一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用
阅读说明：本技术 一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用 (Leader peptide mutant and application thereof in keratinase production ) 是由 张娟 彭政 陈坚 堵国成 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用,属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明通过将角蛋白酶的前导肽进行突变大大提高了角蛋白酶的产量；将本发明的以由编码信号肽的基因、编码前导肽突变体的基因以及编码角蛋白酶的基因依次串联而得的DNA片段为目的基因,以pP43NMK质粒为表达载体,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为表达宿主构建得到的可高产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌工程菌进行发酵,发酵24h,即可使得发酵上清液中的酶活高达109290～157080U/mL。(The invention discloses a leader peptide mutant and application thereof in keratinase production, belonging to the technical field of enzyme engineering and microbial engineering. The invention greatly improves the yield of the keratinase by mutating the leader peptide of the keratinase; the Bacillus subtilis engineering bacteria capable of producing keratinase with high yield, which is constructed by taking a gene coding a signal peptide, a gene coding a leader peptide mutant and a gene coding keratinase which are connected in series in sequence as a target gene, taking a pP43NMK plasmid as an expression vector and taking Bacillus subtilis WB600 as an expression host, is fermented for 24 hours, so that the enzyme activity in the fermented supernatant can reach 109290-157080U/mL.)
技术领域
本发明涉及一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。
背景技术
角蛋白酶是一种能够降解不可溶的硬质蛋白--角蛋白类底物(例如羽毛、羊毛、头发、皮屑等)的特异性蛋白酶，其主要由细菌、真菌、放线菌等微生物在以角蛋白为单一碳氮源时生长分泌获得。
作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，角蛋白酶可以替代传统蛋白酶，广泛应用于羽毛降解、皮革纺织、饲料添加剂、有机化肥和洗涤剂等领域，具有巨大的市场。
但是，野生角蛋白酶的性能拙劣、产量低下，远远不能满足市场需求，因此，它很难被真正应用于工业化生产中。
现在，常常采用构建基因工程菌的手段，强化角蛋白酶基因的转录和翻译，以达到提高角蛋白酶产量的目的，例如，Porres J M等人以来源于B.licheniformis MKU3的编码角蛋白酶基因为目的基因、以pPICZαA为载体、以Pichia pastoris X33为宿主构建得到了一株可产角蛋白酶的基因工程菌，将此基因工程菌发酵24h，仅可使发酵上清液中的酶活达到285U/L(具体可见参考文献：Porres J M,Benito M J,Lei X G.Functional expressionof keratinase(kerA)gene from Bacillus licheniformis in Pichiapastoris.Biotechnology Letters[J],2002,24(8):631-636.)；Fang等人以来源于Stenotrophomonas maltophilia的编码角蛋白酶基因为目的基因、以pET22b为载体、以大肠杆菌DE3为宿主构建得到了一株可产角蛋白酶的基因工程菌，将此基因工程菌发酵72h，仅可使发酵上清液中的酶活达到712U/L(具体可见参考文献：Zhen Fang,Juan Zhang,Baihong Liu,Linghuo Jiang,Guocheng Du,Jian Chen.Cloning,heterologousexpression and characterization of two keratinases from Stenotrophomonasmaltophilia BBE11-1.Process Biochemistry.2014,49.4:647-654.)。但是，上述产量仍旧未能达到工业化生产的水平。
因此，急需找到一种提高角蛋白酶产量的方法以满足工业化生产的要求。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种产量高的生产角蛋白酶的方法。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种前导肽突变体，所述前导肽突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的前导肽的第76位亮氨酸、第39位天冬氨酸、第17位丝氨酸、第18位甘氨酸、第37位天冬氨酸、第48位丙氨酸或第57位谷氨酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述前导肽突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQID NO.1所示的前导肽的第76位亮氨酸突变为丙氨酸、第76位亮氨酸突变为缬氨酸、第76位亮氨酸突变为蛋氨酸、第76位亮氨酸突变为苯丙氨酸、第39位天冬氨酸突变为丝氨酸、第17位丝氨酸突变为丙氨酸、第18位甘氨酸突变为丝氨酸、第37位天冬氨酸突变为谷氨酸、第48位丙氨酸突变为缬氨酸或第57位谷氨酸突变为赖氨酸得到的。
在本发明的一种实施方式中，编码所述前导肽的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了编码上述前导肽突变体的基因。
本发明还提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列是通过将编码信号肽的基因的核苷酸序列、编码上述前导肽突变体的基因的核苷酸序列以及编码角蛋白酶的基因的核苷酸序列依次串联得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述编码角蛋白酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码信号肽的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明还提供了携带上述核苷酸序列的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pP43NMK质粒。
本发明还提供了携带上述核苷酸序列或上述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600。
本发明还提供了一种生产角蛋白酶的方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，获得发酵上清液；将发酵上清液进行提取，获得角蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、蔗糖20g/L、KH2PO4 3g/L、Na2HPO4 6g/L以及MgSO4 0.3g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为37℃、转速为220rpm。
本发明还提供了上述前导肽突变体、上述基因、上述核苷酸序列、上述重组质粒、上述宿主细胞或上述方法在生产角蛋白酶方面的应用。
[有益效果]
本发明通过将角蛋白酶的前导肽进行突变大大提高了角蛋白酶的产量；将本发明的以由编码信号肽的基因、编码前导肽突变体的基因以及编码角蛋白酶的基因依次串联而得的DNA片段为目的基因，以pP43NMK质粒为表达载体，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600为表达宿主构建得到的可高产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌工程菌进行发酵，发酵24h，即可使得发酵上清液中的酶活高达109290～157080U/mL。
附图说明
图1：前导肽切割位点置P1处氨基酸(即第76位氨基酸)替换对角蛋白酶催化活力的影响；
图2：前导肽定点突变对角蛋白酶催化活力的影响。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109购自北纳生物；下述实施例中涉及的pP43NMK质粒购自丰晖生物；下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600记载于公开号为CN102492645A的专利申请文本中。
下述实施例中涉及的培养基为：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、卡那霉素100mg·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g/L、卡那霉素50mg·L-1。
种子培养基：酵母粉5g·L-1、蛋白胨10g·L-1、NaCl 5g·L-1。
发酵培养基：蛋白胨20g·L-1、酵母粉10g·L-1、蔗糖20g·L-1、KH2PO4 3g·L-1、Na2HPO46g·L-1、MgSO4 0.3g·L-1。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
角蛋白酶酶活的测定：取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL 50mM的Gly/NaOH溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的水溶性角蛋白(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，产品编码：K0043)作为底物，混匀后于40℃下反应20min；加入200μL 4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温8000r/min离心3min。取上清200μL，加入1mL 4％(w/v)的Na2CO3和200μL的福林酚试剂，混匀后50℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于660nm下测定清液吸光值；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上；
酶活的定义：在该条件下OD660每升高0.001所需酶量为一个酶活力单位(1U)。
实施例1：前导肽的截断对角蛋白酶产量的影响
具体步骤如下：
化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的可用于生产角蛋白酶的基因(由编码信号肽的基因、编码前导肽的基因以及编码角蛋白酶的基因依次串联而得)；并使用同源重组试剂盒(Clonexpress II One Step Cloning Kit)将获得的基因与pP43NMK质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-ker；将验证正确的重组质粒pP43NMK-ker转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得含有编码未经缺失的前导肽的基因的枯草芽孢杆菌工程菌。
利用全质粒PCR技术，以获得的重组质粒pP43NMK-ker为模板分别对前导肽的第1位至第14位、第1位至第29位、第1位至第38位、第1位至第49位进行缺失、第1位至第60位进行缺失和第1位至第69位进行缺失，获得突变体β1、α1、β2、β3、α2、β4；
其中，缺失第1位至第14位所用引物如下：
正向引物：5’-AAGTCAGGAGTGAAAACCGCATCC-3’(SEQ ID NO.8)；
反向引物：5’-AGCAGACGCGGAATCGCTGAAGG-3’(SEQ ID NO.9)；
缺失第1位至第29位所用引物如下：
正向引物：5'-GAGAGCGGCGGAAAAGTGGACAAG-3'(SEQ ID NO.10)；
反向引物：5'-AGCAGACGCGGAATCGCTGAAGG-3'(SEQ ID NO.11)；
缺失第1位至第38位所用引物如下：
正向引物：5'-AAAGTGGACAAGCAGTTTAGAATCATCAAC-3'(SEQ ID NO.12)；
反向引物：5'-AGCAGACGCGGAATCGCTGAAGG-3'(SEQ ID NO.13)；
缺失第1位至第49位所用引物如下：
正向引物：5'-GACAAAGAAGCGCTTAAGGAAGTCA-3'(SEQ ID NO.14)；
反向引物：5'-AGCAGACGCGGAATCGCTGAAGG-3'(SEQ ID NO.15)；
缺失第1位至第60位所用引物如下：
正向引物：5'-GATCCGGATGTCGCTTATGTGGAAG-3'(SEQ ID NO.16)；
反向引物：5'-AGCAGACGCGGAATCGCTGAAGG-3'(SEQ ID NO.17)；
缺失第1位至第69位所用引物如下：
正向引物：5'-GATCATGTGGCCCATGCCTTGG-3'(SEQ ID NO.18)；
反向引物：5'-AGCAGACGCGGAATCGCTGAAGG-3'(SEQ ID NO.19)，
PCR反应体系均为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，2.5mM dNTPs 4μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，2.5U/μL PrimeSTAR Taq HS 0.5μL，加入双蒸水至50μL；
PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；随后进行98℃ 10s，55℃ 15s，72℃4min，30个循环；最后72℃保温10min；
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(DpnI)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将DpnI处理后的扩增产物转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得含有编码前导肽突变体β1、α1、β2、β3、α2、β4的基因的枯草芽孢杆菌工程菌。
将获得的含有编码未经缺失的前导肽的基因的枯草芽孢杆菌工程菌以及含有编码前导肽突变体β1、α1、β2、β3、α2、β4的基因的枯草芽孢杆菌工程菌涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入种子培养基，于37℃、220rpm培养14h，获得种子液；将种子液按照5％(v/v)的接种量接入发酵体培养基，于37℃、220rpm培养28h，得到发酵液；将发酵液于4℃、12000rpm离心20min后，获得发酵上清液。
检测含有编码未经缺失的前导肽的基因的枯草芽孢杆菌工程菌以及含有编码前导肽突变体β1、α1、β2、β3、α2、β4的基因的枯草芽孢杆菌工程菌发酵获得的发酵上清液中的酶活，检测结果为：含有编码未经缺失的前导肽的基因的枯草芽孢杆菌工程菌发酵获得的发酵上清液中的酶活为91910U/mL，含有编码前导肽突变体β1的基因的枯草芽孢杆菌工程菌发酵获得的发酵上清液中的酶活为87370U/mL，其余发酵上清液未检测到酶活。
实施例2：前导肽的突变对角蛋白酶产量的影响
具体步骤如下：
化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的可用于生产角蛋白酶的基因(由编码信号肽的基因、编码前导肽的基因以及编码角蛋白酶的基因依次串联而得，编码信号肽的基因的核苷酸序列、信号肽的氨基酸序列、编码前导肽的基因的核苷酸序列、前导肽的氨基酸序列、编码角蛋白酶的基因的核苷酸序列、角蛋白酶的氨基酸序列以及可用于生产角蛋白酶的基因的核苷酸序列具体可见表1)；并使用同源重组试剂盒(Clonexpress II OneStep Cloning Kit)将获得的基因与pP43NMK质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-ker；将验证正确的重组质粒pP43NMK-ker转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得含有编码未经缺失的前导肽的基因的枯草芽孢杆菌工程菌。
利用全质粒PCR技术，以获得的重组质粒pP43NMK-ker为模板分别对前导肽的第76位亮氨酸(前导肽的第76位即为前导肽切割位点P1)突变为丙氨酸、第76位亮氨酸突变为酪氨酸、第76位亮氨酸突变为异亮氨酸、第76位亮氨酸突变为缬氨酸、第76位亮氨酸突变为蛋氨酸、第76位亮氨酸突变为苯丙氨酸、第76位亮氨酸突变为色氨酸、第10位天冬氨酸突变为丝氨酸、第17位丝氨酸突变为丙氨酸、第18位甘氨酸突变为丝氨酸、第20位赖氨酸突变为苏氨酸、第22位丙氨酸突变为天冬酰胺、第24位缬氨酸突变为丝氨酸、第28位异亮氨酸突变为丙氨酸、第29位异亮氨酸突变为缬氨酸、第30位赖氨酸突变为亮氨酸、第31位谷氨酸突变为谷氨酰胺、第32位丝氨酸突变为天冬酰胺、第36位缬氨酸突变为亮氨酸、第37位天冬氨酸突变为谷氨酸、第40位苯丙氨酸突变为酪氨酸、第42位异亮氨酸突变为亮氨酸、第47位赖氨酸突变为谷氨酰胺、第48位丙氨酸突变为缬氨酸、第50位亮氨酸突变为蛋氨酸、第51位天冬氨酸突变为丝氨酸、第52位赖氨酸突变为谷氨酸、第53位谷氨酸突变为谷氨酰胺、第55位亮氨酸突变为丙氨酸、第57位谷氨酸突变为赖氨酸、第58位缬氨酸突变为亮氨酸、第59位赖氨酸突变为谷氨酸、第63位天冬氨酸突变为丝氨酸、第64位缬氨酸突变为异亮氨酸、第72位缬氨酸突变为赖氨酸，获得前导肽突变体L76A、L76Y、L76I、L76V、L76M、L76F、L76W、D10S、S17A、G18S、K20T、A22N、V24S、I28A、I29V、K30I、E31Q、S32N、V36L、D37E、F40Y、I42L、K47Q、A48V、L50M、D51S、K52E、E53Q、L55A、E57K、V58L、K59E、D63S、V64I、V72K；
其中，突变L76A所用引物如下：
正向引物：5’-CATGCCGCGGCGCAAACCGTTCCTTAC-3’(SEQ ID NO.20)；
反向引物：5’-GGCCACATGATCCTCTTCCACATAAGCG-3’(SEQ ID NO.21)；
突变L76Y所用引物如下：
正向引物：5'-CATGCCTATGCGCAAACCGTTCCTTAC-3'(SEQ ID NO.22)；
反向引物：5'-GGCCACATGATCCTCTTCCACATAAGCG-3'(SEQ ID NO.23)；
突变L76I所用引物如下：
正向引物：5'-CATGCCATCGCGCAAACCGTTCCTTAC-3'(SEQ ID NO.24)；
反向引物：5'-GGCCACATGATCCTCTTCCACATAAGCG-3'(SEQ ID NO.25)；
突变L76V所用引物如下：
正向引物：5'-CATGCCGTTGCGCAAACCGTTCCTTAC-3'(SEQ ID NO.26)；
反向引物：5'-GGCCACATGATCCTCTTCCACATAAGCG-3'(SEQ ID NO.27)；
突变L76M所用引物如下：
正向引物：5'-CATGCCATGGCGCAAACCGTTCCTTAC-3'(SEQ ID NO.28)；
反向引物：5'-GGCCACATGATCCTCTTCCACATAAGCG-3'(SEQ ID NO.29)；
突变L76F所用引物如下：
正向引物：5'-CATGCCTTTGCGCAAACCGTTCCTTAC-3'(SEQ ID NO.30)；
反向引物：5'-GGCCACATGATCCTCTTCCACATAAGCG-3'(SEQ ID NO.31)；
突变L76W所用引物如下：
正向引物：5'-CATGCCTGGGCGCAAACCGTTCCTTAC-3'(SEQ ID NO.32)；
反向引物：5'-GGCCACATGATCCTCTTCCACATAAGCG-3'(SEQ ID NO.33)；
突变D10S所用引物如下：
正向引物：5'-TCTTATATTGTCGGATTTAAGTCAGGAGTGAAAACC-3'(SEQ ID NO.34)；
反向引物：5'-CTTTTCAACATTTTTCGCCGGCTG-3'(SEQ ID NO.35)；
突变S17A所用引物如下：
正向引物：5'-GCTGGAGTGAAAACCGCATCCG-3'(SEQ ID NO.36)；
反向引物：5'-CTTAAATCCGACAATATAATCCTTTTCAACATTTTTCG-3'(SEQ ID NO.37)；
突变G18S所用引物如下：
正向引物：5'-TCTGTGAAAACCGCATCCGTC-3'(SEQ ID NO.38)；
反向引物：5'-TGACTTAAATCCGACAATATAATCCTTTTCAACATTT-3'(SEQ ID NO.39)；
突变K20T所用引物如下：
正向引物：5'-ACTACCGCATCCGTCAAAAAGGACATCA-3'(SEQ ID NO.40)；
反向引物：5'-CACTCCTGACTTAAATCCGACAATATAATCC-3'(SEQ ID NO.41)；
突变A22N所用引物如下：
正向引物：5'-ACTTCCGTCAAAAAGGACATCATCAAAG-3'(SEQ ID NO.42)；
反向引物：5'-GGTTTTCACTCCTGACTTAAATCCGACAAT-3'(SEQ ID NO.43)；
突变V24S所用引物如下：
正向引物：5'-TCTAAAAAGGACATCATCAAAGAGAGCG-3'(SEQ ID NO.44)；
反向引物：5'-GGATGCGGTTTTCACTCCTGACTTAAAT-3'(SEQ ID NO.45)；
突变I28A所用引物如下：
正向引物：5'-ATCAAAGAGAGCGGCGGAAAAG-3'(SEQ ID NO.46)；
反向引物：5'-AGCGTCCTTTTTGACGGATG-3'(SEQ ID NO.47)；
突变I29V所用引物如下：
正向引物：5'-GTTAAAGAGAGCGGCGGAAAA-3'(SEQ ID NO.48)；
反向引物：5'-GATGTCCTTTTTGACGGATGC-3'(SEQ ID NO.49)；
突变K30I所用引物如下：
正向引物：5'-ATTGAGAGCGGCGGAAAAG-3'(SEQ ID NO.50)；
反向引物：5'-GATGATGTCCTTTTTGACGGATGC-3'(SEQ ID NO.51)；
突变E31Q所用引物如下：
正向引物：5'-CAAAGCGGCGGAAAAGTGGA-3'(SEQ ID NO.52)；
反向引物：5'-TTTGATGATGTCCTTTTTGACGGA-3'(SEQ ID NO.53)；
突变S32N所用引物如下：
正向引物：5'-AATGGCGGAAAAGTGGACAAG-3'(SEQ ID NO.54)；
反向引物：5'-CTCTTTGATGATGTCCTTTTTGACG-3'(SEQ ID NO.55)；
突变V36L所用引物如下：
正向引物：5'-CTTGACAAGCAGTTTAGAATCATCA-3'(SEQ ID NO.56)；
反向引物：5'-TTTTCCGCCGCTCTCTTTGAT-3'(SEQ ID NO.57)；
突变D37E所用引物如下：
正向引物：5'-AAGCAGTTTAGAATCATCAACGCG-3'(SEQ ID NO.58)；
反向引物：5'-TTCCACTTTTCCGCCGCTCT-3'(SEQ ID NO.59)；
突变F40Y所用引物如下：
正向引物：5'-AGAATCATCAACGCGGCAAAA-3'(SEQ ID NO.60)；
反向引物：5'-AAGCAGTTTAGAATCATCAACGCG-3'(SEQ ID NO.61)；
突变I42L所用引物如下：
正向引物：5'-CTTATCAACGCGGCAAAAGC-3'(SEQ ID NO.62)；
反向引物：5'-TCTAAACTGCTTGTCCACTTTTCC-3'(SEQ ID NO.63)；
突变K47Q所用引物如下：
正向引物：5'-CAAGCGAAGCTAGACAAAGAAG-3'(SEQ ID NO.64)；
反向引物：5'-TGCCGCGTTGATGATTCTAAAC-3'(SEQ ID NO.65)；
突变A48V所用引物如下：
正向引物：5'-GTTAAGCTAGACAAAGAAGCGC-3'(SEQ ID NO.66)；
反向引物：5'-TTTTGCCGCGTTGATGATTCT-3'(SEQ ID NO.67)；
突变L50M所用引物如下：
正向引物：5'-GACAAAGAAGCGCTTAAGGAAGT-3'(SEQ ID NO.68)；
反向引物：5'-CATCTTCGCTTTTGCCGCGTT-3'(SEQ ID NO.69)；
突变D51S所用引物如下：
正向引物：5'-AAAGAAGCGCTTAAGGAAGTC-3'(SEQ ID NO.70)；
反向引物：5'-AGATAGCTTCGCTTTTGCCG-3'(SEQ ID NO.71)；
突变K52E所用引物如下：
正向引物：5'-GAAGAAGCGCTTAAGGAAGTC-3'(SEQ ID NO.72)；
反向引物：5'-GTCTAGCTTCGCTTTTGCCG-3'(SEQ ID NO.73)；
突变E53Q所用引物如下：
正向引物：5'-CAAGCGCTTAAGGAAGTCAAA-3'(SEQ ID NO.74)；
反向引物：5'-TTTGTCTAGCTTCGCTTTTGCC-3'(SEQ ID NO.75)；
突变L55A所用引物如下：
正向引物：5'-GCTAAGGAAGTCAAAAATGATCCG-3'(SEQ ID NO.76)；
反向引物：5'-CGCTTCTTTGTCTAGCTTCG-3'(SEQ ID NO.77)；
突变E57K所用引物如下：
正向引物：5'-CTTGTCAAAAATGATCCGGATGT-3'(SEQ ID NO.78)；
反向引物：5'-CTTAAGCGCTTCTTTGTCTAGC-3'(SEQ ID NO.79)；
突变V58L所用引物如下：
正向引物：5'-GAAAAAAATGATCCGGATGTCG-3'(SEQ ID NO.80)；
反向引物：5'-TTCCTTAAGCGCTTCTTTGTCT-3'(SEQ ID NO.81)；
突变K59E所用引物如下：
正向引物：5'-CATAATGATCCGGATGTCGC-3'(SEQ ID NO.82)；
反向引物：5'-GACTTCCTTAAGCGCTTCTT-3'(SEQ ID NO.83)；
突变D63S所用引物如下：
正向引物：5'-AGTGTCGCTTATGTGGAAGAG-3'(SEQ ID NO.84)；
反向引物：5'-CGGATCATTTTTGACTTCCTTAAGC-3'(SEQ ID NO.85)；
突变V64I所用引物如下：
正向引物：5'-ATTGCTTATGTGGAAGAGGATC-3'(SEQ ID NO.86)；
反向引物：5'-ATCCGGATCATTTTTGACTTCC-3'(SEQ ID NO.87)；
突变V72K所用引物如下：
正向引物：5'-AAAGCCCATGCCTTGGCG-3'(SEQ ID NO.88)；
反向引物：5'-ATGATCCTCTTCCACATAAGCG-3'(SEQ ID NO.89)，
PCR反应体系均为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，2.5mM dNTPs 4μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，2.5U/μL PrimeSTAR Taq HS 0.5μL，加入双蒸水至50μL；
PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；随后进行98℃ 10s，55℃ 15s，72℃4min，30个循环；最后72℃保温10min；
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(DpnI)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将Dpn I处理后的扩增产物转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得含有编码前导肽突变体L76A、L76Y、L76I、L76V、L76M、L76F、L76W、D10S、S17A、G18S、K20T、A22N、V24S、I28A、I29V、K30I、E31Q、S32N、V36L、D37E、F40Y、I42L、K47Q、A48V、L50M、D51S、K52E、E53Q、L55A、E57K、V58L、K59E、D63S、V64I、V72K的基因的枯草芽孢杆菌工程菌。
将获得的含有编码未经缺失的前导肽的基因的枯草芽孢杆菌工程菌以及含有编码前导肽突变体L76A、L76Y、L76I、L76V、L76M、L76F、L76W、D10S、S17A、G18S、K20T、A22N、V24S、I28A、I29V、K30I、E31Q、S32N、V36L、D37E、F40Y、I42L、K47Q、A48V、L50M、D51S、K52E、E53Q、L55A、E57K、V58L、K59E、D63S、V64I、V72K的基因的枯草芽孢杆菌工程菌涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入种子培养基，于37℃、220rpm培养14h，获得种子液；将种子液按照5％(v/v)的接种量接入发酵体培养基，于37℃、220rpm培养28h，得到发酵液；将发酵液于4℃、12000rpm离心20min后，获得发酵上清液。
检测含有编码未经缺失的前导肽的基因的枯草芽孢杆菌工程菌以及含有编码前导肽突变体L76A、L76Y、L76I、L76V、L76M、L76F、L76W、D10S、S17A、G18S、K20T、A22N、V24S、I28A、I29V、K30I、E31Q、S32N、V36L、D37E、F40Y、I42L、K47Q、A48V、L50M、D51S、K52E、E53Q、L55A、E57K、V58L、K59E、D63S、V64I、V72K的基因的枯草芽孢杆菌工程菌发酵获得的发酵上清液中的酶活，检测结果见图1-2。
由图1-2可知，仅有含有编码前导肽突变体L76A、L76V、L76M、L76F、D10S、S17A、G18S、D37E、A48V、E57K、D63S的基因的枯草芽孢杆菌工程菌发酵获得的发酵上清液中的酶活较含有编码未经缺失的前导肽的基因的枯草芽孢杆菌工程菌发酵获得的发酵上清液中的酶活有了明显的提高，分别为144290、114370、124090、115300、128640、109290、122020、124860、157080、151750、136750U/L；而含有编码剩余前导肽突变体的基因的枯草芽孢杆菌工程菌发酵获得的发酵上清液中的酶活均较含有编码未经缺失的前导肽的基因的枯草芽孢杆菌工程菌发酵获得的发酵上清液中的酶活有了明显的下降。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用
<160> 89
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Gln Pro Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys
1 5 10 15
Ser Gly Val Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser
20 25 30
Gly Gly Lys Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala
35 40 45
Lys Leu Asp Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val
50 55 60
Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu
65 70 75
<210> 2
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctcagccgg cgaaaaatgt tgaaaaggat tatattgtcg gatttaagtc aggagtgaaa 60
accgcatccg tcaaaaagga catcatcaaa gagagcggcg gaaaagtgga caagcagttt 120
agaatcatca acgcggcaaa agcgaagcta gacaaagaag cgcttaagga agtcaaaaat 180
gatccggatg tcgcttatgt ggaagaggat catgtggccc atgccttg 228
<210> 3
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgcaaaccg ttccttacgg cattcctctc attaaagcgg acaaagtgca ggctcaaggc 60
tttaagggag cgaatgtaaa agtagccgtc ctggatacag gaatccaagc ttctcatccg 120
gacttgaacg tagtcggcgg agcaagcttt gtggctggcg aagcttataa caccgacggc 180
aacggacacg gcacacatgt tgccggtaca gtagctgcgc ttgacaatac aacgggtgta 240
ttaggcgttg cgccaagcgt atccttgtac gcggttaaag tactgaattc aagcggaagc 300
ggatcataca gcggcattgt aagcggaatc gagtgggcga caacaaacgg catggatgtt 360
atcaatatga gccttggggg agcatcaggc tcgacagcga tgaaacaggc agtcgacaat 420
gcatatgcaa gaggggttgt cgttgtagct gcagcaggga acagcggatc ttcaggaaac 480
acgaatacaa ttggctatcc tgcgaaatac gattctgtca tcgctgttgg tgcggtagac 540
tctaacagca acagagcttc attttccagt gtgggagcag agcttgaagt catggctcct 600
ggcgcaggcg tatacagcac ttacccaacg aacacttatg caacattgaa cggaacgtca 660
atggcttctc ctcatgtagc gggagcagca gctttgatct tgtcaaaaca tccgaacctt 720
tcagcttcac aagtccgcaa ccgtctctcc agcacggcga cttatttggg aagctccttc 780
tactatggga aaggtctgat caatgtcgaa gctgccgctc aataa 825
<210> 4
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val
1 5 10 15
Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp
100 105 110
Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg
130 135 140
Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn
145 150 155 160
Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val
165 170 175
Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly
180 185 190
Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr
195 200 205
Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro
210 215 220
His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu
225 230 235 240
Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu
245 250 255
Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala
260 265 270
Ala Gln
<210> 5
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttaatgct cgtgttcacg 60
atggccttca gcgattccgc gtct 84
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met
1 5 10 15
Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala
20 25
<210> 7
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttaatgct cgtgttcacg 60
atggccttca gcgattccgc gtctgctgct cagccggcga aaaatgttga aaaggattat 120
attgtcggat ttaagtcagg agtgaaaacc gcatccgtca aaaaggacat catcaaagag 180
agcggcggaa aagtggacaa gcagtttaga atcatcaacg cggcaaaagc gaagctagac 240
aaagaagcgc ttaaggaagt caaaaatgat ccggatgtcg cttatgtgga agaggatcat 300
gtggcccatg ccttggcgca aaccgttcct tacggcattc ctctcattaa agcggacaaa 360
gtgcaggctc aaggctttaa gggagcgaat gtaaaagtag ccgtcctgga tacaggaatc 420
caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gctttgtggc tggcgaagct 480
tataacaccg acggcaacgg acacggcaca catgttgccg gtacagtagc tgcgcttgac 540
aatacaacgg gtgtattagg cgttgcgcca agcgtatcct tgtacgcggt taaagtactg 600
aattcaagcg gaagcggatc atacagcggc attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacaaca 660
aacggcatgg atgttatcaa tatgagcctt gggggagcat caggctcgac agcgatgaaa 720
caggcagtcg acaatgcata tgcaagaggg gttgtcgttg tagctgcagc agggaacagc 780
ggatcttcag gaaacacgaa tacaattggc tatcctgcga aatacgattc tgtcatcgct 840
gttggtgcgg tagactctaa cagcaacaga gcttcatttt ccagtgtggg agcagagctt 900
gaagtcatgg ctcctggcgc aggcgtatac agcacttacc caacgaacac ttatgcaaca 960
ttgaacggaa cgtcaatggc ttctcctcat gtagcgggag cagcagcttt gatcttgtca 1020
aaacatccga acctttcagc ttcacaagtc cgcaaccgtc tctccagcac ggcgacttat 1080
ttgggaagct ccttctacta tgggaaaggt ctgatcaatg tcgaagctgc cgctcaataa 1140
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aagtcaggag tgaaaaccgc atcc 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agcagacgcg gaatcgctga agg 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gagagcggcg gaaaagtgga caag 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agcagacgcg gaatcgctga agg 23
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aaagtggaca agcagtttag aatcatcaac 30
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agcagacgcg gaatcgctga agg 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gacaaagaag cgcttaagga agtca 25
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
agcagacgcg gaatcgctga agg 23
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gatccggatg tcgcttatgt ggaag 25
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agcagacgcg gaatcgctga agg 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gatcatgtgg cccatgcctt gg 22
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agcagacgcg gaatcgctga agg 23
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
catgccgcgg cgcaaaccgt tccttac 27
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ggccacatga tcctcttcca cataagcg 28
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
catgcctatg cgcaaaccgt tccttac 27
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggccacatga tcctcttcca cataagcg 28
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
catgccatcg cgcaaaccgt tccttac 27
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ggccacatga tcctcttcca cataagcg 28
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
catgccgttg cgcaaaccgt tccttac 27
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ggccacatga tcctcttcca cataagcg 28
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
catgccatgg cgcaaaccgt tccttac 27
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ggccacatga tcctcttcca cataagcg 28
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
catgcctttg cgcaaaccgt tccttac 27
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ggccacatga tcctcttcca cataagcg 28
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
catgcctggg cgcaaaccgt tccttac 27
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ggccacatga tcctcttcca cataagcg 28
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tcttatattg tcggatttaa gtcaggagtg aaaacc 36
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cttttcaaca tttttcgccg gctg 24
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gctggagtga aaaccgcatc cg 22
<210> 37
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cttaaatccg acaatataat ccttttcaac atttttcg 38
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tctgtgaaaa ccgcatccgt c 21
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tgacttaaat ccgacaatat aatccttttc aacattt 37
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
actaccgcat ccgtcaaaaa ggacatca 28
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cactcctgac ttaaatccga caatataatc c 31
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
acttccgtca aaaaggacat catcaaag 28
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ggttttcact cctgacttaa atccgacaat 30
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tctaaaaagg acatcatcaa agagagcg 28
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ggatgcggtt ttcactcctg acttaaat 28
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
atcaaagaga gcggcggaaa ag 22
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
agcgtccttt ttgacggatg 20
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gttaaagaga gcggcggaaa a 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gatgtccttt ttgacggatg c 21
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
attgagagcg gcggaaaag 19
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gatgatgtcc tttttgacgg atgc 24
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
caaagcggcg gaaaagtgga 20
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tttgatgatg tcctttttga cgga 24
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
aatggcggaa aagtggacaa g 21
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ctctttgatg atgtcctttt tgacg 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
cttgacaagc agtttagaat catca 25
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
ttttccgccg ctctctttga t 21
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
aagcagttta gaatcatcaa cgcg 24
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ttccactttt ccgccgctct 20
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
agaatcatca acgcggcaaa a 21
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
aagcagttta gaatcatcaa cgcg 24
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
cttatcaacg cggcaaaagc 20
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
tctaaactgc ttgtccactt ttcc 24
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
caagcgaagc tagacaaaga ag 22
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
tgccgcgttg atgattctaa ac 22
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
gttaagctag acaaagaagc gc 22
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
ttttgccgcg ttgatgattc t 21
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
gacaaagaag cgcttaagga agt 23
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
catcttcgct tttgccgcgt t 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
aaagaagcgc ttaaggaagt c 21
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
agatagcttc gcttttgccg 20
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
gaagaagcgc ttaaggaagt c 21
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
gtctagcttc gcttttgccg 20
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
caagcgctta aggaagtcaa a 21
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
tttgtctagc ttcgcttttg cc 22
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
gctaaggaag tcaaaaatga tccg 24
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
cgcttctttg tctagcttcg 20
<210> 78
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
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<213> 人工序列
<400> 79
cttaagcgct tctttgtcta gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
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<211> 22
<212> DNA
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ttccttaagc gcttctttgt ct 22
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<211> 20
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<400> 82
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
atgatcctct tccacataag cg 22
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