阅读说明：本技术 一种柠檬酸发酵尾渣的综合利用工艺 (Comprehensive utilization process of citric acid fermentation tailings ) 是由 高秀珍 马钦元 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于废弃物的资源综合利用领域,具体涉及一种柠檬酸发酵尾渣的综合工艺。首先将柠檬酸发酵尾渣进行蒸汽爆破与离子液体的级联反应,在实现菌体成份充分释放的同时,对菌体几丁质以及玉米纤维素的晶体结构进行充分的破坏,为纤维素酶和几丁质脱乙酰酶的作用提供良好的基础,同时将预处理过程中产生的可溶性糖及蛋白等副产物进行几丁质脱乙酰基酶的发酵生产,实现了一种协同的绿色生产,易于产业化应用。(The invention belongs to the field of comprehensive utilization of waste resources, and particularly relates to a comprehensive process for citric acid fermentation tailings. The method is characterized in that the citric acid fermentation tailings are subjected to steam explosion and ionic liquid cascade reaction, the crystal structures of thallus chitin and corn cellulose are sufficiently destroyed while thallus components are sufficiently released, a good foundation is provided for the effects of cellulase and chitin deacetylase, meanwhile, byproducts such as soluble sugar and protein generated in the pretreatment process are subjected to fermentation production of the chitin deacetylase, and the synergistic green production is realized, and the industrial application is easy.)

一种柠檬酸发酵尾渣的综合利用工艺

技术领域：

本发明属于废弃物的资源综合利用领域，具体涉及一种柠檬酸发酵尾渣的综合工艺。

背景技术：

柠檬酸是目前微生物发酵产量最大的有机酸，广泛应用于饮料、食品、洗涤日化等行业，所用的微生物主要为黑曲霉。柠檬酸发酵后产生大量黑曲霉菌丝渣。据行业统计，每生产一吨柠檬酸，约产生0.15吨干菌丝体。目前，全球柠檬酸产量估计超过每年200万吨，这意味着每年产生约30万吨黑菌。通常，这些尾渣被低值化处理用作反刍动物的饲料。

据报道，黑曲霉菌体细胞干重中约有15％的几丁质。因此,黑曲霉菌丝体是生产几丁质及其衍生物的良好原料，包括壳聚糖、壳寡糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和葡萄糖胺(GlcN)，在生物医药、食品、卫生保健和化妆品行业有着广泛的应用。但目前的主流工艺还是采用化学提取，存在使用强酸、强碱以及环境污染等问题。酶解制备几丁质及其衍生物作为一种生态友好的方法受到越来越多的关注。然而，酶法生产几丁质及其衍生物仍然具有挑战性，其中一个主要原因就是几丁质的结晶性使其不溶于水。因此，开发合理的预处理方法，在几丁质及其衍生物生物转化为壳聚糖前，改善几丁质的结晶结构具有重要意义。

同时，目前大多数工业柠檬酸发酵采用的是粗料发酵，在以玉米为原料的发酵尾渣中除菌丝体外，还含有大量的玉米纤维(每Kg干物质中包括382克纤维素,445克半纤维素、66克木质素,19g蛋白和28g灰分)。所以，为了对菌丝废弃物进行全面的回收利用，应该将菌体和玉米纤维同时进行研究。目前还没有通过合理的预处理方式对柠檬酸发酵尾渣中残留的纤维、蛋白质和菌丝体进行综合利用的报道，这也是当前环境保护形势下亟待探讨和解决的问题。

本发明开发了一种汽爆与离子液体级联预处理柠檬酸发酵尾渣并对其不同成份进行综合利用的工艺，为综合利用柠檬酸发酵工业尾渣提供了可能的途径。

发明内容

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针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种高效的柠檬酸发酵尾渣综合处理技术及其应用，首先将柠檬酸发酵尾渣进行蒸汽***与离子液体的级联反应，在实现菌体成份充分释放的同时，对菌体几丁质以及玉米纤维素的晶体结构进行充分的破坏，为纤维素酶和几丁质脱乙酰酶的作用提供良好的基础，同时将预处理过程中产生的可溶性糖及蛋白等副产物进行几丁质脱乙酰基酶的发酵生产，实现了一种协同的绿色生产，易于产业化应用。

所述柠檬酸发酵尾渣的综合利用方法是针对以玉米为原料、黑曲霉为发酵菌种的柠檬酸发酵尾渣，步骤如下：

(1)将柠檬酸发酵尾渣进行气爆处理，获得可溶性部分和固体残留部分，其中，固体残留部分进行离子液体预处理；

(2)将离子液体处理后的物料烘干，采用纤维素酶酶解，酶解后的可溶性部分待用，固体残留物使用几丁质脱乙酰酶进行酶解，生产部分脱乙酰的壳聚糖前体物，为后续进一步脱乙酰制备高脱乙酰度的壳聚糖以及壳寡糖提供基础；

(3)气爆后和纤维素酶酶解后的可溶性部分用于几丁质脱乙酰酶的发酵生产，生产所得的几丁质脱乙酰酶再次用于步骤(2)中的酶解，以此实现几丁质脱乙酰酶的循环生产和利用；

进一步地，所述气爆预处理的条件为：柠檬酸发酵尾渣水分含量25-40％，汽爆压力为2.0-2.5MPa，时间为60-90s；

进一步地，所述离子液体预处理的条件为：汽爆预处理后的固体剩余物烘干至水分含量10-12％，离子液体处理温度为60-80℃，处理时间6-24h，离子液体添加量为10-20mL每5g烘干物料；

更进一步地，所述离子液体为四丁基氢氧化铵，离子液体浓度为20-25％水溶液；

进一步地，所述纤维素酶酶解条件为：物料烘干至水分10-12％，物料浓度调节至80-140g/L，酶解温度40-60℃，酶解时间20-32h，酶解pH4.0-5.8，纤维素酶添加量20-35U/g(烘干底物)；

进一步地，所述几丁质脱乙酰酶酶解条件：经过纤维素酶解后的固体残留烘干至水分10-12％，调节物料浓度20-50g/L，酶解温度25-37℃，酶解时间6-12h，酶解pH5.5-7.5，几丁质脱乙酰酶的添加量3000-3700U/g(烘干底物)。

进一步地，将汽爆处理后进固液分离获得的液体剩余物，以及经纤维素酶解后经固液分离获得的液体剩余物合并，烘干至含水量10-12％用作几丁质脱乙酰酶生产的发酵基质(后简称“副产物”)；

更进一步地，几丁质脱乙酰酶的发酵生产条件为：接种量2-10％，搅拌转速为160-200rpm，温度为30-40℃，发酵12-30h；

优选地，发酵菌种为红球菌、酵母菌、大肠杆菌、被孢霉属或炭疽菌；

更优选地，所述发酵菌种为马红球菌CGMCC NO.14861；

更进一步地，发酵培养基组成为：酵母浸粉5-10g/L，副产物0.5-2.0g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，pH6.0-7.0。

在上述处理过程中，汽爆后柠檬酸发酵尾渣可溶性成份释放率提高15-30％；纤维素酶酶解后可溶性糖含量达到0.4-0.53g/g；几丁质脱乙酰酶酶解后几丁质脱乙酰酶脱乙酰生成的乙酸含量达到480-554mg/L；发酵24h后，发酵液中的几丁质脱乙酰基酶含量达到4854.7U/mL。

有益效果：

本发明提供的柠檬酸发酵尾渣的级联预处理及综合利用技术，能够实现对柠檬酸发酵尾渣中各种成份的高效释放，为后续的酶解提供更加合适的底物。通过预处理条件及后续酶解条件的优化，汽爆后柠檬酸尾渣可溶性成份释放率提高30.2％，纤维素酶解后可溶性糖含量达到0.53g/g，纤维素酶解效率提高26.97％，几丁质脱乙酰酶从对未经预处理底物的无活性表现出了较高的活性，脱乙酰释放的乙酸含量达到554.48mg/L，同时预处理及酶解过程中产生的副产物应用于几丁质脱乙酰酶的发酵生产，发酵产酶提高1.5倍，达到4854.7U/mL。相比现有技术，利用本发明提供的级联预处理工艺，可实现柠檬酸发酵尾渣的高效预处理，实现几丁质脱乙酰酶及几丁质衍生物的协同生产，为柠檬酸发酵尾渣的资源综合利用提供了良好的借鉴，具有广泛的工业应用前景。

附图说明：

图1级联预处理工艺及综合利用全流程图；

图2不同汽爆条件预处理柠檬酸发酵尾渣的效果表征图

其中，A:颜色变化；B：扫描电镜图片；C：孔隙率变化；D：可溶性成份变化；

图3不同级联预处理柠檬酸发酵尾渣的扫描电镜图；

其中，A:放大2000倍；B：放大10000倍；

图4几丁质脱乙酰酶的发酵生产曲线。

具体实施方式

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为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明工艺流程如图1所示，以下将结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明。

实施例1汽爆预处理

将以玉米为原料、黑曲霉为发酵菌种的柠檬酸发酵尾渣水分调节至含量30％，汽爆压力为1.0、1.5、2.0、2.5MPa，时间为60s，汽爆前后的物料采用扫描电镜、孔径分布仪进行表征，同时检测可溶性成份的释放比例。

结果如图2所示，由图2-A可以看出随着汽爆压力的增加，物料颜色逐渐加深；由图2-B可以看出随着汽爆压力的增加，物料小颗粒的比例明显增加；由图2-C可以看出物料在平均孔径2-10nm处的孔面积差异明显增大；由图2-D可以看出汽爆压力的增加与柠檬酸菌体可溶性成份的释放也是正相关；这些变化都表明汽爆预处理对柠檬酸发酵渣的膨胀和破碎起到了积极的作用。

实施例2离子液体级联预处理

将实施例1经汽爆预处理后的柠檬酸发酵尾渣的固体残留部分水分烘干至含量10％，经离子液体四丁基氢氧化铵处理，离子液体浓度为20％水溶液，离子液体处理温度为80℃，处理时间6h，离子液体添加量为10mL每5g物料，级联预处理前后的物料采用扫描电镜进行进一步表征，结果如图3所示，经过离子液体的级联预处理后，物料表面的紧密结构变得更加疏松。

实施例3级联预处理后物料的纤维素酶处理

将实施例2中经2.5MPa汽爆和离子液体级联处理后的物料烘干至水分含量10％，调节物料浓度120g/L，采用纤维素酶进行酶解，酶解温度60℃，酶解时间30h，酶解pH5.0，纤维素酶添加量20U/g。采用液相色谱检测可溶性糖含量的变化，级联预处理后经纤维素酶解后的总糖达到64.49g/L(0.53g/g(烘干底物))。

同时，分别将未经预处理的空白样品、仅经实施例1中2.5MPa汽爆预处理的样品、仅经实施例2同等条件离子液体预处理的样品作为对照，采用上述方法进行酶解后测定可溶性糖含量的变化，结果如表1，单独的汽爆预处理和离子液体预处理均能对纤维素酶酶解起到促进作用，级联反应的酶促效果最好，与未处理的效果相比，纤维素酶酶促效果提高了26.97％。

表1：级联预处理后纤维素酶解效果表

实施例4预处理后物料的几丁质脱乙酰酶处理

将实施例3中经级联预处理和纤维素酶酶解后获得的固体残留离心洗涤，然后烘干至水分含量10％，调节物料浓度40g/L，使用几丁质脱乙酰酶进行酶解，酶解温度30℃，酶解时间6h，酶解pH7.0，几丁质脱乙酰酶的添加量3200U/mL，采用液相色谱检测脱乙酰生成乙酸含量的变化，预处理后经几丁质脱乙酰酶解后释放的乙酸含量达到554.48mg/L。

同时，分别将未经预处理的空白样品、仅经实施例1中2.5MPa汽爆预处理的样品、仅经实施例2同等条件离子液体预处理的样品作为对照，采用实施例3的纤维素酶解方法，和本实施例的几丁质脱乙酰酶酶解方法后测定乙酸含量的变化，结果如表2，几丁质脱乙酰酶对未经预处理的菌体几丁质以及单独离子液体预处理的菌体几丁质均无活性，汽爆预处理对几丁质脱乙酰酶的作用起到了明显的促进效果，汽爆与离子液体的级联预处理后，几丁质脱乙酰酶的作用效果得到了进一步的提高，提高了29.07％。

表2：预处理后几丁质脱乙酰酶的酶解效果表

实施例5级联预处理及纤维素酶解过程中产生的副产物的利用

收集上述实施例汽爆过程中产生的可溶性成份与纤维素酶解过程中产生的可溶性糖(分别离心去除不溶物后混合)烘干至水分10％(以下简称“副产物”)，用于几丁质脱乙酰酶的发酵生产。

发酵条件为：采用马红球菌CGMCC NO.14861，接种量10％，搅拌转速为200rpm，温度为37℃，进行发酵。

发酵培养基：酵母浸粉8g/L，副产物添加量2.0g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠2.0g/L，pH6.8。

发酵30h时达到最大酶活，经测定为4854.7U/mL。

发酵曲线如图4所示，以未添加副产物的发酵培养基作为空白，与空白对照相比，两者均在发酵30h达到最大产酶，随后进入产酶稳定期，但发酵产酶与空白相比提高了61.82％。

实施例6一种柠檬酸发酵尾渣的综合利用

(1)将以玉米为原料、黑曲霉为发酵菌种的柠檬酸发酵尾渣调节至含水量25％，汽爆压力为2.0MPa，时间为70s；

(2)气爆后获得可溶性部分和固体残留部分，其中，固体残留部分进行离子液体预处理：将汽爆预处理后的固体剩余物烘干至水分含量10％，离子液体处理温度为60℃，处理时间10h，离子液体添加量为15mL每5g烘干物料；

所述离子液体为四丁基氢氧化铵，离子液体浓度为22％水溶液；

(3)将离子液体处理后的物料烘干，采用纤维素酶酶解，酶解条件为：物料烘干至水分12％，物料浓度调节至80g/L，酶解温度40℃，酶解时间20h，酶解pH4.0，纤维素酶添加量25U/g(烘干底物)；

(4)酶解后的可溶性部分待用，固体残留物使用几丁质脱乙酰酶进行酶解，酶解条件为：经过纤维素酶解后的固体残留烘干至水分10％，调节物料浓度20g/L，酶解温度25℃，酶解时间8h，酶解pH5.5，几丁质脱乙酰酶的添加量3000U/g(烘干底物)；

(5)气爆后和纤维素酶酶解后的可溶性部分用于几丁质脱乙酰酶的发酵生产：汽爆处理后进固液分离获得的液体剩余物，以及经纤维素酶解后经固液分离获得的液体剩余物合并，烘干至含水量10％用作几丁质脱乙酰酶生产的发酵基质(后简称“副产物”)；

几丁质脱乙酰酶的发酵生产条件为：接种量5％，搅拌转速为160rpm，温度为30℃，发酵24h；

发酵菌种为红球菌CGMCC NO.14861；

发酵培养基组成为：酵母浸粉5g/L，副产物0.5g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠0.5g/L，pH6.0。

在上述处理过程中，汽爆后柠檬酸发酵尾渣可溶性成份释放率提高18.5％；纤维素酶酶解后可溶性糖含量达到0.48g/g；几丁质脱乙酰酶酶解后几丁质脱乙酰酶脱乙酰生成的乙酸含量达到496mg/L；发酵24h后，发酵液中的几丁质脱乙酰基酶含量达到3947.3U/mL。

实施例7一种柠檬酸发酵尾渣的综合利用

(1)将以玉米为原料、黑曲霉为发酵菌种的柠檬酸发酵尾渣调节至含水量40％，汽爆压力为2.5MPa，时间为90s；

(2)气爆后获得可溶性部分和固体残留部分，其中，固体残留部分进行离子液体预处理：汽爆预处理后的固体剩余物烘干至水分含量12％，离子液体处理温度为80℃，处理时间24h，离子液体添加量为20mL每5g烘干物料；

所述离子液体为四丁基氢氧化铵，离子液体浓度为25％水溶液；

(3)将离子液体处理后的物料烘干，采用纤维素酶酶解，酶解条件为：物料烘干至水分12％，物料浓度调节至140g/L，酶解温度60℃，酶解时间32h，酶解pH5.8，纤维素酶添加量35U/g(烘干底物)；

(4)酶解后的可溶性部分待用，固体残留物使用几丁质脱乙酰酶进行酶解，酶解条件为：经过纤维素酶解后的固体残留烘干至水分12％，调节物料浓度50g/L，酶解温度37℃，酶解时间12h，酶解pH7.5，几丁质脱乙酰酶的添加量3700U/g(烘干底物)；

(5)气爆后和纤维素酶酶解后的可溶性部分用于几丁质脱乙酰酶的发酵生产：汽爆处理后进固液分离获得的液体剩余物，以及经纤维素酶解后经固液分离获得的液体剩余物合并，烘干至含水量12％用作几丁质脱乙酰酶生产的发酵基质(后简称“副产物”)；

几丁质脱乙酰酶的发酵生产条件为：接种量8％，搅拌转速为200rpm，温度为40℃，发酵30h；

发酵菌种为炭疽菌CF-6；

发酵培养基组成为：酵母浸粉10g/L，副产物添加量2.0g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠2.0g/L，pH7.0。

在上述处理过程中，汽爆后柠檬酸发酵尾渣可溶性成份释放率提高27.2％；纤维素酶酶解后可溶性糖含量达到0.51g/g；几丁质脱乙酰酶酶解后几丁质脱乙酰酶脱乙酰生成的乙酸含量达到531mg/L；发酵30h后，发酵液中的几丁质脱乙酰基酶含量达到4657.3U/mL。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。