一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用
阅读说明：本技术 一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用 (Alkaline protease mutant for washing and application thereof in liquid detergent ) 是由 石亚伟 周桂旭 魏婷婷 文阳宣 于 2019-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于蛋白质工程改造技术领域,提供一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用。所述碱性蛋白酶突变体的亲本蛋白酶为枯草芽孢杆菌PB92的蛋白酶,所述碱性蛋白酶突变体至少包含以下氨基酸的置换：V262I,其中所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽的氨基酸位置。使其能更好的适用于工业领域,特别是洗涤剂行业。使碱性蛋白酶在碱性pH条件下以及耐热性方面的酶活有所提高。为其更好的适应工业化生产奠定了基础。(The invention belongs to the technical field of protein engineering modification, and provides an alkaline protease mutant for washing and application thereof in a liquid detergent. The parent protease of the alkaline protease mutant is a protease of bacillus subtilis PB92, and the alkaline protease mutant at least comprises the following amino acid substitutions: V262I, wherein the position corresponds to the amino acid sequence SEQ ID NO:1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. So that it can be better applied to the industrial field, in particular to the detergent industry. The enzyme activity of the alkaline protease under the alkaline pH condition and the heat resistance is improved. And lays a foundation for better adapting to industrial production.)
技术领域
本发明属于蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用。
背景技术
碱性蛋白酶（Alkaline protease，AP）指在中性至碱性环境中具有较高活性的蛋白酶，可有效水解肽键、酯键、酰胺键。广泛存在植物、动物、微生物中。目前用于工业化生产的菌种主要为地衣芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌、枯草杆菌等（Tekin N et al. Pol JMicrobiol, 2017, 66(1): 39-56）。
碱性蛋白酶在许多领域，包括洗涤剂，药物，皮革，大豆加工，酿酒厂，肉类嫩化，废物管理，摄影，诊断等工业领域都有应用。碱性蛋白酶单独占全球酶市场的25%（MikkelsenM L et al. Food and Chemical Toxicology, 2015: 07-21）。
通过蛋白质工程手段可以有效提高酶的催化活性、热稳定性、改善底物特异性（Johannes TW et al. Curr. Microbiol, 2006, 9:261-267）。蛋白工程手段为酶的功能的改善开辟了崭新的途径，在工业、农业等领域取得巨大的成功。
发明内容
本发明的目的是提供一种热稳定性以及耐碱性提高的碱性蛋白酶突变体，使其能更好的适用于工业领域，特别是洗涤剂行业。本发明提供了一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体，使碱性蛋白酶在碱性pH条件下以及耐热性方面的酶活有所提高。为其更好的适应工业化生产奠定了基础。
本发明由如下技术方案实现的：一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体，所述碱性蛋白酶突变体的亲本蛋白酶为枯草芽孢杆菌PB92的蛋白酶，所述碱性蛋白酶突变体至少包含以下氨基酸的置换：V262I，其中所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO ：1的多肽的氨基酸位置。
所述碱性蛋白酶突变体还包含A188P+V262I置换组合。
所述亲本蛋白酶与氨基酸序列SEQ ID NO：1 具有至少95%序列一致性的氨基酸序列。
所述亲本蛋白酶具有SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列。
所述亲本蛋白酶与氨基酸序列SEQ ID NO：2具有至少97%的序列一致性的氨基酸序列。
一种液体洗涤剂组合物，包含所述的蛋白酶突变体。
本发明所制备的液体洗涤剂组合使用MGDA和STPP标准。
本发明使碱性蛋白酶在碱性pH条件下以及耐热性方面的酶活有所提高。突变酶在作为洗涤剂使用时比亲本蛋白酶在极端条件下有更好的保留活性，可以在更高的温度下以及更强的碱性环境下使用该蛋白酶，试验显示：在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，碱性蛋白酶及其突变体50℃保温半小时，可以明显看出突变体V262IA和188P+V262I剩余活力明显高于野生菌，即使保温更长时间，始终突变体的残余活力高于野生型。在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，碱性蛋白酶及其突变体在不同pH下保温1小时，可以明显看出突变体A188PV262I剩余活力在pH大于9后高于野生酶。在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，碱性蛋白酶及其突变体相同的添加量，添加在MGDA和STPP洗涤体系中，可以明显看出无论亲本酶还是突变体的酶活均有所提升。突变体酶相比亲本酶有更好的稳定性在这两种洗涤体系中。有助于拓展碱性蛋白酶的使用范围，为其更好的适应工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1：枯草杆菌蛋白酶PB92（SEQ ID NO：1）及枯草杆菌蛋白酶突变体（SEQ ID NO：2）氨基酸序列比对图。
图2：枯草杆菌蛋白酶PB92（SEQ ID NO：1）蛋白纯化SDS-PAGE电泳图。
图3：枯草杆菌蛋白酶突变体（SEQ ID NO：2）蛋白纯化SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的的实验方法做进一步的阐述，下述实例中所用方法如无特别说明均为分子克隆、蛋白质纯化以及酶分析的常规方法。
关于本发明中碱性蛋白酶突变体的标注及相关酶活测定方法：
碱性蛋白酶突变体的标注：采用“原来的氨基酸 位置 取代的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如 S259K/R，表示位置259的氨基酸由原来的碱性蛋白酶的Ser替换为lys或Arg，位置的编号与附件序列表SEQ ID NO:1中的编号相对应。
碱性蛋白酶酶活测定方法：参照GB/T 23527-2009附录B福林法进行，具体反应过程如下：首先取出一系列空试管，每组将一个试管标记为对照组，将其余三个试管标记为实验组。在所有试管中，加入0.5mL用缓冲液配制的1%的酪素溶液，并将试管在40℃下保温2min；向除了空白之外的试管中加入0.5mL的粗酶液使酶液和底物反应10min；加入1mL0.4mol/L三氯乙酸以终止反应；对照组加入1mL酶液；静置10 min后离心，各取1 mL上清液于新的试管中；加入5mL碳酸钠，1mL Folin试剂；置于40℃显色20min。在680nm处测定吸光值。酶活计算公式如下：X=A×K×4/10×n，其中K代表吸光常数（实验室测定值K=97）。
实施例1：碱性蛋白酶A188P+V262I突变体的构建和表达：本发明的碱性蛋白酶突变体的构建可通过本领域技术人员熟知的方法构建和表达。
按照北京全氏金生物技术有限公司的Fast Mutagenesis System设计上下游引物，188位突变上游引物：5’-TTCTCTCAATACGGCCCTGGCCTTGA-3’，下游引物5’-GGCCGTATTGAGAGAAAGAAGCACG-3’，262位突变上游引物：5’-TACGGCTCTGGCCTTATTAACGCTGA-3’，下游引物5’-TAAGGCCAGAGCCGTAAAGGTTTGT-3’，以构建好的含有亲本碱性蛋白酶PB92的重组质粒pBE2R-AP为模板，以相应的突变引物进行PCR扩增；将扩增好的PCR产物进行琼脂糖电泳并纯化回收PCR产物。扩增反应体系为：2×PCR SuperMix 25 μL，引物Up（10uM）1 μL，引物Dn（10uM）1 μL，模板（1/30）1 μL，加水补足至 50μL。扩增反应条件为：94℃ 预变性3min，94℃ 变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸4min，25个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。加1uL DMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h。加2-5uLDMT酶消化产物，用热激法转入大肠杆菌DH5α，提质粒进行测序确定。碱性蛋白酶突变体 (A188P V262I)的氨基酸序列为SEQID NO:2。
将测序正确的重组质粒pBE2R-AP(A188P V262I)转入感受态细胞WB600中，具体转化过程如下：用枪头挑取在LB（蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母粉0.5%，琼脂粉1.5%）平板上生长的WB600单菌落于2mLGMⅠ（GMⅠ 配制方法：10mL溶液A，1.5mL溶液B，25mL溶液C，100uL溶液D，25mL溶液G，加灭菌水至100mL。其中，溶液A配制方法：0.4 g酵母提取物，0.08 g酪蛋白水解物，溶于40 mL水中；溶液B配制方法：5 g葡萄糖，溶于10 mL水中；溶液C配制方法：4.8 gKH2PO4，11.2g K2HPO4，0.16 g MgSO4·7H2O，0.8 g柠檬酸三钠，1.6 g (NH4)2SO4，溶于200mL水中；溶液D：0.9 g MnCl2·4H2O，1.415 g硼酸，0.68g FeSO4·7H2O，13.45 mg CuCl2·2H2O，23.5 mg ZnSO4·7H2O，20.2 mg CoCl2· 6H2O，12.6 mg高钼酸钠，0.855 g酒石酸钠，溶于500 mL水中；溶液G配制方法：36.5 g山梨醇，溶于100 mL水中）中，培养12h；将过夜培养的菌液加到98mLGMⅠ中，37℃，200rpm培养约4h；取10mL菌液加入90mLGMII（GMII配制方法：98mL GMⅠ，1mL溶液E，1mL溶液F，混匀。其中，溶液E配制方法：2.16g MgCl2·6H2O，溶于20mL水中；溶液F配制方法：147 mg CaCl2 溶于20 mL水中）中，37℃，200rpm培养约1 h 30min；菌体冰水浴30min，4000rpm，4℃离心30min，去上清；加10mLGMⅢ（GMⅢ配制方法：9mLGMⅡ，1mL甘油），混匀，即为感受态细胞WB600。然后在500μL感受态细胞中加入5µL pBE2R-AP(A188P V262I)质粒，直接将感受态细胞置于37℃，200rpm摇床培养1.5h，低速离心3min，弃部分上清，均匀涂布于含40μg/mL卡那霉素的脱脂奶粉培养基平板上，37℃恒温培养箱培养12h。次日平板上的单菌落即为含碱性蛋白酶突变体AP(A188P+V262I)的重组菌株WB600/pBE2R-AP(A188P +V262I)。碱性蛋白酶突变体枯草杆菌重组工程菌接种于5mL LB液体培养基（蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母粉0.5%）中，37℃，200rpm振荡培养12h，将菌液按2%的接菌量分别转接于发酵产酶培养基（糊精1%，可溶性淀粉2%，酵母粉 1%，NaCl 0.5%，pH值为7.0）中，37℃，200rpm振荡培养84h。
实施例2：碱性蛋白酶突变体的分离纯化：发酵完成后，发酵液13000r/min离心15min，然后上清液用0.22μm膜在正压滤器上过滤去除残留枯草芽孢杆菌。上清液分别缓慢加硫酸铵粉末到碱性蛋白酶突变体的粗酶液中，使硫酸铵浓度至70%，待硫酸铵粉末完全溶解，在4℃层析柜中过夜静置，再以13000rpm离心30min，收集沉淀，将沉淀于50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH=8的缓冲液透析并用超滤杯超滤浓缩。上样至用相同缓冲液（50mMTris-HCl，100mM NaCl，pH 8）平衡好的Superdex75凝胶层析柱（购自GE公司），收集碱性蛋白酶突变体A188P+V262I蛋白。在SDS-PAGE电泳，结果显示为单一条带的蛋白样品。
实施例3：碱性蛋白酶突变体的热稳定性和pH稳定性分析：碱性蛋白酶及其突变体A188P+V262I进行酶活测定，碱性蛋白酶及其突变体的蛋白浓度0.2mg/ml，蛋白缓冲液为50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 8.0。酶活测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林法进行，在50℃保温2.5h，每隔0.5h取样测定酶活性。测试结果如表1。
表1 野生型碱性蛋白酶与突变体50℃保温不同时间的蛋白酶残余活性
在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，碱性蛋白酶及其突变体50℃保温半小时，可以明显看出突变体V262IA和188P+V262I剩余活力明显高于野生菌，即使保温更长时间，始终突变体的残余活力高于野生型。
实施例4：野生型AP、突变体AP(A188P +V262I) pH稳定性的比较：配制一系列pH梯度、浓度为0.2M的缓冲溶液：Na2HPO4- NaH2PO4（pH 6.0-7.0）、Tris-HCl（pH8.0-9.0）、Gly-NaOH（pH 10.0-12.0），将酶液（浓度为0.2mg/ml）分别在一系列pH梯度缓冲液系统中25℃保存l h，参照GB/T 23527-2009附录B福林法测定酶活，结果如表2所示。
表2 野生型碱性蛋白酶与突变体在不同pH条件下的活性
在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，碱性蛋白酶及其突变体在不同pH下保温1小时，可以明显看出突变体A188PV262I剩余活力在pH大于9后高于野生酶。
实施例4：碱性蛋白酶突变体在液体洗涤剂中的活性测定：
液体洗涤剂配方制备如表3所示。
表3液体洗涤剂配方
将两种洗涤剂都溶解在50mM CHES缓冲液（N-环己基-2-氨基乙磺酸）中以确保在实验过程中而且在添加蛋白酶样品后pH维持在10.0。
取0.2mg/ml蛋白酶液10ul与190ul标准洗涤剂溶液在1.5mlEP管中混合，参照GB/T23527-2009附录B福林法测定酶活，结果如表4所示。
表4 蛋白酶及其突变体A188P+V262I在STPP和MGDA标准洗涤中在稳定性数据
在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，碱性蛋白酶及其突变体相同的添加量，添加在MGDA和STPP洗涤体系中，可以明显看出无论亲本酶还是突变体的酶活均有所提升。突变体酶相比亲本酶有更好的稳定性在这两种洗涤体系中。
序列表
<110> 山西大学
<120> 一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 2
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
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100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
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Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
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225 230 235 240
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260 265