阅读说明：本技术 利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法 (Method for preparing neutral protease by fermenting bacillus subtilis ) 是由 曹倩荣 吴芳彤 刘春卯 郑翔 康捷 秦艳梅 马清河 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物发酵,特别是指一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法。本发明通过通过对培养基及发酵条件进行改善和优化,有效解决了现有枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14837的发酵工艺未经充分优化、距离工业化应用差距较大等技术问题,具有所制备的中性蛋白酶相比西安欧公益制备的中性蛋白酶酶活高、脱毛效果好等优点。(The invention belongs to microbial fermentation, and particularly relates to a method for preparing neutral protease by utilizing bacillus subtilis fermentation. By improving and optimizing the culture medium and the fermentation conditions, the invention effectively solves the technical problems that the existing fermentation process of the Bacillus subtilis CGMCC No.14837 is not fully optimized, the gap from industrial application is large, and the like, and has the advantages that the prepared neutral protease has high enzyme activity and good unhairing effect compared with the neutral protease prepared in the Western-Anoei.)

利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵，特别是指一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法。

背景技术

近年来，随着制革行业环保意识逐步增强，以往粗放型的发展模式在产业结构调整中被逐渐摒弃，环保治污成为行业重中之重。制革工作者对制革方法进行了各种改进，迄今为止最有可能实现工业化的脱毛方法是酶法脱毛。但是由于我国皮革行业清洁化生产技术不足、污染治理难度大、投资费用高等原因，使得制革、毛皮加工工业清洁生产的推广一直阻力重重。蛋白酶能够消解生皮毛囊周围与表皮、真皮连结的蛋白，削弱毛与表皮、真皮的紧密依附，达到脱毛的目的。1398、2709蛋白酶制剂在20世纪初期曾作为脱毛酶应用在制革工艺中，但野生菌株发酵产蛋白酶系中存在胶原蛋白酶，胶原蛋白酶能水解生皮中胶原蛋白，不可避免损伤真皮的结构，影响皮制品的性能。纯化去除胶原蛋白的工艺成本远远超出制革厂的承受范围。

申请人于公开号为CN108070606A的发明专利申请中公开了一种利用分子伴侣prsA构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用。其中构建了一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14837用于酶法脱毛。此工程菌株不含胶原蛋白酶基因，但是由于蛋白分泌瓶颈的限制，现阶段芽孢杆菌的发酵工艺不完善，使用的培养基为最常用的LB普适培养基，不是最适合枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCCNo.14837生长及发酵的培养基，发酵48小时酶活为1186u/ml，使得目前枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14837距离工业应用还有很大差距。对培养基及发酵条件的优化在微生物产业化生产中举足轻重，不仅是从实验室到工业生产的必要环节，而且通过优化提高中性蛋白酶的产量，必然能为制革业的清洁化生产提供全新的方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法，通过对培养基及发酵条件进行改善和优化，达到提高发酵制备的中性蛋白酶酶活的目的。

本发明的整体技术构思是：

利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法，枯草芽孢杆菌的拉丁文名称为Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.14837；包括如下工艺步骤：

A、培养基配制

每升发酵培养基由如下原料组成：

酵母浸粉68-72g/L；NH₄Cl 2.5-3.5g/L；K₂HPO₄ 0.8-1.2g/L；MnSO₄·7H₂O 0.01-0.03g/L；CaCl₂·2H₂O 2.8-3.2g/L；葡萄糖8-12g/L；MgSO₄·7H₂O 1.8-2.2g/L；余量为水；

B、接种

按4％的比例将枯草芽孢杆菌接种于灭菌后的步骤A制备的培养基中，培养基在摇瓶中的装量为体积比等于10％；

C、发酵

在培养温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下发酵，监测葡萄糖含量,当培养基中葡萄糖耗尽时，添加IPTG至其浓度为1‰诱导产酶。

本发明的具体技术构思还有：

由于葡萄糖灭菌温度过高会产生糠醛，培养基颜色变深，糠醛对菌体生长不利；硫酸镁高温不稳定，容易与其它物质反应产生氢氧化镁沉淀。优选的技术方案是，所述的步骤A中葡萄糖及七水合硫酸镁采用单独灭菌。

为抑制培养过程中其它杂菌生长导致影响发酵的品质并增加发酵成本，优选的技术方案是，所述的步骤B的培养基中还包括有氯霉素，氯霉素的浓度为10μl/mL。

为验证本发明的技术效果，申请人采用Folin-酚法(GB/T 23527-2009)对利用现有工艺及本发明中的方法制备的中性蛋白酶的酶活进行测定。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

本发明通过对培养基中碳源、氮源和微量元素进行筛选及优化组合，得到了更适宜枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14837的发酵工艺，经申请人检测，在用本发明的工艺发酵48小时后中性蛋白酶的酶活可达到1653u/ml，相比现有工艺制备的中性蛋白酶的酶活(1186u/ml)提高了39.38％；少量酶液应用于脱毛试验的结果与现有工艺制备的中性蛋白酶相当。本发明对于研究枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.14837高密度生产提供了指导意义。

附图说明

图1是采用本发明中方法制备的中性蛋白酶与现有工艺制备的中性蛋白酶的脱毛效果对比示意图。

其中图1A是采用本发明中方法制备的中性蛋白酶进行脱毛处理前的鲜牛皮表面示意图。

图1B是采用现有工艺制备的中性蛋白酶进行脱毛处理前的鲜牛皮表面示意图。

图1C是加入本发明中方法制备的中性蛋白酶27.2ml进行脱毛处理200分钟后的牛皮表面示意图。

图1D是采用现有工艺制备的中性蛋白酶37.9ml进行脱毛处理200分钟后的牛皮表面示意图。

由图中可知，在脱毛工艺相同的条件下,本发明显著减少了中性蛋白酶酶液的加入量,脱毛效果与现有工艺制备的中性蛋白酶酶液相当。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。

实施例1

利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法，枯草芽孢杆菌的拉丁文名称为Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.14837；包括如下工艺步骤：

A、培养基配制

每升发酵培养基由如下原料组成：

酵母浸粉70g/L；NH₄Cl 3g/L；K₂HPO₄ 1g/L；MnSO₄·7H₂O 0.02g/L；CaCl₂·2H₂O3g/L；葡萄糖10g/L；MgSO₄·7H₂O 2g/L；余量为水；

B、接种

按4％的比例将枯草芽孢杆菌接种于灭菌后的步骤A制备的培养基中，培养基在摇瓶中的装量为体积比等于10％；

C、发酵

在培养温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下发酵，当培养基中葡萄糖耗尽时，添加IPTG至其浓度为1‰诱导产酶。

所述的步骤A中葡萄糖及七水合硫酸镁采用单独灭菌。

所述的步骤B的培养基中还包括有氯霉素，氯霉素的浓度为10μl/mL。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法，枯草芽孢杆菌的拉丁文名称为Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.14837；包括如下工艺步骤：

A、培养基配制

每升发酵培养基由如下原料组成：

酵母浸粉68g/L；NH₄Cl 2.5g/L；K₂HPO₄ 0.8g/L；MnSO₄·7H₂O 0.01g/L；CaCl₂·2H₂O 2.8g/L；葡萄糖8g/L；MgSO₄·7H₂O 1.8g/L；余量为水；

B、接种

按4％的比例将枯草芽孢杆菌接种于灭菌后的步骤A制备的培养基中，培养基在摇瓶中的装量为体积比等于10％；

C、发酵

在培养温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下发酵，当培养基中葡萄糖耗尽时，添加IPTG至其浓度为1‰诱导产酶。

所述的步骤A中葡萄糖及七水合硫酸镁采用单独灭菌。

所述的步骤B的培养基中还包括有氯霉素，氯霉素的浓度为10μl/mL。

其余内容同实施例1。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法，枯草芽孢杆菌的拉丁文名称为Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.14837；包括如下工艺步骤：

A、培养基配制

每升发酵培养基由如下原料组成：

酵母浸粉72g/L；NH₄Cl 3.5g/L；K₂HPO₄ 1.2g/L；MnSO₄·7H₂O 0.03g/L；CaCl₂·2H₂O 3.2g/L；葡萄糖12g/L；MgSO₄·7H₂O 2.2g/L；余量为水；

B、接种

按4％的比例将枯草芽孢杆菌接种于灭菌后的步骤A制备的培养基中，培养基在摇瓶中的装量为体积比等于10％；

C、发酵

在培养温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下发酵，当培养基中葡萄糖耗尽时，添加IPTG至其浓度为1‰诱导产酶。

所述的步骤A中葡萄糖及七水合硫酸镁采用单独灭菌。

所述的步骤B的培养基中还包括有氯霉素，氯霉素的浓度为10μl/mL。

其余内容同实施例1。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法，枯草芽孢杆菌的拉丁文名称为Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.14837；包括如下工艺步骤：

A、培养基配制

每升发酵培养基由如下原料组成：

酵母浸粉69g/L；NH₄Cl 2.8g/L；K₂HPO₄ 0.9g/L；MnSO₄·7H₂O 0.015g/L；CaCl₂·2H₂O 2.9g/L；葡萄糖9g/L；MgSO₄·7H₂O 1.9g/L；余量为水；

B、接种

按4％的比例将枯草芽孢杆菌接种于灭菌后的步骤A制备的培养基中，培养基在摇瓶中的装量为体积比等于10％；

C、发酵

在培养温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下发酵，当培养基中葡萄糖耗尽时，添加IPTG至其浓度为1‰诱导产酶。

所述的步骤A中葡萄糖及七水合硫酸镁采用单独灭菌。

所述的步骤B的培养基中还包括有氯霉素，氯霉素的浓度为10μl/mL。

其余内容同实施例1。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：

利用枯草芽孢杆菌发酵制备中性蛋白酶的方法，枯草芽孢杆菌的拉丁文名称为Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.14837；包括如下工艺步骤：

A、培养基配制

每升发酵培养基由如下原料组成：

酵母浸粉71g/L；NH₄Cl 3.2g/L；K₂HPO₄ 1.1g/L；MnSO₄·7H₂O 0.025g/L；CaCl₂·2H₂O 3.1g/L；葡萄糖11g/L；MgSO₄·7H₂O 2.1g/L；余量为水；

B、接种

按4％的比例将枯草芽孢杆菌接种于灭菌后的步骤A制备的培养基中，培养基在摇瓶中的装量为体积比等于10％；

C、发酵

在培养温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下发酵，当培养基中葡萄糖耗尽时，添加IPTG至其浓度为1‰诱导产酶。

所述的步骤A中葡萄糖及七水合硫酸镁采用单独灭菌。

所述的步骤B的培养基中还包括有氯霉素，氯霉素的浓度为10μl/mL。

其余内容同实施例1。

申请人对实施例1-5中所制备的中性蛋白酶的酶活进行了测定，结果如下：

	酶活(U/mL)
		实施例1制备的中性蛋白酶	1653
实施例2制备的中性蛋白酶	1585
		实施例3制备的中性蛋白酶	1634
实施例4制备的中性蛋白酶	1623
		实施例5制备的中性蛋白酶	1647

申请人将采用本发明的方法与现有工艺所制备的中性蛋白酶的脱毛效果进行了比较，如图1所示，结果说明采用本发明的方法制备的中性蛋白酶相比现有工艺制备的中性蛋白酶效果相当,用量显著降低。