虾油为主。南极磷虾油利用专利超低温萃取的方式提取，是大自然馈赠给人类的天然健康食品，含有其他食品不能替代的功效。美国临床证实，磷虾油具有超强的降血脂，降血糖，降血压，穿越血脑屏障营养及活化脑部细胞和神经，起到预防和治疗脑血管疾病；同时，预防和治疗冠状动脉粥样硬化，冠心病，预防发生心梗、支架、搭桥及二次复发等心血管疾病；此外，南极磷虾油还可以起到抗菌消炎，预防癌症的发生发展，延缓疲劳，调节内分泌等多重功效。随着南极磷虾油的应用推广，加工业发展迅速，产生了大量的南极磷虾油加工下脚料，其组成以蛋白为主，因而对南极磷虾油加工下脚料的资源互利用成为本领域亟待解决的技术问题。

现有技术中，关于南极磷虾多肽的制备方法相对较少，多以酶解法为主，如专利201810373432.5公开了一种组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物及制备N-乙酰葡萄糖胺的方法；首先涉及脱脂南极磷虾粉的预处理，通过碱性蛋白酶预处理回收脱脂南极磷虾粉中的多肽，使原料得到充分利用，并且提高了脱脂南极磷虾粉中几丁质相对含量。比较上述文献可以发现，关于南极磷虾多肽的制备多采用复合酶解法，缺少复合微生物发酵资源化利用南极磷虾油加工下脚料的关键技术及其应用，尤其是缺乏提高南极磷虾多肽营养性的研究成为制约产业发展的关键瓶颈。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，满足南极磷虾多肽高效提取及益脾健胃保健功效中的应用，本发明提供一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，研制开发出具有显著益脾健胃功效的南极磷虾多肽生物制品，满足保健、医疗、食品等领域对南极磷虾多肽的应用需求，该工艺工艺简单高效、所得产品抗氧化能力和益脾健胃保健功效强，生产成本低，易于工业化规模生产。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品，其特征在于具体包括如下步骤：

（1）溶解：将南极磷虾油加工下脚料粉碎，加水搅拌至完全溶解；

（2）酶解：向溶解后的加入南极磷虾油加工下脚料质量比2～3%的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4～8h；

（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2～3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵6～12h；

（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入1～2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8～16h；

（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为南极磷虾多肽提取液。

上述步骤（1）中最佳加水比例为南极磷虾油加工下脚料：水=1:8。

优选的，在南极磷虾油加工下脚料溶解过程中加入南极磷虾油加工下脚料质量比2～3%的茯苓多糖。

上述步骤（2）中所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的组合，其质量比为2:1。

上述步骤（3）中所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3:1。

上述步骤（3）中好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m³/m³.min，搅拌转速控制在300～600r/min。

黑曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

上述枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

本发明提供一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品，所得南极磷虾多肽具有较强的抗氧化能力和益脾健胃保健功效，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。

本发明提供一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品，与现有技术相比，具有以下显著优势：

（1）本申请以南极磷虾油加工下脚料为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，显著提升了南极磷虾油加工下脚料抗氧化能力；尤为重要的是，本申请创造性的发现，在南极磷虾油加工下脚料蛋白溶解液中加入一定比例的茯苓多糖可以显著提高酶解发酵法制备的南极磷虾多肽的益脾健胃保健功效，分析原因可能是茯苓多糖与南极磷虾多肽间复杂的化合反应起到了提高益脾健胃功效的作用，且茯苓多糖能够促进微生物的发酵作用，进一步提升产品的抗氧化能力；

（2）本申请利用好氧菌（黑曲霉、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌）共同发酵南极磷虾油加工下脚料提取南极磷虾多肽，充分利用微生物间的协同作用，提升南极磷虾多肽的提取率和体外抗氧化能力，其中：黑曲霉在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的多肽等功能活性物质从细胞壁中释放出来，有利于提升南极磷虾多肽的体外抗氧化能力；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产淀粉酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用；、蜡状芽孢杆菌的加入尽管对多肽的提取率影响不大，但是显著提升了产品的益脾健胃保健功效；

（3）本发明采用两岐双歧杆菌进行厌氧发酵，提升了南极磷虾多肽的稳定性，试验结果表明，在20～80℃范围内，温度和时间对南极磷虾油加工下脚料蛋白水解肽抗氧化性影响不大，当温度超过100℃时抗氧化性随着温度和时间的增加开始降低，稳定性高于目前报道的技术水平。

具体实施方式

在本申请中，黑曲霉和枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的活化方法如下：

（1）黑曲霉种子液制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL；

（2）上述枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

实施例1

一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品，具体工艺步骤包括：

（1）溶解：将南极磷虾油加工下脚料粉碎，加水搅拌至完全溶解；加水比例为南极磷虾油加工下脚料：水=1:8；

（2）酶解：向溶解后的加入南极磷虾油加工下脚料质量比3%的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解6h；所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的组合，其质量比为2:1；

（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3:1；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m³/m³.min，搅拌转速控制在300～600r/min；

（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8h；

（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为南极磷虾多肽提取液。

实施例2

一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品，具体工艺步骤包括：

（1）溶解：将南极磷虾油加工下脚料粉碎，加水搅拌至完全溶解，并加入南极磷虾油加工下脚料质量比2%的茯苓多糖；加水比例为南极磷虾油加工下脚料：水=1:8；

（2）酶解：向溶解后的加入南极磷虾油加工下脚料质量比3%的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解6h；所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的组合，其质量比为2:1；

（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3:1；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m³/m³.min，搅拌转速控制在300～600r/min；

（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8h；

（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为南极磷虾多肽提取液。

实施例3

一种益脾健胃南极磷虾油多肽生物制品，具体工艺步骤包括：

（1）溶解：将南极磷虾油加工下脚料粉碎，加水搅拌至完全溶解，并加入南极磷虾油加工下脚料质量比3%的茯苓多糖；加水比例为南极磷虾油加工下脚料：水=1:8；

（2）酶解：向溶解后的加入南极磷虾油加工下脚料质量比3%的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解6h；所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的组合，其质量比为2:1；

（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3:1；好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m³/m³.min，搅拌转速控制在300～600r/min；

（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8h；

（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为南极磷虾多肽提取液。

实施例4 不同工艺条件对南极磷虾多肽提取液抗氧化能力的影响

测定实施例和对比实施例中南极磷虾多肽提取液的抗氧化能力，其中·OH自由基清除率的测定参照邵秀芝等《食品化学试验》中所述方法；ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率的测定参照林恋竹等《反应时间对DPPH法、ABTS法评价抗氧化性结果的影响》中所述方法；测定结果如下：

上述试验中对照1试验组中好氧发酵中不含蜡状芽孢杆菌，其余同实施例2。试验结果表明本申请南极磷虾多肽提取液具有显著的抗氧化能力，茯苓多糖能够较好的提高保健品的抗氧化能力，蜡状芽孢杆菌对产品的抗氧化能力影响不显著。

实施例5 不同工艺条件对健胃海洋保健品健胃功效的影响

1、对大鼠胃消化功能的影响试验

试验方法为：选健康大鼠40只,按性别、体重分层随机分6组,每组10只,雌雄各半。以上各组药物的剂量均配成12mL,按大鼠体重1.2mL/100g灌胃(ig),每日一次,连续3d。末次ig后,大鼠禁食(不禁水)24h。大鼠用***麻醉,剪开腹腔,结扎幽门,再由十二指肠ig1次,缝合切口。3h后折线取出胃,沿大弯剪开,倒出胃内容物收集在刻度离心管,1500r/min,离心15min记录胃液量。用滴定法测定胃总酸,用Mett法测定胃蛋白酶；对照1试验组中好氧发酵中不含蜡状芽孢杆菌，其余同实施例2；对照2试验组中好氧发酵中仅含蜡状芽孢杆菌，其余同实施例2；对照3试验组中不含好氧发酵过程，其余同实施例2。

2、对小鼠肠运动功能的影响

试验方法为：选体重18～22g健康小鼠40只,按性别随机分5组,每组10只,雌雄各半；以上各药均配成等体积40mL,各组小鼠按体重0.2mL/10g ig2次(间隔4h)。末次ig后1h,按体重ig炭末液(5g炭末、1.5g梭甲基纤维素/100mL);ig后30min,小鼠脱颈椎处死,剪开腹腔取出小肠,测量炭末推进距离和小肠全长,计算炭末推进百分率,试验结果如下表所示：

上述实验结果表明本发明产品具有较好的益脾健胃保健效果，茯苓多糖的添加显著提升了产品的益脾健胃保健功效。蜡状芽孢杆菌与其余微生物间的协同作用更是取得了“1+1>2”的技术效果。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。