阅读说明：本技术 一种生产角蛋白酶的方法 (Method for producing keratinase ) 是由 张娟 冒鑫哲 万云蕾 陈坚 郭荣 邓小华 李江华 周冠宇 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种生产角蛋白酶的方法,属于微生物和发酵技术领域。本发明通过从发酵培养基成分(碳源、氮源、金属离子、磷酸盐)和发酵条件(温度、pH、接种量)两个方面入手,对利用枯草芽孢杆菌发酵生产角蛋白酶的工艺进行了优化。利用本发明的方法发酵生产角蛋白酶,可使得角蛋白酶的产量较对照提高3.3倍,在3L发酵罐产酶,酶活达到704400U/mL。因而本发明的方法在饲料、制革等方面角蛋白酶的制备中有着广阔的应用前景。(The invention discloses a method for producing keratinase, which belongs to the technical field of microorganisms and fermentation, and optimizes the process for producing the keratinase by fermenting bacillus subtilis by starting from two aspects of fermentation medium components (carbon source, nitrogen source, metal ions and phosphate) and fermentation conditions (temperature, pH and inoculum size).)

一种生产角蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及一种生产角蛋白酶的方法，属于微生物和发酵技术领域。

背景技术

角蛋白酶是一种可以特异性降解角蛋白类底物的蛋白酶。产角蛋白酶的微生物主要为细菌、真菌、放线菌。目前，针对角蛋白酶发酵优化的研究，主要集中在野生菌的筛选、发酵培养基成分优化和发酵条件优化，在产角蛋白酶菌株资源的挖掘中，最常见的是细菌，具有发酵周期短、酶活高、生产安全性好等特点，角蛋白酶在饲料、肥料、洗涤剂、皮革、纺织、化妆品行业和医疗等领域具有很好的应用前景。随着人们对角蛋白酶的催化性质在工业应用潜力认识的不断加深，野生菌所产角蛋白酶的性能和产量远远不能满足市场需求。目前筛选得到的产角蛋白酶野生菌大多集中在枯草杆菌属，其胞外分泌的酶种类多，底物作用专一性差，而且产酶不稳定，不利于工业化生产。近年来越来越多的角蛋白酶基因得到克隆和异源表达，采用基因工程菌，强化基因转录和翻译，达到高效表达和活性分泌，可以有效提高角蛋白酶的生产强度。基因工程菌和重组角蛋白酶经过性能改造，胞外分泌酶单一，简化了发酵下游的纯化工作。然而，高生产成本和低产量限制了角蛋白酶的工业化生产，因此通过发酵优化技术手段来提高产量降低成本。

发明内容

为了解决角蛋白酶生产菌株发酵酶活低，发酵成本过高的问题。本发明的方法从发酵培养基成分(碳源、氮源、金属离子、磷酸盐)和发酵条件(温度、pH、接种量)两个方面入手，对利用枯草芽孢杆菌发酵生产角蛋白酶的工艺进行了进一步优化；利用本发明的方法发酵生产角蛋白酶，可使得角蛋白酶的产量得到提升，在饲料、制革等方面有着广阔的应用前景。

本发明对发酵培养基进行优化。首先利用单因素试验对培养基成分和培养条件进行了优化；然后设计Plackett-Burman试验筛选得到三个显著因素：酵母浸膏、pH、温度；最后设计Box-Behnken中心组合试验并进行响应面分析。获得最佳工艺进行验证以及高密度发酵。

本发明提供了一种培养基，所述培养基的组分为蔗糖、豆粕、酵母浸膏、Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O。

在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖的含量为20～40g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述豆粕的含量为35～45g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母浸膏的含量为5～10g/L或25～30g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述Na₂HPO₄·12H₂O的含量为2～20g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述KH₂PO₄的含量为1～10g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述MgSO₄·7H₂O的含量为0.1～1.0g/L。

本发明提供了一种提高角蛋白酶产量的方法，所述方法是将角蛋白酶发酵菌株接种至所述培养基中产酶。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶发酵菌株的接种量为发酵培养基的4～7％(v/v)，接种时菌液的OD₆₀₀为0.6～1.0。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶发酵菌株为枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为WB600-pP43NMK-ker，所述WB600-pP43NMK-ker记载于文献Zheng Peng等《Biotransformation of keratin waste toamino acids and active peptides based on cell-free catalysis》。

在本发明的一种实施方式中，所述产酶是在36～40℃下进行。

在本发明的一种实施方式中，所述产酶是在pH 6～8下进行。

本发明还保护所述培养基，或所述提高角蛋白酶产量的方法在饲料、制革畜牧、医药领域制备角蛋白酶或降解角蛋白中的应用。

本发明的有益效果如下：

1、优化后培养基实现角蛋白酶产量显著提升

本发明中优化得到的发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，3g/LNa₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄，0.3g/L MgSO₄·7H₂O)；在温度37℃，种子液菌浓度OD₆₀₀为0.8，接种量5％，pH 7.68，转速220rpm，装液量20％条件下培养24h角蛋白酶活性达到了260480U/mL，而对照仅为61210U/mL，较对照3.3倍。

2、优化后培养基实现角蛋白酶发酵成本显著降低

本发明中优化培养基原料均价格低廉，发酵重复性较好，成本低廉，较优化前降低了96％。

3、优化后培养基实现了高密度发酵，角蛋白酶产量进一步提升

利用优化后培养基进行3L发酵罐放大生产，酶活达到704400U/mL，工业生产潜力巨大。

附图说明

图1为在不同种类碳源种中发酵产角蛋白酶的酶活。

图2为在不同浓度蔗糖中发酵产角蛋白酶的酶活。

图3为在不同种类第一氮源中发酵产角蛋白酶的酶活。

图4为在不同添加量的豆粕中发酵产角蛋白酶的酶活。

图5为在不同种类的第二氮源中发酵产角蛋白酶的酶活。

图6为在不同添加量的酵母浸膏中发酵产角蛋白酶的酶活。

图7为在不同种类的金属离子中发酵产角蛋白酶的酶活。

图8为在不同添加量的七水硫酸镁中发酵产角蛋白酶的酶活。

图9为在不同浓度磷酸盐中发酵产角蛋白酶的酶活。

图10为在不同初始pH中发酵产角蛋白酶的酶活。

图11为不同接种量下发酵产角蛋白酶的酶活。

图12为不同温度下发酵产角蛋白酶的酶活。

图13为菌株发酵产角蛋白酶曲线。

具体实施方式

1、角蛋白酶酶活测定方法

粗酶液制备：将发酵获得的菌液于4℃、7000rpm离心5min。

酶反应：向1.5mL离心管中加入Gly-NaOH溶液(pH 10)150μL，2.5％可溶性角蛋白100μL，角蛋白酶溶液50μL，混合均匀，于60℃中反应20min，加入0.5M三氯乙酸溶液200μL终止反应，12000rpm离心2min。对照为加入酶液前加入200μL三氯乙酸溶液。

显色反应：取200μL上清液加入到1mL 5％碳酸钠溶液中，加入200μL福林酚试剂，混合均匀，50℃显色10min，使用分光光度计测定660nm下的吸光度值。

酶活力定义：1U为吸光度值在660nm下升高0.001单位。

2、LB培养基：在1L去离子水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl，用1mol/L NaOH调节pH至7.4，121℃高压下蒸汽灭菌20min。

实施例1：菌株培养及发酵

1、菌株培养方法

菌株活化：从-80℃冰箱中取出产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌WB600-pP43NMK-ker(所述菌株记载于文献Zheng Peng等《Biotransformation of keratin waste to aminoacids and active peptides based on cell-free catalysis》)甘油管，于固体LB培养基划线后，37℃下培养14-16h。

一级种子液培养：从平板上挑取单菌落接种于3mL LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜。

二级种子液培养：按2％接种量转接一级种子液至含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃、220rpm培养4-6h。

摇瓶发酵培养：将OD₆₀₀为0.8的二级种子液以5％(v/v)的接种量转接至含50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃、220rpm培养24h，测定发酵液酶活。

实施例2：应用含不同碳源的培养基制备角蛋白酶

(1)最优碳源的选择

初始发酵培养基成分(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，Na₂HPO₄·12H₂O 6，KH₂PO₄ 3，MgSO₄·7H₂O 0.3。

保持发酵培养基其他成分不变，将葡萄糖替换为半乳糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、糊精和淀粉为碳源，添加量为20g/L；按照实施例1，进行摇瓶发酵培养24h，测定发酵液酶活，确定最佳碳源种类为蔗糖(图1)。

(2)碳源浓度的选择

具体实施方式同上述步骤(1)，区别在于，将发酵培养基中的碳源替换为不同浓度的蔗糖(10、15、20、25、30、35、40g/L)；摇瓶发酵后测定发酵液酶活，蔗糖浓度在25～35g/L时，角蛋白酶酶活可达125650U/mL及以上(图2)。

实施例3：应用含不同氮源的培养基制备角蛋白酶

(1)第一氮源的选择

在确定最优碳源后，用单一氮源替换发酵培养基中的酵母粉和胰蛋白胨，单一氮源为蛋白胨、酵母浸膏、麸皮、豆粕、玉米浆粉、硫酸铵和氯化铵中的任意一种，添加量为30g/L；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活，确定最佳氮源为豆粕(图3)。

(2)第一氮源浓度的选择

具体实施方式同上述步骤(1)，区别在于，将培养基中的酵母粉和胰蛋白胨替换为不同浓度豆粕(20、25、30、35、40、45、50g/L)；摇瓶发酵后测定发酵液酶活，豆粕浓度在40～50g/L时，角蛋白酶酶活可达181660U/mL及以上(图4)。

(3)第二氮源的选择

在已经确定一种氮源(40g/L的豆粕)的基础上，向含单一碳源40g/L的豆粕的发酵培养基中，分别添加硫酸铵、氯化铵、玉米浆粉、蛋白胨、酵母浸膏，添加量为10g/L；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活，确定第二氮源为酵母浸膏(图5)。

(4)第二氮源浓度的选择

向含单一碳源40g/L的豆粕的发酵培养基中，分别添加不同浓度酵母浸膏(1、5、10、15、20、25、30g/L)；按照实施例1，进行测定发酵液酶活，酵母浸膏浓度在5g/L、25～30g/L时，角蛋白酶酶活可达240180U/mL及以上(图6)。

实施例4：应用含不同金属离子的培养基制备角蛋白酶

在发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏)的基础上，将培养基中的Mg²⁺替换为金属离子K⁺、Na⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺，添加浓度为0.3g/L；按照实施例1，进行摇瓶发酵培养24h，测定发酵液酶活，确定金属离子种类为Mg²⁺(图7)。

在发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏)的基础上，分别添加不同浓度MgSO₄·7H₂O(0.1、0.3、0.5、1、1.5g/L)；按照实施例1，进行摇瓶发酵培养24h，测定发酵液酶活，硫酸镁浓度在0.3～0.5g/L时，角蛋白酶酶活可达209400U/mL及以上(图8)。

实施例5：应用含不同磷酸盐的培养基制备角蛋白酶

在发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，0.3g/L MgSO₄·7H₂O)的基础上，对发酵培养基中磷酸根离子浓度优化，将Na₂HPO₄·12H₂O和KH₂PO₄浓度比例确定在2：1，添加不同浓度的磷酸盐(0、2.25、4.5、9、13.5、18、22.5g/L)；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液浓度确定最佳磷酸盐添加量。如图9所示，磷酸盐浓度在4.5～22.5g/L时，角蛋白酶酶活可达215690U/mL及以上；在磷酸盐浓度为4.5g/L时，磷酸盐为3g/LNa₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄。

实施例6：应用不同初始pH的培养基制备角蛋白酶

在发酵培养基(碳源和氮源为30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，0.3g/LMgSO₄·7H₂O，3g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄)的基础上，将发酵培养基初始pH调整为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活，确定最佳初始pH。如图10所示，在pH为7～8时，角蛋白酶酶活可达230850U/mL及以上。

实施例7：应用含不同培养基接种量制备角蛋白酶

在发酵培养基(碳源和氮源为30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，0.3g/LMgSO₄·7H₂O，3g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄)、初始pH为7.5的基础上，将OD₆₀₀为0.8的二级种子液以不同接种量(1％、3％、5％、7％、9％)接入发酵培养基中；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活，确定最佳接种量。如图11所示，在接种量为5％～7％时，角蛋白酶酶活可达227940U/mL及以上。

实施例8：应用含不同发酵温度制备角蛋白酶

在发酵培养基(碳源和氮源为30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，0.3g/LMgSO₄·7H₂O，3g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄)、初始pH为7.5、以5％的接种量接种OD₆₀₀为0.8的二级种子液的基础上，调整发酵温度分别为30℃、32℃、35℃、37℃、40℃；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活确定最佳培养温度。如图12所示，在发酵温度为35℃～37℃时，角蛋白酶酶活可达213680U/mL及以上。

实施例9：发酵条件的综合优化

响应面试验

1)Plackett-Burman实验设计：将实施例2～8中的八个因素(蔗糖、豆粕、酵母浸膏、硫酸镁、磷酸盐、pH、接种量、温度)作为试验的因素，以角蛋白酶酶活(Y)为响应值，利用Minitab 19软件进行n＝12的Plackett-Burman(PB)试验设计。PB试验设计的各因素与水平如表1所示。试验结果表明酵母浸膏、pH和温度为显著因素。

表1 Plackett-Burman设计因素与水平

2)Box-Behnken中心组合试验：利用PB设计试验筛选出三个显著性因素，即酵母浸膏(A)、pH(B)、温度(C)。利用Design-Expert 8.0软件，采用Box-Behnken中心组合试验进行实验条件优化，以酵母浸膏(A)、pH(B)、温度(C)为变量，以角蛋白酶酶活(Y)为响应值设计3因素3水平试验，试验方案中的各因素和水平如表2所示。响应面及等高线图如图13，最终优化结果为酵母浸膏5.72g/L，pH 7.68，温度37.69℃。理论最高酶活达到261711U/mL。

为验证模型的准确性及重复性，利用上述最佳工艺参数进行三次平行验证，将初始温度分别设置为37℃和37.69℃，其余条件分别为：发酵培养基组分：30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，3g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄，0.3g/L MgSO₄·7H₂O；种子液菌浓度OD₆₀₀为0.8，接种量5％，pH 7.68。

测定角蛋白酶的平均酶活为260480±1430U/mL。

表2响应面试验因素与水平

实施例10：在3L发酵罐中生产角蛋白酶

使用优化后的发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，3g/LNa₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄，0.3g/L MgSO₄·7H₂O)及发酵条件对菌株进行3L发酵罐试验。

3L发酵罐的装液量为1.5L，按5％接种量转接二级种子(OD₆₀₀为0.8)至发酵罐中，发酵初始条件为温度37℃，pH 7.68，通气量1.5L/min。控制发酵过程中pH 7、温度37℃、溶氧25-30％、发酵时间9-16h以30mL/h、26-30h以25mL/h恒速补料浓度为720g/L葡萄糖，发酵10h后以0.5mL/h速度补料消泡剂，发酵过程中定时取样测定菌浓和角蛋白酶酶活。如图13和表3所示，发酵26h，发酵酶活达到704400U/mL。

表3菌株发酵产角蛋白酶结果

对比例1

具体实施方式同实施例2～8，区别在于，使用培养基组分为：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，Na₂HPO₄·12H₂O 6，KH₂PO₄ 3，MgSO₄·7H₂O 0.3，初始pH 7，接种量为5％，培养温度为37℃，在220rpm培养24h，测定发酵液酶活为61210U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。