阅读说明：本技术 一种提高酶驱动微纳米马达驱动力的方法 (Method for improving driving force of enzyme-driven micro-nano motor ) 是由 罗明 李守丽 官建国 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高酶驱动微纳米马达驱动力的方法,该方法是通过酶在三维空间上组装扩展以增加酶含量,从而提高酶驱动微纳米马达的驱动力,进一步为通过链霉亲和素与生物素的特异性结合,将生物素化酶组装到所述生物素化粒子上,得到酶驱动微纳米马达。具体为：1)以微纳米粒子为模板,在其表面非对称包覆金属Au层,形成双面神粒子,再利用Au-S键将Biotin-HPDP修饰于双面神粒子表面；2)利用巯基与马来酰亚胺之间的键合,将生物素化试剂修饰于生物酶表面；3)利用链霉亲和素与生物素的特异性结合,将生物素化酶通过层层自组装固定于生物素化双面神粒子表面。该方法普适性强,所制备的马达的酶含量高、驱动力强,能够在模拟血液粘度条件下运动。(The invention discloses a method for improving enzyme-driven micro-nano motor driving force, which is characterized in that enzyme is assembled and expanded on a three-dimensional space to increase enzyme content, so that the driving force of the enzyme-driven micro-nano motor is improved, and further, biotinylated enzyme is assembled on biotinylated particles through specific binding of streptavidin and biotin, so that the enzyme-driven micro-nano motor is obtained. The method specifically comprises the following steps: 1) the method comprises the following steps of (1) asymmetrically coating a metal Au layer on the surface of a micro-nano particle serving as a template to form a double-sided particle, and modifying Biotin-HPDP on the surface of the double-sided particle by utilizing an Au-S bond; 2) modifying a biotinylation reagent on the surface of the biological enzyme by utilizing the bonding between sulfydryl and maleimide; 3) the specific combination of streptavidin and biotin is utilized to fix the biotinylation enzyme on the surface of the biotinylation Shuangshen particle through layer-by-layer self-assembly. The method has strong universality, and the prepared motor has high enzyme content and strong driving force and can move under the condition of simulating blood viscosity.)

一种提高酶驱动微纳米马达驱动力的方法

技术领域

本发明涉及微纳器件制备技术领域，尤其涉及一种提高酶驱动微纳米马达驱动力的方法。

背景技术

酶驱动微纳米马达是一种以酶催化反应将化学能转化成机械能的微纳米器件。目前以脲酶/葡萄糖氧化酶驱动的酶驱动马达的研究已经取得了众多研究者的兴趣。美国《美国化学学会》杂志(ACS Nano.2016年，第10卷，3597页)报道了一种运动可控的脲酶驱动微纳米马达，运动速度可达10μm/s。英国《化学通讯》杂志(Chem.Commun.2013年，第49卷，2397页)报道了一种生物素化蛋白网状组装放大信号的方法。脲酶/葡萄糖氧化酶驱动马达以尿素/葡萄糖为燃料，生物相容性好且燃料可取自生物介质中；酶作为催化剂寿命长；并且通过引入磁性介质实现运动方向的精确控制；脲酶/葡萄糖氧化酶驱动马达将有望应用于生物医药领域。但是目前酶驱动微纳米马达的驱动力较弱，因此不能够在高盐和高粘度条件运动。这限制酶驱动微纳米马达在生物传感、靶向给药和微创手术等领域的应用。

因此，本发明利用蛋白质自组装技术实现酶在三维空间上组装扩展制备得到酶驱动微纳米马达，马达的酶含量高，因此其驱动力得到显著提高，并且能够在模拟血液粘度燃料中自主运动。

发明内容

基于以上现有技术的不足，本发明所解决的技术问题在于提供一种提高酶驱动微纳米马达驱动力的制备方法，该方法普适性强，所制备的微纳米马达的酶含量高、驱动力强，运动速度可达21.0±0.8μm/s，极大地提高了酶驱动马达的运动速率。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高酶驱动微纳米马达驱动力的制备方法，通过酶在三维空间上组装扩展以增加酶含量，从而提高酶驱动微纳米马达的驱动力，进一步为通过链霉亲和素与生物素的特异性结合，将生物素化酶组装到所述生物素化粒子上，得到酶驱动微纳米马达。

作为上述技术方案的优选，本发明提供的提高酶驱动微纳米马达驱动力的制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：

作为上述技术方案的改进，使用三步法制备：

1)制备生物素化双面神粒子：以微纳米粒子为模板，在其表面非对称包覆金属Au层，形成双面神粒子，再利用Au-S键将N-(6-[生物素胺]己基)-3'-(2'-吡啶二硫)丙酰胺(Biotin-HPDP)修饰于双面神粒子表面；

2)制备生物素化酶：利用巯基与马来酰亚胺之间的键合，将生物素化试剂Na-(3-maleimidylpropionyl)biocytin修饰于生物酶表面；

3)制备酶驱动微纳米马达：利用链霉亲和素与生物素的特异性结合，将生物素化酶通过层层自组装固定于生物素化双面神粒子表面。

作为上述技术方案的改进，所制备的酶驱动微纳米马达能够在模拟血液粘度(4～5mPa·s)条件下自主运动，可以应用于生物医药领域。

作为上述技术方案的改进，所述步骤(1)具体为：将微纳米粒子乙醇悬浊液滴到氧等离子体清洗后的玻片上，室温自然蒸发后形成单层微纳米粒子；将玻片移到磁控溅射的腔室中，喷溅金属Au层，通过超声和离心收集制备得到的双面神微纳米粒子，并且超纯水洗涤数次备用。将N-(6-[生物素胺]己基)-3'-(2'-吡啶二硫)丙酰胺(Biotin-HPDP)在45℃条件下超声溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，接着加入磷酸三丁酯溶液混合均匀，水浴45℃条件下反应30min；再依次加入超纯水，无水乙醇和双面神微纳米粒子混合均匀，恒定温度25℃条件下振荡反应过夜；分别用超纯水洗涤2次，PB缓冲溶液(10mmol/L，pH 7.4)洗涤3次。

作为上述技术方案的改进，所述步骤(2)具体为：将生物素化试剂(Na-(3-maleimidylpropionyl)biocytin)和脲酶混合均匀，恒定温度25℃条件下振荡反应2h；PB缓冲溶液(10mmol/L，pH 7.4)洗涤和超滤离心收集5次。

作为上述技术方案的改进，所述步骤(3)具体为：将生物素化双面神微纳米粒子、生物素化酶和链霉亲和素混合均匀，恒定温度25℃条件下振荡反应过夜，超纯水洗涤3次。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

1、本发明所述的制备方法可以实现酶在空间上组装扩展从而增加酶含量使得酶驱动微纳米马达驱动力和运动速度得到显著提高。

2、本发明所制备的酶驱动微纳米马达驱动力强，能够在模拟血液粘度条件下自主运动，有效解决了酶驱动微纳米马达驱动力弱、无法在高粘度条件下运动问题，为酶驱动微纳米马达在生物医药领域的医用提供了一种有效的解决方法。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，详细说明如下。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。

图1：本发明所述基于蛋白质(酶)组装技术制备酶驱动马达的过程图；

图2：本发明所述生物素化双面神微纳米粒子的能量色散X射线光谱图(EDS)；

图3：本发明所述利用TMB-HRP比色法通过对比脲酶和生物素化脲酶验证生物素化脲酶上生物素的光学图像；

图4：本发明所述经过Krypton蛋白染色后酶驱动马达的明场和荧光场显微镜图像；

图5：本发明所述酶驱动马达在不同尿素浓度下的运动速率图；

图6：本发明所述酶驱动马达在10mM尿素，35w/v％蔗糖溶液下的运动情况图，时间为30s；

具体实施方式

下面详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。

实施例1

基于蛋白质自组装制备酶驱动马达的过程如图1所示。双面神微纳米粒子是利用磁控溅射技术制备得到的。取0.05mL微纳米磁珠乙醇悬浊液滴到氧等离子体清洗后的玻片(25×25mm)上，室温自然蒸发后形成单层微纳米磁珠；将玻片移到磁控溅射的腔室中，直流电源在单层微纳米磁珠表面喷镀一层薄的金层(35s)，通过超声收集制备得到的双面神微纳米磁珠，并且超纯水洗涤数次后分散在超纯水中备用。

生物素化双面神微纳米磁珠是利用共价偶联技术将生物素偶联到双面神微纳米磁珠的金层上得到的，具体步骤如图1a所示。首先，取1mg Biotin-HPDP在45℃条件下超声6min溶解在7mL的DMF溶液中。在上述混合溶液中加入5μL磷酸三丁酯溶液在45℃下反应30min后，在其中加入4mL水、4mL乙醇和0.1mg双面神微纳米磁珠，在室温下震荡反应过夜。最后，制备得到的生物素化双面神微纳米磁珠先用超纯水洗2次，再用PB缓冲溶液(10mmol/L，pH 7.4)洗涤3次，重新分散在1mL的超纯水中备用。所得的生物素化双面神微纳米磁珠的能谱图如图2所示，其碳元素均匀分布在整个粒子上；金元素分布在粒子的半球上，并且生物素试剂特有元素硫元素同样分布在粒子的半球上且与金元素相对应。

生物素化脲酶是利用共价偶联技术将生物素偶联到脲酶表面上得到的，具体步骤如图1b所示。首先，利用PB缓冲溶液(100mmol/L PB，pH 7.4)配置2mg/mL的脲酶溶液和0.1mmol/L的生物素化试剂(Na-(3-maleimidylpropionyl)biocytin)溶液。然后将上述溶液按脲酶和生物素化试剂的体积比为4:1混合均匀，室温振荡反应2h。反应结束后用PB缓冲溶液(10mmol/L，pH 7.4)洗涤5次，配置溶度为2mg/mL置于4℃备用。所得的脲酶和生物化脲酶的光学显色图像如图3所示，脲酶的溶液几乎无色；生物素化脲酶溶液呈现黑色。

脲酶驱动微纳米马达是利用链霉亲和素和生物素的特异性结合将生物素化脲酶组装到生物素化双面神微纳米磁珠上得到的,具体步骤如图1c所示。取50μg生物素化双面神微纳米磁珠置于2mL离心管中，接着依次加入60μL PB缓冲溶液(10mM，pH 7.4)，30μL生物素化脲酶溶液(2mg/mL)和10μL链霉亲和素溶液(2mg/mL)，超声并震荡混合均匀后，置于25℃环境下震荡反应过夜；制备得到的脲酶驱动微纳米马达用超纯水洗涤3次；配置最终浓度为0.1mg/mL并放置于4℃备用。

实施例2

将实施例1中所得脲酶驱动微纳米马达与稀释10倍的Krypton蛋白混合染色30min后，在倒置荧光显微镜下进行观察。结果如图4所示，脲酶驱动微纳米马达的一侧发出荧光，即图4b中较亮的部分，说明脲酶确实偶联到马达的一侧，脲酶驱动微纳米马达构建成功。

实施例3

将实施例1中所得脲酶驱动微纳米马达分别置于不同浓度尿素溶液中，观察其运动行为。通过马达运动路程比上相应的时间间隔计算得到马达的运动速率如图5所示；随着尿素浓度的增加，马达的运动速率也随之增加，当尿素浓度达到10mM时，马达的运动速率开始达到饱和，可以达到21.0±0.8μm/s，实施例1中所得脲酶驱动微纳米马达的运动速率是先前报道的酶驱动马达运动速率的2～3倍，有效地提高了酶驱动马达的运动速率。

实施例4

实施例1中所得脲酶驱动微纳米马达运动速率有所提高，可以尝试模拟血液粘度(4～5mPa·s)下运动情况。将酶驱动马达置于10mM尿素，35w/v％蔗糖溶液中，观察马达运动情况如图6所示。酶驱动马达置于10mM尿素，35w/v％蔗糖溶液中30s后的运动轨迹如图6A中所示，马达具有轨迹，并不是原地振动。并且通过计算得到均方位移和运动速率如图6B所示，马达的均方位移与时间间隔的函数曲线呈现出抛物线形状，说明马达在10mM尿素，35w/v％蔗糖溶液中呈现出自主运动，并且马达的运动速率为1.89μm/s；说明酶驱动马达在模拟血液粘度下能够自主运动。

本发明所述方法普适性强，制备得到的酶驱动马达上酶含量显著增多使得其驱动力强；并且能够在高粘度条件下运动，为酶驱动马达在生物医药领域的医用提供了一种有效的解决方法。

本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。