一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用 (Preparation method and application of anti-tumor vaccine based on cell microvesicles ) 是由 赵洪娟 王蕾 张振中 赵倍倍 吴丽遐 于 2019-12-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用,可有效解决产率高,普适性好,可对肿瘤细胞产生强效杀伤作用,改善肿瘤微环境,修复免疫系统,提高机体的抗肿瘤免疫应答,从而达到控制肿瘤的效果的抗肿瘤疫苗制备问题。方法是,制备负载免疫调节剂的肿瘤细胞微囊泡,通过微囊泡表面连接负载佐剂的脂质体稳定形成抗肿瘤疫苗,本发明产率高,普适性好,可对肿瘤细胞产生强效杀伤作用,改善肿瘤微环境,修复免疫系统,提高机体的抗肿瘤免疫应答,方法简单,效率高,制备的微囊泡来源于细胞,数量充足、来源广泛,易于规模化生产,提高佐剂生物利用度,有效用于制备基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗,应用在不同类型肿瘤的预防及治疗中。(The invention relates to a preparation method and application of an anti-tumor vaccine based on cell microvesicles, which can effectively solve the preparation problem of the anti-tumor vaccine which has high yield and good universality, can generate a strong killing effect on tumor cells, improve the tumor microenvironment, repair an immune system and improve the anti-tumor immune response of an organism so as to achieve the effect of controlling tumors. The method comprises the steps of preparing the tumor cell microvesicle loaded with the immunomodulator, and stably forming the anti-tumor vaccine by connecting the liposome loaded with the adjuvant on the surface of the microvesicle.)
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用。
背景技术
从2011年免疫检查点抑制剂CTLA-4抗体，到2014年PD-1，再到2017年CAR-T细胞免疫疗法获批，肿瘤免疫治疗频频传来捷报，这一重大科学突破有望成为癌症治疗的主流。肿瘤疫苗作为肿瘤免疫疗法其中的一个重要分支，近年来也成为肿瘤治疗研究领域的大热点。肿瘤疫苗通过表达特异性的、具有免疫原性的肿瘤抗原（如：肿瘤细胞裂解物、肿瘤相关蛋白或多肽等），在细胞因子、趋化因子等佐剂的辅助下，重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤细胞。
肿瘤细胞来源的微颗粒是在肿瘤细胞激活或者调亡时，改变细胞骨架释放的一种大小在100-1000nm之间的囊泡状亚细胞结构。肿瘤细胞来源的微颗粒（Tumor-derivedmicroparticles， T-MPs）携带有肿瘤自身抗原，比外泌体和肿瘤细胞裂解物具有更强的免疫原性，能够诱导更高效的T细胞依赖的抗肿瘤免疫应答。
肿瘤抗原的存在是肿瘤免疫的基础，然而共刺激信号对免疫应答的激活却是不可或缺的，只有抗原而缺乏免疫刺激信号的疫苗则会引起机体的免疫耐受。免疫佐剂简称佐剂，即非特异性免疫增生剂，指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。合成的含有非甲基化的胞嘧啶-磷酸化-鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸（CpG ODNs）是天然免疫系统的潜在激活剂。这些序列可以与抗原呈递细胞内涵体中的 Toll 样受体-9（TLR9）结合，然后促进共刺激分子的表达、炎症细胞因子的分泌和 CD8+T 细胞的反应。
虽然抗肿瘤疫苗在免疫学理论上是很成功的，但其抗肿瘤疗效却一直不理想，这主要是因为肿瘤已经存在的抑制性肿瘤微环境，会导致抗原刺激/协同刺激缺乏，使效应淋巴细胞缺乏致敏，以及抗原特异性 T 细胞短暂激活、耗竭，从而导致体内免疫系统的抗肿瘤作用低下。
目前，有专利文献公开了来源于有核哺乳动物细胞的微囊泡，所述微囊泡比所述有核细胞小，可用于将治疗物质或诊断物质递送至特定组织或特定细胞，更具体地，该发明涉及来源于单核细胞、巨噬细胞、树枝状细胞、干细胞等等的微囊泡，所述微囊泡可用于递送治疗和或诊断与癌症、血管疾病、炎症等相关的组织的特定治疗物质或诊断物质。但现有技术中还未见用肿瘤细胞微囊泡作为纳米四氧化三铁载体，用以捕获佐剂脂质体作为疫苗实现抗肿瘤治疗的报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用，可有效解决产率高，普适性好，可对肿瘤细胞产生强效杀伤作用，改善肿瘤微环境，修复免疫系统，提高机体的抗肿瘤免疫应答，从而达到控制肿瘤的效果的抗肿瘤疫苗制备问题。
本发明解决的技术方案是，一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法，负载免疫调节剂的肿瘤细胞微囊泡，通过微囊泡表面连接负载佐剂的脂质体稳定形成抗肿瘤疫苗，具体包括以下步骤：
1）、制备负载免疫调节剂的肿瘤细胞微囊泡：
（1）、将肿瘤细胞于含10%胎牛血清的RIPM1640培养基中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养；
所述的肿瘤细胞为卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌或黑色素瘤细胞的一种或多种；
（2）、将免疫调节剂与含胎牛血清的RIPM1640培养基混合后加入到贴壁生长的肿瘤细胞中，并紫外照射肿瘤细胞60min使其发生凋亡；
所述的免疫调节剂为治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌或黑色素瘤的免疫调节剂中的一种或多种；
（3）、继续置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中孵育肿瘤细胞16h，收集步骤中（2）处理细胞后的培养基上清，用差速离心的方法收集得到负载免疫调节剂的肿瘤微囊泡；
（4）、用100微升的无菌生理盐水重悬5×106个肿瘤细胞来源的微囊泡，-80℃保存；
2）、制备负载佐剂的脂质体；
（1）、将2.2毫克(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺 （DOTAP）、6.6毫克二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）和1.2毫克二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（DSPE-PEG2000-Mal）溶解于15ml氯仿并超声15min；
（2）、旋蒸至氯仿全无后，加入1毫升含1OD CpG-ODN佐剂的pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液，37℃条件下继续孵育1 h形成脂质体膜；
所述的佐剂为铝盐、蛋白类、核酸类佐剂CpG-ODN、含脂类、混合类佐剂；
（3）、收集脂质体膜后，以200W功率碳超15次，每次碳超3s，得负载佐剂的脂质体；
3）、微囊泡捕获脂质体制备抗肿瘤疫苗：
（1）、将50μg的肿瘤微囊泡，其中负载免疫调节剂250μg，与负载0.3μg 佐剂的脂质体在4℃下孵育12h；
（2）、4℃，14000g离心60min收集沉淀，得微囊泡与脂质体结合的抗肿瘤疫苗（即基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗）。
本发明提供一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备及应用，产率高，普适性好，可对肿瘤细胞产生强效杀伤作用，改善肿瘤微环境，修复免疫系统，提高机体的抗肿瘤免疫应答，其中细胞微囊泡为负载免疫调节剂的肿瘤细胞微囊泡，通过微囊泡表面连接负载佐剂的脂质体稳定形成抗肿瘤疫苗，激活免疫应答，改善免疫抑制肿瘤微环境，增强免疫细胞浸润，逆转“冷”肿瘤为“热”肿瘤。同时方法简单，效率高，制备的微囊泡来源于细胞，数量充足、来源广泛，易于规模化生产。制备的脂质体响应性释放佐剂，提高佐剂生物利用度，有效用于制备基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗，应用在不同类型肿瘤的预防及治疗中，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明微颗粒疫苗促进APCs熟化图（升高的共刺激分子CD86/80/40在CD45+CD11b+F4/80+巨噬细胞和CD45+CD11c+树突细胞的升高显示了微颗粒疫苗可以促进APCs，包括巨噬细胞和树突细胞的成熟）；
图2为本发明微颗粒疫苗促进细胞因子分泌图（抗肿瘤免疫因子TNF-α，IL-6和IL-12p70的分泌在微颗粒疫苗组是最多的，显示了微颗粒疫苗可以增加免疫因子的分泌）；
图3为本发明微颗粒疫苗免疫小鼠后脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的淋巴细胞的ELISPOT数据图（IFN-γ的斑点数微颗粒疫苗组显著增多，显示了小鼠经微颗粒疫苗免疫后，脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数目升高了）；
图4为本发明抗肿瘤微颗粒疫苗预防性免疫策略的实验程序图（在第1，2，7天微颗粒免疫小鼠后，第8天注入黑色素瘤细胞）；
图5为本发明小鼠预防性免疫微颗粒疫苗后小鼠肿瘤生长曲线图（显示了微颗粒疫苗免疫小鼠后显著抑制肿瘤生长）；
图6为本发明黑色素瘤的治疗性免疫策略的实验程序图（在第0天注入黑色素瘤细胞，第4，7，10天给与治疗）；
图7为本发明C57BL/6小鼠肿瘤治疗性免疫微颗粒疫苗后小鼠肿瘤生长曲线图和存活率图（显示了微颗粒疫苗可以显著抑制黑色素瘤的生长，并大大延缓小鼠的生存周期）；
图8为本发明结肠癌的治疗性免疫策略的实验程序图；
图9为本发明BALB/C小鼠肿瘤治疗性免疫微颗粒疫苗后小鼠肿瘤生长曲线图（显示了微颗粒疫苗可以显著抑制结肠癌的生长）。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）、制备负载免疫调节剂纳米四氧化三铁的鼠源B16F10黑色素瘤细胞微囊泡：
（1）、将鼠源B16F10黑色素瘤细胞于含10%胎牛血清的RIPM1640培养基中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养；
（2）、用免疫调节剂纳米四氧化三铁与含胎牛血清的RIPM1640培养基混合后加入到贴壁生长的鼠源B16F10黑色素瘤细胞中，并紫外照射鼠源B16F10黑色素瘤细胞60min使其发生凋亡；
（3）、继续置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中孵育鼠源B16F10黑色素瘤细胞16h，收集步骤中（2）处理细胞后的培养基上清，用差速离心的方法收集得到负载免疫调节剂纳米四氧化三铁的肿瘤微囊泡；
（4）、用100微升的无菌生理盐水重悬5×106个肿瘤细胞来源的微囊泡，-80℃保存；
2）、制备负载佐剂CpG-ODN的脂质体；
（1）、将2.2毫克(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺 （DOTAP）、6.6毫克二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）和1.2毫克二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（DSPE-PEG2000-Mal）溶解于15ml氯仿并超声15min；
（2）、旋蒸至氯仿全无后，加入1毫升含2OD CpG-ODN佐剂的pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液，37℃条件下继续孵育1 h形成脂质体膜；
（3）、收集脂质体膜后，以200W功率碳超15次，每次碳超3s，得负载佐剂CpG-ODN的脂质体；
3）、微囊泡捕获脂质体制备抗肿瘤疫苗：
（1）、将50μg的肿瘤微囊泡，其中负载纳米四氧化三铁250μg，与负载0.3μg 佐剂CpG-ODN的脂质体在4℃下孵育12h；
（2）、4℃，14000g离心60min收集沉淀，得微囊泡与脂质体结合的抗肿瘤疫苗（即基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗）。
所述方法制备的基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌或黑色素瘤。
所述的基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为黑色素瘤。
本发明制备方法简单，方便、高效，制备的微颗粒来源于肿瘤细胞，数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。本发明首次使用微颗粒包载免疫调节剂纳米四氧化三铁，并通过表面巯基成功捕获负载佐剂CpG的脂质体制备抗肿瘤疫苗。经实验研究发现，微颗粒疫苗预防性免疫小鼠后能够促进APCs熟化，激活机体产生强烈的肿瘤特异性的细胞免疫应答，并诱导肿瘤细胞特异性损伤；微颗粒疫苗，免疫小鼠后可以极化TAMs，改善肿瘤免疫抑制性微环境，并预防肿瘤生成；微颗粒疫苗，可以治愈部分小鼠移植肿瘤，治愈效果显著，可以作为一种有效的肿瘤治疗性疫苗；首次将微颗粒应用于肿瘤疫苗的设计中，并显现了显著的抗肿瘤免疫效应，为个体化肿瘤疫苗设计提供了技术支持，并经实验，效果非常好，有关资料如下：
一、Fe3O4/T-MPs的制备及形态鉴定试验
在RPMI 1640细胞培养液中培养小鼠黑色素瘤细胞系B16F10（C57BL/6遗传背景）使细胞量达到1×107，小鼠黑色素瘤细胞进行紫外线照射60min（紫外线装置为常规生物安全柜所有），加入终浓度为50μg/ml的纳米四氧化三铁。置于培养箱中继续培养。16h后，显微镜下观察小鼠黑色素瘤细胞凋亡情况。通过离心收集上述凋亡肿瘤细胞的囊泡，包括：先以1000g离心10分钟除去细胞碎片；取离心后的上清再以14000g离心60min收集沉淀，用PBS重悬，得到来自小鼠黑色素瘤细胞凋亡所产生的载纳米四氧化三铁囊泡（Fe3O4/T-MPs）。
通过透射电子显微镜（TEM）观察细胞释放负载纳米四氧化三铁囊泡并观察Fe3O4/T-MPs形貌。
二、CpG/Lipo的制备及形态鉴定试验
将10mg的脂质材料，包括(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺 （DOTAP）、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（DSPE-PEG2000-Mal），质量比为22/66/12，分散于15ml氯仿并超声15min使其全部溶解；旋蒸至氯仿全无后加入含2OD佐剂CpG的磷酸缓冲盐溶液（1ml）继续孵育1 h形成载CpG的脂质体膜；收集脂质体膜后以200W功率碳超15次，每次碳超时长为3s，即得负载了CpG得脂质体（CpG/Lipo）。
通过TEM观察CpG/Lipo的形貌：用移液枪将CpG/Lipo溶液充分吹打均匀，吸取10μl滴到200目的载样铜网上，室温静置10min后小心吸掉多余液体，干燥后于透射电镜成像拍照。结果如图所示，可见直径约为60nm左右的圆形双层膜结构，证明所制备的CpG/Lipo符合脂质体的特征。
三、Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo的制备及形态鉴定试验
将50μg的肿瘤微囊泡，其中负载纳米四氧化三铁250μg，与负载了0.3μg的CpG脂质体在4℃下孵育12h；随后在4℃，14000g离心60min收集沉淀，得到微囊泡与脂质体结合的抗肿瘤疫苗（Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo）。
将Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo疫苗通过TEM观察微颗粒疫苗形貌：用移液枪将Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo溶液充分吹打均匀，吸取10μl滴到200目的载样铜网上，室温静置10min后小心吸掉多余液体，干燥后于透射电镜成像拍照。结果如图所示，可见大量CpG/Lipo结合在Fe3O4/T-MPs表面，证明Fe3O4/T-MPs成功捕获CpG/Lipo形成疫苗。
四、测定疫苗抗原表达试验
通过用western blotting法检测所制备微囊泡表面的标志性蛋白结果如图所示，制备的微囊泡表达黑色素瘤标志物gp100，Trp2，MART1 and Hsp70，Actn4，Tnpo3 and Cpsf3lpan-cadherin和Na+/K+-ATPase，证明其来源于黑色素瘤细胞。
五、疫苗诱导小鼠免疫应答试验
雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，在诱导小鼠免疫应答试验中，小鼠分为7组，每组7只小鼠，分别为对照组，Fe3O4/T-MPs组，CpG/Lipo组，Fe3O4/T-MPs+CpG组，Fe3O4/T-MPs+CpG/Lipo组，T-MPs-CpG/Lipo组和Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo组，免疫剂量为50μg的T-MPs，250μg纳米四氧化三铁，0.3μg的CpG，皮下注入小鼠24h后，剥离小鼠***和脾脏，通过流式细胞术（FCM）检测***和脾脏细胞中抗原提呈细胞（APCs），T淋巴细胞和细胞因子（TNF-α，IL-6，IL-12）的水平，发现以微颗粒疫苗免疫小鼠可以促进APCs熟化（见图1），升高的共刺激分子CD86/80/40在CD45+CD11b+F4/80+巨噬细胞和CD45+CD11c+树突细胞的升高显示了微颗粒疫苗可以促进APCs，包括巨噬细胞和树突细胞的成熟，显著提高淋巴和脾脏中T细胞的水平，并促进抗肿瘤细胞因子分泌（见图2），抗肿瘤免疫因子TNF-α，IL-6和IL-12p70的分泌在微颗粒疫苗组是最多的，显示了微颗粒疫苗可增加免疫因子的分泌。
六、预防性免疫策略和小鼠移植肿瘤模型建立试验
雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，在预防性免疫试验中，小鼠首先免疫3次，小鼠分为7组，每组7只小鼠，分别为对照组，Fe3O4/T-MPs组，CpG/Lipo组，Fe3O4/T-MPs+CpG组，Fe3O4/T-MPs+CpG/Lipo组，T-MPs-CpG/Lipo组和Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo组，免疫剂量为50μg的T-MPs，250μg纳米四氧化三铁，0.3μg的CpG。在第三次免疫后，在小鼠右侧腹皮下注射200ul B16F10细胞（细胞浓度1×106cells/ml）。肿瘤接种后，隔天测量肿瘤大小。结果显示，Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo疫苗组6只小鼠，5只小鼠肿瘤未生长。在第三次免疫后第二天，取小鼠的脾脏，进行免疫学检测，利用ELISPOT检测抗原特异性的分泌IFN-γ的淋巴细胞，应用gp100（EGSRNQDWL）和Trp2（SVYDFFVWL）肽进行刺激，操作步骤按Mouse IFN-γprecoatedELISPOT试剂盒（北京达科为生物技术有限公司）的说明书进行，即取小鼠脾脏淋巴细胞，铺至96孔细胞培养板，每孔100ul体积，细胞数为2×105个细胞，并应用2ug/ml的gp100和Trp2肽进行体外刺激，37℃、5% CO2培养箱内培养24h。
七、小鼠移植黑色素瘤瘤模型建立和治疗性免疫肿瘤试验
雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，在治疗性免疫试验中，先在小鼠右侧腹部皮下注射200ulB16F10细胞（细胞浓度1×106cells/ml），在接种4天后，小鼠接受免疫3次，联合PD-L1抑制剂（α PD-L1，clone: RMP1-14，100μg），小鼠分为4组，每组6只小鼠，分别为对照组，α PD-L1组，Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo组和Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo+α PD-L1组，免疫剂量为50μg的T-MPs，250μg纳米四氧化三铁，0.3μg的CpG。结果显示，微颗粒疫苗协同PDL1抑制显著延缓了小鼠黑色素瘤的疾病进展，并延长了所有小鼠的中位生存期超过了3个月。
八、小鼠移植结肠癌模型建立和治疗性免疫肿瘤试验
雌性BALB/C小鼠，6-8周龄，在治疗性免疫试验中，先在小鼠右侧腹部皮下注射200ulCT26细胞（细胞浓度1×106cells/ml），在接种4天后，小鼠接受免疫3次，联合PD-L1抑制剂（α PD-L1，clone: RMP1-14，100 μg），小鼠分为4组，每组6只小鼠，分别为对照组，α PD-L1组，Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo组和Fe3O4/T-MPs-CpG/Lipo+α PD-L1组，免疫剂量为50μg的T-MPs，250μg纳米四氧化三铁， 0.3μg的CpG。微颗粒来源于结肠癌细胞系CT26（BALB/C遗传背景）。结果显示，微颗粒疫苗协同PDL1抑制显著延缓了小鼠结肠癌的疾病进展，并大大延长了所有小鼠的寿命。
统计学分析：统计数据以平均值±标准误的形式给出，GraphPad Prism 5.0统计软件处理数据，组件比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验，P
试验清楚表明，将B16F10细胞来源的微颗粒疫苗皮下注入到C57BL6小鼠，24h后观察收集小鼠的***和脾脏，通过流式细胞术（FCM）检测***和脾脏细胞中抗原提呈细胞（APCs），T淋巴细胞和细胞因子（TNF-α，IL-6，IL-12）的水平，发现以微颗粒疫苗免疫小鼠可以促进APCs熟化，显著提高淋巴和脾脏中T细胞的水平，并促进抗肿瘤细胞因子分泌。
将B16F10细胞来源的微颗粒疫苗以预防性策略免疫C57BL6小鼠，即免疫三次再接种肿瘤，观察小鼠肿瘤生长情况，发现微颗粒疫苗免疫小鼠，小鼠肿瘤生长受到显著抑制。在肿瘤植入后20天，收集小鼠肿瘤组织，通过FCM和免疫荧光（IF）检测肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），T细胞和细胞因子（IFN-γ，IL-10，TGF-β）的表达水平，IFN-γ的斑点数微颗粒疫苗组显著增多，显示了小鼠经微颗粒疫苗免疫后，脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数目升高，发现微颗粒疫苗可以显著改善肿瘤抑制性微环境。
将微颗粒疫苗以治疗性策略免疫小鼠，即分别接种黑色素瘤和结肠癌肿瘤细胞于C57BL6和BALB/C小鼠4天后，分别将B16F10和CT26来源的微颗粒疫苗进行疫苗干预，结合PD-L1抑制剂共免疫三次，观察小鼠肿瘤生长情况。结果显示，微颗粒疫苗协同PDL1抑制显著延缓了小鼠黑色素瘤和结肠癌的疾病进展，并大大延长了所有小鼠的寿命，尤其是黑色素瘤中，小鼠的中位生存期超过了3个月。
总之，本发明制备方法简单、方便、高效，制备的微颗粒来源于肿瘤细胞，数量充足、来源广泛，易于规模化生产，开拓了制备抗肿瘤药物的新途径，是抗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益显著。