阅读说明：本技术 一种发酵生产辛伐他汀合成用酰化酶的方法 (Method for producing acylase for simvastatin synthesis by fermentation ) 是由 史磊 申洋 陈东 朱维忠 于 2019-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种发酵生产辛伐他汀酰化酶的方法,本发明属于发酵工程技术领域,所述方法,包括以下步骤：1)将重组大肠杆菌CH39807种子液接种至发酵培养基中36～38℃进行菌体发酵；2)当发酵液的OD<Sub>600</Sub>值为20～35时,开始对发酵液进行降温,降温至25℃,当所述发酵液的温度≤30℃时,加入IPTG诱导表达10～12h后,收集菌体；3)重悬收集到的菌体后,进行均质、絮凝、固液分离,收集上清酶液。所述方法发酵周期短、发酵获得的酶活力单位高、产量稳定、提取简单。(The invention provides a method for producing simvastatin acylase by fermentation, belonging to the technical field of fermentation engineering, and the method comprises the following steps: 1) inoculating the recombinant Escherichia coli CH39807 seed solution into a fermentation culture medium, and fermenting the thallus at 36-38 ℃; 2) when OD of fermentation broth 600 When the value is 20-35 ℃, beginning to cool the fermentation liquor to 25 ℃, when the temperature of the fermentation liquor is less than or equal to 30 ℃, adding IPTG (isopropyl-beta-thiogalactoside) for induction expression for 10-12 h, and collecting thalli; 3) after the collected cells were resuspended, homogenization, flocculation, and solid-liquid separation were carried out, and the supernatant enzyme solution was collected. The method has the advantages of short fermentation period, high unit of enzyme activity obtained by fermentation, stable yield and simple extraction.)

一种发酵生产辛伐他汀合成用酰化酶的方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，尤其涉及一种发酵生产辛伐他汀酰化酶的方法。

背景技术

利用重组工程菌的发酵生产酰化酶的方法与常规的方法不同。就其选用的生物材料而言，前者含有带外源基因的重组载体，而后者是单一的微生物细胞；从发酵工艺考虑，重组菌发酵生产的目的是希望能获得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。而外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处的环境条件息息相关，因此按常规的发酵工艺生产酰化酶周期长、生产获得的酶活力低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种发酵生产辛伐他汀酰化酶的方法，所述方法发酵周期短、发酵获得的酶活力单位高、产量稳定、提取简单。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种发酵生产辛伐他汀合成酰化酶的方法，包括以下步骤：

1)将重组大肠杆菌CH39807种子液接种至发酵培养基中36～38℃进行菌体发酵；

2)当发酵液的OD₆₀₀值为20～35时，开始对发酵液进行降温，降温至25℃，当所述发酵液的温度≤30℃时，加入IPTG诱导表达10～12h后，收集菌体；

3)重悬收集到的菌体后，进行均质、絮凝、固液分离，收集上清液为酶液。

优选的，步骤1)中所述的发酵培养基，以水为溶剂，每10L包括以下质量的组分：十二水合磷酸氢二钠160～190g、磷酸二氢钾60～80g、氯化铵45～60g、硫酸钠10～20g、七水合硫酸镁8～15g、蛋白胨90～110g、酵母粉40～60g、甘油90～110g、消泡剂3～8mL和三氯化铁0.1～0.6g。

优选的，步骤1)中所述重组大肠杆菌CH39807种子液的接种量为4％～6％，所述重组大肠杆菌CH39807种子液的OD₆₀₀为1.0～1.4。

优选的，步骤1)中所述菌体发酵的溶氧量控制在20％以上。

优选的，步骤1)中所述的菌体发酵过程的pH值控制在5.9～6.5。

优选的，步骤1)中所述的菌体发酵过程中补加葡萄糖溶液。

优选的，步骤1)中当发酵液的OD₆₀₀值为30～32时，开始对发酵液进行降温。

优选的，步骤2)中所述IPTG在发酵体系中的终浓度为0.08～0.12mmol/L。

优选的，步骤2)中所述诱导表达过程中的pH值为6.9～7.2。

优选的，步骤3)中所述均质的压力为700～800bar，所述均质的温度为4～6℃，所述均质的次数为1～3次。

本发明的有益效果：本发明提供的发酵生产辛伐他汀合成酰化酶的方法，将重组大肠杆菌CH39807进行菌体发酵后诱导酰化酶的表达；通过控制发酵阶段的参数以及诱导表达的时机，实现酰化酶的生产；本发明所述方法生产周期短，发酵周期在24h以内，发酵酶活力单位高，酶活力单位达到110～130U/mL，所述方法获得的酰化酶产量稳定，并且提取方法简单，能够适应工业化生产需求。

具体实施方式

本发明提供了一种发酵生产辛伐他汀合成酰化酶的方法，包括以下步骤：1)将重组大肠杆菌CH39807种子液接种至发酵培养基中36～38℃进行菌体发酵；2)当发酵液的OD₆₀₀值为20～35时，开始对发酵液进行降温，降温至25℃，当所述发酵液的温度≤30℃时，加入IPTG诱导表达10～12h后，收集菌体；3)重悬收集到的菌体后，进行均质、絮凝、固液分离，收集上清液为辛伐他汀合成酰化酶。

在本发明中，将重组大肠杆菌CH39807种子液接种至发酵培养基中36～38℃进行菌体发酵。

在本发明中，所述大肠杆菌CH39807为重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌CH39807为转入外源基因pET-25a-PHSP1和pET-11bcrtE的重组大肠杆菌。在本发明中，所述种子液的接种量以接种体积百分比计，优选为4％～6％，更优选为5％；在本发明中，所述重组大肠杆菌CH39807种子液的OD₆₀₀优选为1.0～1.4，更优选为1.1～1.3。在本发明中，所述种子液优选的为活化后的种子液；在本发明中，所述活化的培养基优选为含氨苄青霉素的LB培养基，所述活化的接种量以体积百分比计，优选为0.5％～1.5％，更优选为1.0％。所述活化的温度优选为37℃，所述活化的时间优选为3～4h；所述活化过程中优选的伴随震荡，所述震荡的转速优选为6000rpm。

在本发明中，所述的发酵培养基，以水为溶剂，每10L优选的包括以下质量的组分：十二水合磷酸氢二钠160～190g、磷酸二氢钾60～80g、氯化铵45～60g、硫酸钠10～20g、七水合硫酸镁8～15g、蛋白胨90～110g、酵母粉40～60g、甘油90～110g、消泡剂3～8mL和三氯化铁0.1～0.6g，更优选包括十二水合磷酸氢二钠179g、磷酸二氢钾68g、氯化铵53g、硫酸钠14g、七水合硫酸镁10g、蛋白胨100g、酵母粉50g、甘油100g、消泡剂5mL和三氯化铁0.3g。本发明对所述消泡剂的种类没有特殊限定，采用本领域常规的市售发酵用消泡剂即可，优选为聚醚类消泡剂。

在本发明中，所述菌体发酵的溶氧量优选的控制在20％以上；在本发明中，所述溶氧量的控制通过通气和补加葡萄糖溶液实现；在本发明中，所述葡萄糖溶液的浓度(w/v)优选为55％～65％，更优选为60％。在本发明中，所述的菌体发酵过程的pH值控制在5.9～6.5。在本发明中，所述pH值的控制优选的通过补加氨水实现。本发明对所述氨水的补加量以及时间没有特殊限定，以控制所述发酵体系的pH值在5.9～6.5为宜。

在本发明中，所述菌体发酵优选的在发酵罐中进行；本发明对所述发酵罐的体积没有特殊限定，根据发酵需求确定具体的发酵罐的体积。本发明在使用发酵罐进行菌体发酵时，所述菌体发酵前优选的进行消罐，本发明对所述消罐的具体参数没有特殊限定，采用常规的消罐参数即可；在本发明具体实施过程中，所述消罐优选的包括以下步骤：将所述发酵培养基倒入发酵罐后，121℃灭菌30min；降温后控制温度为36～38℃，空气通气比设定为1:1，转速为180～220rpm，稳定20min后标定溶氧为100％；控制发酵培养基的pH值为5.9～6.1。本发明在所述消罐结束后，进行接种；在本发明中，所述接种优选的为火焰接种，所述接种的过程中，优选的添加氨苄青霉素，所述氨苄青霉素在发酵体系中的终浓度优选为45～55mg/L，更优选为50mg/L。

在本发明中，当发酵液的OD₆₀₀值为20～35时，开始对发酵液进行降温，降温至25℃，当所述发酵液的温度≤30℃时，加入IPTG诱导表达10～12h后，收集菌体。在本发明中，优选的当发酵液的OD₆₀₀值为30～32时，开始对发酵液进行降温。在本发明中，所述IPTG在发酵体系中的终浓度优选为0.08～0.12mmol/L，更优选为0.1mmol/L。在本发明中，所述诱导表达过程中的pH值优选为6.9～7.2，更优选为7.0。本发明在所述诱导表达后，收集菌体。在本发明中，所述收集菌体的方法优选为离心，所述离心的转速优选为5000～7000rpm，更优选为5500～6500rpm，最优选为6000rpm；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min；所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。

本发明在收集到菌体后，重悬收集到的菌体后，进行均质、絮凝、固液分离，收集上清液为酶液。在本发明中，所述重悬优选的采用4℃预冷的PBNa缓冲溶液进行；所述PBNa缓冲溶液的质量优选为收集到菌体湿重的2.5～3.5倍；所述PBNa缓冲溶液的pH值优选为8.5；所述PBNa缓冲溶液的浓度优选为40～60mmol/L，更优选为50mmol/L。本发明在所述重悬后进行均质，所述均质的压力优选为700～800bar，更优选为750bar；所述均质的温度优选为4～6℃，更优选为5℃；所述均质的温度优选的通过低温冷却液循环泵控制；所述均质的次数优选为1～3次，更优选为2次。

本发明在所述均质后，进行絮凝，所述絮凝使用的絮凝剂优选为苯扎氯铵，所述苯扎氯铵的浓度优选为30％；所述苯扎氯铵的添加量优选为50～60ml/L，更优选为55ml/L。在本发明中，所述絮凝的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述絮凝的时间优选为50～70min，更优选为60min；所述絮凝过程中伴随搅拌，本发明对所述搅拌的转速没有特殊限定。

本发明在所述絮凝结束后，优选的进行固液分离。所述固液分离的方法优选为离心，所述离心的转速优选为5000～7000rpm，更优选为5500～6500rpm，最优选为6000rpm；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min；所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。在本发明中，固液分离后，收集液相组分即为酶液。

本发明在所述固液分离后，优选的还包括酶液的沉淀纯化步骤，所述沉淀纯化用试剂优选为硫酸铵；所述硫酸铵的使用量优选的根据酶液体积和硫酸铵溶液饱和度计算表(0℃)计算获得的饱和的硫酸铵量。在本发明中，所述沉淀纯化的温度优选的为0℃；所述沉淀纯化优选的在冰浴上进行；所述沉淀纯化过程中优选的伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为100～200rpm，更优选为150rpm；所述搅拌的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2.0h。本发明在所述沉淀纯化后优选的进行离心，收集沉淀为纯化的酰化酶。在本发明中，所述离心的转速优选为11000～13000rpm，更优选为12000rpm；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min；所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

菌种活化

划平板：取原种菌种CH39807在B平板上划线(含氨苄青霉素50μg/ml)，37℃倒置培养过夜；

接试管：从平板上挑单菌至5ml LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/ml)试管中，37℃、200rpm摇床振荡培养过夜；

接摇瓶：试管菌种OD₆₀₀长至3～4，以1％接种量接种到两瓶100ml LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/ml)摇瓶中，37℃、200rpm摇床振荡培养；

保种：约4h后OD₆₀₀长到1.2～1.4，无菌操作将其中一瓶菌液用50ml灭菌离心管3000rpm离心5min，倒掉上清，菌体沉淀用10ml LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/ml)悬溶混匀，1ml菌悬液+0.43ml50％甘油加至冻存管中(甘油终浓度15％)，混匀后编号，置-80℃保藏。

发酵表达

接种：从保藏甘油管中取出菌液以1％接种量接入含有150ml LB培养基(含氨苄青霉素50ug/ml)的摇瓶中，37℃摇床培养；3～4h，待OD₆₀₀长至1.2±0.1，开始移种进罐；

发酵培养基，以水为溶剂，10L包括以下组分：十二水合磷酸氢二钠179g、磷酸二氢钾68g、氯化铵53g、硫酸钠14g、七水合硫酸镁10g、蛋白胨100g、酵母粉50g、甘油100g、消泡剂5mL和三氯化铁0.3g。

消罐：将发酵培养基配制好后倒入发酵罐，121℃灭菌30min；降温后控制温度37℃，通空气通气比为1:1，转速200rpm，稳定20min后标定溶氧为100％；测定培养基pH6.0±0.1(如需调节用氨水调节)；

进罐：将长好的种子液火焰接种进罐，接种量5％，并加入3ml氨苄青霉素(终浓度50mg/L，氨苄青霉素溶液过滤除菌后使用)；

发酵控制：发酵前期发酵罐参数：200rpm，37℃，通气比1:1(进口空气压力0.08MPa)，不控pH，随OD₆₀₀增长调整搅拌转速及空气流量，溶氧控制在20％以上。pH开始下降时，补氨水0.5h将pH调至6.5；待溶氧突变上升，固定此时的转速及通气量分别为500rpm，10L/min)开始补加葡萄糖(60％w/v，115℃灭菌20min)，补料速度与溶氧关联设定控制溶氧值20％；

诱导表达：定时取样检测OD₆₀₀并填写发酵记录，待OD₆₀₀长至30，将温度设定为25℃开始降温，温度降到30℃以下时加入IPTG6ml(终浓度1mmol/L)，开始诱导，并将pH调整为7.0；菌液OD₆₀₀停止增长后结束。

菌体破碎纯化

离心收集菌体：将发酵液在6000rpm、4℃条件下离心15min，弃上清；沉淀菌体称重，得到菌体湿重M湿重(g)；

菌体均质破碎：将湿菌体重悬于3倍湿重体积的4℃预冷的PBNa缓冲溶液(pH8.5、50mM)中；均质破碎：低温冷却液循环泵控制低温4～6℃，用均质机均质(750bar)菌悬液两遍，注意控制菌液低温。

絮凝：滴加30％苯扎氯胺(55ml/L)；37℃恒温搅拌，沉淀1h。

4℃条件下离心20min，收集上清酶液，弃掉沉淀。

硫酸铵沉淀纯化：根据收集的上清酶液体积V和硫酸铵溶液饱和度计算表(0℃)计算硫酸铵固体加量并称量固体硫酸铵，在冰浴条件下边搅拌(150rpm)边缓慢加入40％浓度硫酸铵(22.6g/100ml)，调整搅拌至100rpm，搅拌2h后，12000rpm、4℃条件下离心20min，收集沉淀。

按照上述方法进行3个批次的实验，发酵周期、获得的酰化酶的酶活等见表1。

表1 3个批次的实验结果

	发酵周期(h)	放罐体积(L)	糖耗(L)	氨水(ml)	酶活(U/ml)
						批次1	24	10.5	2.43	530	120
批次2	23	10	2.45	510	130
						批次3	24	10.5	2.47	500	115

对比例1

菌种活化

划平板：取原种菌种CH39807在B平板上划线(含氨苄青霉素50μg/ml)，37℃倒置培养过夜；

接试管：从平板上挑单菌至5ml LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/ml)试管中，37℃、200rpm摇床振荡培养过夜；

接摇瓶：试管菌种OD₆₀₀长至3～4，以1％接种量接种到两瓶100ml LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/ml)摇瓶中，37℃、200rpm摇床振荡培养；

保种：约4h后OD₆₀₀长到1.2～1.4，无菌操作将其中一瓶菌液用50ml灭菌离心管3000rpm离心5min，倒掉上清，菌体沉淀用10ml LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/ml)悬溶混匀，1ml菌悬液+0.43ml50％甘油加至冻存管中(甘油终浓度15％)，混匀后编号，置-80℃保藏。

发酵表达

接种：从保藏甘油管中取出菌液以1％接种量接入含有150ml LB培养基(含氨苄青霉素50ug/ml)的摇瓶中，37℃摇床培养；3～4h，待OD₆₀₀长至1.2±0.1，开始移种进罐；

发酵培养基，以水为溶剂，10L包括以下组分：十二水合磷酸氢二钠179g、磷酸二氢钾68g、氯化铵53g、硫酸钠14g、七水合硫酸镁10g、蛋白胨100g、酵母粉50g、甘油100g、消泡剂5mL和三氯化铁0.3g。

消罐：将发酵培养基配制好后倒入发酵罐，121℃灭菌30min；降温后控制温度37℃，通空气通气比为1:2，转速200rpm，稳定20min后标定溶氧为100％；测定培养基pH6.0±0.1(如需调节用氨水调节)；

进罐：将长好的种子液火焰接种进罐，接种量5％，并加入3ml氨苄青霉素(终浓度50mg/L，氨苄青霉素溶液过滤除菌后使用)；

发酵控制：发酵前期发酵罐参数：200rpm，37℃，通气比1:2，不控pH，随OD₆₀₀增长调整搅拌转速及空气流量，溶氧控制在50％以上。pH开始下降时，补氨水将pH调至6.7；待溶氧突变上升，固定此时的转速及通气量分别为500rpm，10L/min)开始补加葡萄糖(30％w/v，115℃灭菌20min)，补料速度与溶氧关联设定控制溶氧值30％；

诱导表达：定时取样检测OD₆₀₀并填写发酵记录，待OD₆₀₀长至50，将温度设定为25℃开始降温，温度降到30℃以下时加入IPTG6ml(终浓度1mmol/L)，开始诱导，并将pH调整为7.0；菌液OD₆₀₀停止增长后结束。

按照上述方法进行3个批次的实验，发酵周期、获得的酰化酶的酶活等见表2。

表2对比例中3个批次的实验结果

	发酵周期(h)	放罐体积(L)	糖耗(L)	氨水(ml)	酶活(U/ml)
						批次1	30	10	2.67	560	100
批次2	30	10.3	2.74	580	105
						批次3	30	10.4	2.96	590	95

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。