阅读说明：本技术 一种生产角蛋白酶的方法 (Method for producing keratinase ) 是由 王克芬 张�杰 刘文龙 钱娟娟 王兴吉 刘胜利 贾仁洁 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物工程技术领域,特别涉及一种生产角蛋白酶的方法。该方法所采用的生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bucillus licheniformis)JR-101,保藏编号为CGMCC No.18643。该菌株经过液态发酵生产的角蛋白酶发酵液酶活力平均达到27703U/mL,所生产的角蛋白酶具有耐热、酶活力高、pH作用范围广泛、性能稳定而且价格较低的特点,应用范围广泛。(The invention belongs to the technical field of bioengineering, and particularly relates to a method for producing keratinase. The production strain adopted by the method is bacillus licheniformis (Bucillus licheniformis) JR-101, and the preservation number is CGMCC No. 18643. The enzyme activity of the keratinase fermentation liquor produced by the strain through liquid fermentation is 27703U/mL on average, and the produced keratinase has the characteristics of heat resistance, high enzyme activity, wide pH action range, stable performance, lower price and wide application range.)

一种生产角蛋白酶的方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种生产角蛋白酶的方法。

背景技术：

角蛋白广泛存在于自然界中，主要来源于动物的外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物，如羽毛、指甲、毛发等，是一种很难降解的硬性蛋白。角蛋白的化学结构比较稳定，不溶于水，难被胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白酶水解。角蛋白是一种具有极强抗性、难生物降解的硬蛋白，动物难以直接利用，而传统的物理和化学加工方法(如酸碱处理、高温高压等)不仅消耗大量能源还引发严重的环境污染问题。

角蛋白酶是一种新型的蛋白水解酶，它能够将角蛋白水解成游离的氨基酸或多肽。角蛋白酶的这种特性，可以用来处理废弃的动物羽毛和毛发等，一方面可以减少羽毛等废弃物对环境的污染，同时可以作为一种优良的蛋白质资源，对缓解蛋白资源供应紧张的局面有重要作用。能够被角蛋白酶水解的底物较多，如胶原蛋白、角蛋白和弹性蛋白等，并且对这些蛋白质的水解能力比常见的蛋白酶高，可以广泛的应用于动物饲料、皮革工业、医药原料及环境治理方面。

目前发现可降解角蛋白的微生物有30多种，其中有细菌、真菌和放线菌。拥有热稳定性较差的角蛋白酶严重影响其在工业上的应用，所以提高角蛋白酶的热稳定性有利于工业化应用。

发明内容

：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一株产热稳定性高的角蛋白酶的地衣芽孢杆菌，该菌株是经NTG诱变后获得的，具体为地衣芽孢杆菌(Bucillus licheniformis)JR-101，该菌株已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No.18643。

本发明的目的还在于提供一种发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的角蛋白酶的液态微生物发酵生产方法。本发明的目的可以通过以下措施来实现：

1.液态发酵生产角蛋白酶

培养基质量体积百分比组成如下：

a.发酵罐培养基：玉米淀粉2.5％，玉米粉3.5％，羽毛粉1.5％，黄豆粉3.5％，玉米浆3％，蔗糖3.2％，磷酸二氢钾1.7％，硫酸镁0.27％，pH 6.5；

b.发酵罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min。

c.发酵罐发酵工艺条件：接种量5％，罐压0.05-0.08Mpa，培养温度37℃，转速300-800 r/min，当溶氧降至最低再升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％，发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐；

2.补料

a.补料培养基：玉米淀粉25％，豆饼粉5.2％，玉米浆2.3％，羽毛粉1.5％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.2％，pH 6.5。

b.补料方法：当溶氧降至最低再升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％。

3.放罐

培养至96-110h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐。发酵结束时，发酵液酶活力平均达到27703U/mL。

4.角蛋白酶的提取与精制

发酵结束后，按发酵液体积加入40％的水和0.3％氯化钙，加入3％珍珠岩助滤剂，进行压滤，滤液经超滤浓缩后可进行酒精溶析得到固体酶制剂，也可将浓缩液加入20％甘油作稳定剂得到液体酶制剂。

本发明制备的角蛋白酶，酶学特性如下：

(1)最适反应温度为75℃，在80℃条件下保温2h酶活保持不变，95℃保温2h，仍能保持87％以上的酶活，在煮沸的条件下保温2h酶活下降至65％左右，热稳定性较好；

(2)最适反应pH为7.5，在pH3.0-11.0的条件下处理2h，相对酶活力仍然保持在80％以上。

有益效果：

本发明的角蛋白酶及其生产方法所公开的技术方案，相比现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，并能产生如下积极效果：

1.本发明提供了一株经诱变获得的地衣芽孢杆菌，该菌株经过液态发酵生产的角蛋白酶，具有耐热、酶活力高、pH作用范围广泛、性能稳定而且价格较低的特点，应用范围广泛。

2.本发明提供了一种发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低的角蛋白酶液态生物发酵的生产方法。

说明书附图：

图1最适反应温度曲线图；

图2热稳定性曲线图；

图3最适反应pH曲线图；

图4pH稳定性曲线图。

具体实施方式

：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1菌株的诱变选育

将菌种接种到种子培养基中，37℃培养至对数期，然后收集菌体，8000rpm离心3min，用生理盐水洗涤菌体沉淀2次，最后用缓冲液重悬菌体，并加入NTG母液，使得最终浓度为 0.5g/L。然后于37℃反应30min，经适当稀释之后，取100ul涂布于筛选平板上37℃培养24h 左右，计算致死率。挑取筛选平板上透明圈较大的单菌落接种种瓶中培养，待种子长好后接入摇瓶进行复筛。选择角蛋白酶产量较高，并且能够稳定遗传3代以上的菌株，作冻干管保藏。通过NTG诱变筛选到一株酶活提高6.5倍的高产菌株JR-101，通过酶学特性研究，该突变菌株产生的角蛋白酶具有良好的热稳定性。

1)角蛋白酶高产菌株JR-101的稳定性传代实验

挑取筛选平板上生长情况较好的JR-101单菌落接种到种瓶中，37℃，220rpm培养10h 左右，按2％接种量转接到发酵摇瓶，37℃，220rpm培养96h左右，测定酶活。将该菌株连续传代10次的摇瓶结果如表1所示：

表1.菌株JR-101稳定性检测结果

将该突变菌株传代培养10代，实验结果由表1可以看出，该突变菌株的遗传性稳定好。

实施例2角蛋白酶酶活测定方法

将发酵上清液(或酶液)用pH8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至合适的倍数，取1mL稀释好的酶液，加入0.01g羽毛粉，充分混匀，50℃条件下反应60min，加入2mL 10％三氯乙酸终止反应，将反应液8000rpm离心5min，于280nm测定吸光度。空白组实验条件相同，先加入2mL三氯乙酸再加入酶液。

酶活单位为实验组相对空白组每增加0.01吸光度所需要的酶量。

U＝4n×A280/(0.01×10)

其中：n为稀释倍数；

4为终止反应体积(mL)；

10为反应时间(min)。

实施例3菌株JR-101液体发酵生产角蛋白酶及其提取

1.种子培养

培养基质量体积百分比组成如下：

a.平板分离培养基

葡萄糖2％，酵母膏3％，羽毛粉1.5％，NaNO₃ 0.2％，K₂HPO₄ 0.1％，KCl 0.05％，MgSO₄ 0.05％，琼脂1.5％～2.0％，pH自然，121℃灭菌20min；

b.液态种子培养基

玉米淀粉10％，酵母粉2.5％，硝酸钠2％，(NH₄)₂SO₄ 5％，K₂HPO₄ 1％，MgSO₄·7H₂O0.5％，pH 6.5。

c.发摇瓶酵培养基

玉米淀粉10％，羽毛粉1.5％，蛋白胨0.3％，豆饼粉3％，NaNO₃ 0.4％，KH₂PO₄0.2％， KCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.07％，pH自然，121℃灭菌20min。

d.培养条件

分离平板：37℃培养24h；

液体种子：37℃培养10h，摇床转速220r/min；

发酵摇瓶：37℃培养96h，摇床转速220r/min。

2.种子罐扩大培养

培养基质量体积百分比组成如下：

a.种子罐培养基

葡萄糖3％，蛋白胨2.5％，豆饼粉2％，氯化钠1％，(NH₄)₂SO₄ 2％，MgSO₄·7H₂O0.5％，pH 7.0；

b.种子罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min。

c.种子罐培养工艺条件

罐压0.05-0.08MPa，接种量5％，培养温度37℃，搅拌转速180-200r/min，pH控制6.5。

d.种子罐移种条件：菌体染色深、粗壮，无杂菌。

3.液态发酵生产角蛋白酶

培养基质量体积百分比组成如下：

a.发酵罐培养基

玉米淀粉2.5％，玉米粉3.5％，羽毛粉1.5％，黄豆粉3.5％，玉米浆3％，蔗糖3.2％，磷酸二氢钾1.7％，硫酸镁0.27％，pH 6.5；

b.发酵罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min。

c.发酵罐发酵工艺条件

接种量5％，罐压0.05-0.08Mpa，培养温度37℃，转速500r/min，当溶氧降至最低再升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％。发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐；

4.补料

培养基质量体积百分比组成如下：

a.补料培养基

玉米淀粉25％，豆饼粉5.2％，玉米浆2.3％，羽毛粉1.5％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾 0.2％，pH 6.5。

b.补料培养基灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min。

c.补料方法

当溶氧降至最低再升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％。

5.放罐

培养至96-110h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐。

6.角蛋白酶的提取与精制

发酵结束后，按发酵液体积加入40％的水和0.3％氯化钙，加入3％珍珠岩助滤剂，进行压滤，滤液经超滤浓缩后将浓缩液加入20％甘油作稳定剂得到液体酶制剂。

应用上述地衣芽孢杆菌诱变菌株CGMCC No.18643及培养基进行发酵，表3表是进行6 批发酵的发酵周期和发酵液酶活力，平均发酵液酶活力为：27703U/mL。

表3.3L小罐发酵实验结果

批次	发酵周期(h)	发酵酶活力(u/mL)
			1	98	27890
2	103	29760
			3	96	28670
4	108	26670
			5	105	27360
6	103	25870

实施例4最适反应温度

取实施例3制备的角蛋白酶成品，在pH7.0时，分别在40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95℃条件下测定角蛋白酶活力，计算相对酶活力，以酶活最高者为100％。结果如图1所示，最适反应温度为75℃。

实施例5热稳定性

取实施例3制备的角蛋白酶成品，将酶液分别置于80、85、90、95、100℃条件下保温处理2h，保温结束后75℃，pH7.0条件下测定酶活，并计算相对酶活力，以酶活最高者为100％。其实验结果如图2所示。在80℃条件下保温2h酶活保持不变，90℃保温2h，仍能保持87％以上酶活，在煮沸的条件下保温2h酶活下降为65％左右。

实例6最适反应pH

取实施例3制备的角蛋白酶成品，根据实施例2所述的酶活测定方法，在温度为75℃条件下，分别测定在pH值在5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5条件下角蛋白酶活力，并计算相对酶活力，以酶活最高者为100％。测定结果如图3所示，角蛋白酶的酶活在pH为7.5附近时酶活最高。

实施例7耐酸碱性

取实施例3制备的角蛋白酶成品分别用0.1M的NaOH或0.1M的HCl将其酶液的pH调整为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，分别置于室温条件下静置 2h后，在75℃条件下测定酶活力，并计算相对酶活力，以酶活最高者为100％。测定结果如图4所示，在pH3.0-11.0的条件下处理2h后，相对酶活力仍然保持在80％以上。