阅读说明：本技术 新型抗自切碱性蛋白酶的筛选 (Screening of novel autocleavage-resistant alkaline protease ) 是由 路福平 王洪彬 邱悦悦 李雪 王玉迎 刘逸寒 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于酶的基因工程技术领域,具体涉及一种新型的能够抗自切的碱性蛋白酶突变体的筛选。本发明通过对克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶进行改造和筛选获得了抗自切性能优异的突变体,突变体的基因在第493-495位突变为GAT,第799-801位为GAT,相应的氨基酸序列分别是在第161位突变为Thr,第183位为Asp。在40℃恒温孵育48h后,碱性蛋白酶突变体的酶活保留率比野生型碱性蛋白酶的酶活提高了40％以上。抗自切碱性蛋白酶分子的筛选,有助于改善碱性蛋白酶的储存和应用效果。(The invention belongs to the technical field of enzyme genetic engineering, and particularly relates to screening of a novel alkaline protease mutant capable of resisting autogenous cutting. The invention obtains the mutant with excellent anti-autocleaving performance by modifying and screening the alkaline protease from the Bacillus clausii, the gene of the mutant is mutated into GAT at the 493-and 495-positions, GAT at the 799-and 801-positions, the corresponding amino acid sequences are respectively mutated into Thr at the 161-position and Asp at the 183-position. After incubation for 48h at the constant temperature of 40 ℃, the enzyme activity retention rate of the alkaline protease mutant is improved by more than 40 percent compared with the enzyme activity of wild alkaline protease. The screening of the anti-self-cutting alkaline protease molecule is beneficial to improving the storage and application effects of the alkaline protease.)

新型抗自切碱性蛋白酶的筛选

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及新型抗自切碱性蛋白酶的筛选

背景技术

碱性蛋白酶(alkaline protease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的一类酶，其最适pH一般为9～11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，分子量约为27kDa。碱性蛋白酶主要应用于加酶洗涤剂工业，同时也广泛应用在食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业，是工业用酶中占据比例最大的酶类。

微生物来源的碱性蛋白酶位点特异性比较弱，因此在肽键羧基侧具有芳香族的氨基酸或疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸)都可以成为碱性蛋白酶的切割位点，这种广泛的位点选择性可以使碱性蛋白酶快速水解底物，因此普遍应用于食品工业。然而，这种水解位点的广泛性同时加剧了碱性蛋白酶在水解底物中的自切现象。在一般介质中，两个碱性蛋白酶分子相互碰撞，位于蛋白酶表面的特异性氨基酸位点成为了首要切割对象，尤其是当存在于β-转角、loop这种较为松散的二级结构上的氨基酸被切割后，可能会引起碱性蛋白酶的活性中心裸露，活性中心被识别切割后导致蛋白酶迅速失活。在长时间的运输保存过程中，极易发生自切，造成酶活的大量损失，为了让蛋白酶长时间保持活力无疑增加了很大的生产成本。因此目前急需开发一种能较长时间保持高酶活力的碱性蛋白酶产品。

本发明针对碱性蛋白酶表面特异性氨基酸的查找分析确定易自切位点，随后通过Discovery Studio软件进行虚拟氨基酸突变确定最佳突变的氨基酸类型。本发明是为了提供一种能够在酶活不降低的情况下且能抗自切的碱性蛋白酶突变体。所述突变体是由克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)碱性蛋白酶基因aprE的成熟肽出发，通过分子模拟和定点突变等技术获得的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够抗自切的碱性蛋白酶突变体。本发明以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE为基础，通过对碱性蛋白酶表面疏水氨基酸的查找分析确定易自切位点，随后通过Discovery Studio软件进行虚拟氨基酸突变确定最佳突变的氨基酸类型。之后通过设计引物进行反向PCR技术引入突变位点，获得了2个碱性蛋白酶突变体pQY-5、pQY-6，并分别构建了表达上述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌QY-5，QY-6，发酵48h后酶活分别为27U/mL、31U/mL，比重组表达野生型碱性蛋白酶aprE的酶活分别提高了17％、38％。碱性蛋白酶突变体的酶活保留率比野生型碱性蛋白酶的酶活提高了41％、70％。

实现本发明目的技术路线概述如下：

通过对碱性蛋白酶表面疏水氨基酸的查找分析确定易自切位点，随后通过Discovery Studio软件进行虚拟氨基酸突变确定最佳突变的氨基酸类型。以克劳氏芽孢杆菌基因组为模板，根据GenBank：FJ940727.1克隆得到碱性蛋白酶基因aprE，将其构建在表达载体pWB600上，该基因序列为野生型的碱性蛋白酶基因(SEQ ID NO：1)，之后通过反向PCR技术引入突变位点，对野生型碱性蛋白酶基因定点突变，得到突变体基因(SEQ ID NO：3，5)，构建重组载体，将其转化进枯草芽孢杆菌WB600中进行发酵产酶实验验证，得到能够有效抗自切的碱性蛋白酶突变体。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.碱性蛋白酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如Leul61Thr，表示位置161的氨基酸由野生型碱性蛋白酶的Leu替换成Thr。位置的编号对应于SEQ ID NO：2中野生型碱性蛋白酶的氨基酸序列编号。核苷酸的变化同样采用“原始核苷酸位置替换的核苷酸”来表示，位置编号对应SEQ ID NO：1中野生型碱性蛋白酶的核苷酸序列编号。

在本发明中，aprE表示野生型碱性蛋白酶的基因序列，即原始序列(如SEQ ID NO：1所示)，aprEm则表示碱性蛋白酶突变体的基因序列(如SEQ ID NO：3，5所示)；APRE表示野生型碱性蛋白酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，APREM表示碱性蛋白酶突变体(其氨基酸序列如SEQ ID NO：4，6所示)

碱性蛋白酶	碱基	氨基酸
			APREM-1	第733-735位为ACC	第161位为Thr
APREM-2	第799-801位为GAT	第183位为Asp

所述的碱性蛋白酶突变体的表达宿主为枯草芽孢杆菌WB60，表达载体为pWB980。

本发明的实验步骤具体如下：

1.在PDB结构数据库下载已解析的晶体结构4cfz、4cfy、3bx1、1TK2，找出表面含有F、Y、W的氨基酸残基作为候选突变位点；

2.采用DiscoveryStudio软件对4cfz的161、183位进行虚拟氨基酸突变，计算结果最佳的作为候选突变氨基酸。具体参数为DiscoveryStudio的Mutation Energy中的Calculate Mutation Energy(Stability)模块中，Mutation sites：Single Mutations，Mutations：候选位点》All，力场选择CHARMm Polar H，忽略PH和温度对突变能的影响，获得碱性蛋白酶易自切的位点。

3.构建含有野生型碱性蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌重组菌株

将扩增得到的野生型碱性蛋白酶编码基因aprE进行酶切(图3)，与同样经过酶切的表达载体pWB980(图4)通过连接得到新的重组载体；将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中，得到的重组菌株经过卡那抗性筛选和酶活力测定，获得野生型碱性蛋白酶表达菌株。

4.构建含有突变体碱性蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌重组菌株

将突变位点设计在引物中，以含野生型碱性蛋白酶编码基因的重组质粒aprE-pWB980为模板，通过反向PCR引入突变位点。得到突变体碱性蛋白酶aprEM基因，将扩增得到的线性载体进行自连，得到碱性蛋白酶突变体基因的重组载体。将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中，得到的重组菌株经过测序，得到碱性蛋白酶突变体。

5.发酵制备野生型碱性蛋白酶和突变型碱性蛋白酶

6.通过稳定性考察实验比较不同突变体的酶活保持率，获得酶活力稳定性更高的突变体

7.将上述获得的酶活力稳定性更高的突变体菌株质粒送去测序，获得高稳定性的碱性蛋白酶突变体基因序列。

本发明的有益效果是：克劳氏芽孢杆菌来源的野生型碱性蛋白酶由于自切导致储存或者使用过程中酶活力损失较快，本发明通过基因突变并筛选到了抗自切性能优异的突变基因，该发明有利于促进碱性蛋白酶应用水平的提高。

附图说明

图1碱性蛋白酶表面特异性氨基酸查找

图2碱性蛋白酶表面A：161(Y)，B：183(F)

图3为本发明野生型碱性蛋白酶基因的PCR扩增电泳图

其中：M为DNA Marker，1为aprE基因；

图4为本发明pWB980酶切验证图

其中：M为DNA Marker，1为pWB980--aprE经BamHI和XbaI双酶切；

图5野生型碱性蛋白酶和碱性蛋白酶突变体酶活

图6野生型碱性蛋白酶和碱性蛋白酶突变体酶活保留率

具体实施方式

：

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1：碱性蛋白酶表面特异性位点的查找分析

在PDB结构数据库对碱性蛋白酶序列进行检索，以一致性最高的四个模型作为研究对象，观察共同存在于结构外部的疏水性氨基酸残基。图1-A展示了所有位于碱性蛋白酶表面的疏水氨基酸，但因数量众多，且本身碱性蛋白酶更倾向于切芳香族氨基酸，因此重新选取FYW三个氨基酸作为重点关注位点，之所以没有选择P是因为本身P的特殊性质易造成空间结构上的巨大变化。如图1-B所示，将序列中含有FYW的序列都设为X后与原序列进行比对，白色部分即是差异部分。在图2中同时也展示了原序列的二级结构(红色-α螺旋，蓝色-β折叠，灰色-无规卷曲)。以碱性蛋白酶已解析的3D结构4cfz为观察对象查看这些差异位点是否存在于蛋白酶表面，最终确定161(Y)，183(F)，作为候选突变位点，如图2所示。

实施例2：碱性蛋白酶虚拟氨基酸突变

DiscoveryStudio软件可以使用MODELER程序将氨基酸残基更改为指定类型的其他氨基酸，同时可以设置二硫键、顺式脯氨酸和附加约束来添加建模约束并优化更改后的氨基酸残基。本研究对蛋白质复合物进行单位点虚拟氨基酸饱和突变。对于每一个突变体，计算野生型和突变结构之间的结合自由能的差异。所有的静电能项都是根据输入结构的质子化状态来计算的，该方法利用广义玻恩隐式膜近似来考虑溶剂的影响。静电项近似为库仑相互作用和极性对溶剂化能的贡献之和。能量泛函还包含范德瓦尔斯相互作用能、侧链熵项和非极性表面项。突变能负值对应突变的稳定作用，反之亦然。表1展示了每个位点饱和突变后的最佳三个突变结果，这些候选突变类型为后续分子实验提供了指导作用。

表1 虚拟氨基酸突变能及评价结果

实施例3：野生型碱性蛋白酶aprE重组菌株的构建

1.野生型碱性蛋白酶基因aprE来自劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)，提取其基因组DNA，其提取过程参照试剂盒的操作手册。

设计aprE的扩增引物，序列如下：

引物1：F 5’-CGGGATCCCGGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTG-3’

引物2：R 5’-GCTCTAGAGCTTAGCGTGTTGCCGCTTC-3’

PCR的反应条件为：PrimeSTAR Max Premix(2X)25μl，F(10pmol/μL)2μL，

R(10pmol/μL)2μL，Template 2μL，ddH₂O 50μL。

扩增程序的设置为：预变性：95℃ 5min；变性：95℃ 30s；退火：57℃ 45s；延伸：72℃ 2min；反应30个循环；延伸：72℃ 10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型碱性蛋白酶基因的条带，共1062bp(见图3)，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到了野生型碱性蛋白酶基因，即aprE。

2.含野生型碱性蛋白酶基因表达载体的构建

提取pWB980质粒，其提取过程参照试剂盒的操作手册。经BamHI和XbaI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型碱性蛋白酶基因的条带，共5080bp(见图4)，再由小量DNA回收试剂盒回收产物，得到了载体基因序列。

3.将经BamHI和XbaI双酶切的目标片段(aprE)和载体片段连接形成重组载体，连接条件为16℃4h。

4.将重组载体转化进枯草芽孢杆菌WB600宿主菌中，筛选阳性转化子，得到表达野生型碱性蛋白酶aprE的重组菌株，命名为枯草芽孢杆菌QY。提取枯草芽孢杆菌里的重组质粒，将其命名为pQY(含有野生型aprE基因)。

实施例4利用反向PCR方法构建碱性蛋白酶突变体

1.基于反向PCR技术进行定向突变

反向PCR的反应条件为：PrimeSTAR Max Premix(2X)25μl，F(10pmol/μL)2μL，

R(10pmol/μL)2μL，Template 2μL，ddH₂O 50μL。

引物3：F 5’-AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCACCCCGGC-3’

引物4：R 5’-CCCAGATGCCGCTACAACAAGAACGCCTCTAGAAG-3’

引物5：F 5’-AACAACAACCGCGCCAGCGATTCACAGTATGGC-3’

引物6：R 5’-TTGGTCAGTAGCTCCGACTGCCATTGCGTTCG-3’

以引物3，4及引物5，6分别为上游引物和下游引物，扩增条件为：94℃ 10min；94℃60s，58℃ 1.5min，72℃ 2min，30个循环；72℃ 10min。

2.含突变体表达载体构建

将PCR产物进行自连，得到碱性蛋白酶突变体基因的重组载体，将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中，得到碱性蛋白酶突变体。

实施例5碱性蛋白酶突变体的筛选

1.初筛

将实施例2获得的表达碱性蛋白酶突变体的重组菌株接种与卡那霉素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于50mL LB培养基(卡那霉素抗性)中37℃、220r/min振荡培养48h，同时，接种枯草芽孢杆菌QY作为对照。

以AAPF为底物，测定发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活，最终共筛选到2株发酵液酶活力显著高于枯草芽孢杆菌QY的菌株，并将其分别命名为枯草芽孢杆菌QY-5，QY-6。

2.发酵和酶液制备

将上述筛选到的2株菌株(QY-5，QY-6)和对照菌枯草芽孢杆菌QY，接种与卡那霉素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL LB培养基(卡那霉素抗性)中，37℃振荡培养12h，以2％的接种量接种于100mL LB培养基(卡那霉素抗性)中，37℃振荡培养48h。将发酵得到的酶液进行超滤纯化后在40℃恒温孵育48h，定点取样并测定酶活。

3.抗自切性能评估实验

以AAPF为底物，分别检测上述2株菌株(QY-5，QY-6)和对照菌枯草芽孢杆菌QY发酵48h后上清液的酶活，其中碱性蛋白酶突变体酶活分别为27U/mL、31U/mL，比重组表达野生型碱性蛋白酶aprE的酶活分别提高了17％、38％。碱性蛋白酶突变体的酶活保留率比野生型碱性蛋白酶的酶活提高了41％、70％。

实施例6碱性蛋白酶突变体序列的确定

经测序得到与虚拟氨基酸突变结果相符的碱性蛋白酶突变体，测序结果显示：枯草芽孢杆菌QY-5中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M5；枯草芽孢杆菌QY-6中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，其编码的氨基酸序列为SEQID NO：6，申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M6；

进一步，申请人将上述获得的碱性蛋白酶aprE-M5和aprE-M6的氨基酸序列分别与野生型碱性蛋白酶aprE的氨基酸序列SEQ ID NO：1进行对比分析。结果显示：与野生型碱性蛋白酶aprE相比，碱性蛋白酶aprE-M5的第161位氨基酸由Tyr突变为Thr；碱性蛋白酶aprE-M2的第183位氨基酸由Phe突变为Asp。