一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其制备方法和应用 (Ethyl carbamate hydrolase mutant and preparation method and application thereof ) 是由 杨丽娟 张献 冯志平 张耀 刘君 赵金松 袁思棋 刘训 罗惠波 于 2021-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其制备方法和应用,属于基因工程和酶工程技术领域,本发明通过分析野生型氨基甲酸乙酯水解酶的氨基酸序列及建模后三维结构,将其194位的天冬酰胺突变为缬氨酸,得到稳定性提高的氨基甲酸乙酯水解酶突变体。本发明中氨基甲酸乙酯水解酶突变体N194V最适温度为45℃(野生型为40℃),且在40℃下的半衰期由野生型的32.09min提高到了210.04min,突变体N194V在35℃以上都比野生型有更好的耐受性。同时突变体N194V对于pH稳定性及乙醇的耐受性也有所提高。氨基甲酸乙酯水解酶突变体能更好的应用于降解食品及酒精饮料中的氨基甲酸乙酯。(The invention discloses an ethyl carbamate hydrolase mutant and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of genetic engineering and enzyme engineering. The optimum temperature of the ethyl carbamate hydrolase mutant N194V is 45 ℃ (40 ℃ for wild type), the half-life period at 40 ℃ is improved from 32.09min of the wild type to 210.04min, and the mutant N194V has better tolerance than the wild type at the temperature of more than 35 ℃. Meanwhile, the mutant N194V has improved pH stability and ethanol tolerance. The ethyl carbamate hydrolase mutant can be better applied to degrading ethyl carbamate in food and alcoholic beverages.)
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，具体涉及到一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)，存在于多种发酵食品和酒精饮料中，是一种具有致癌性的物质。2007年，EC被国际癌症研究机构IARC(the International Agencyfor Research on Cancer)归类为2A类致癌物质。目前消除EC主要方法有发酵工艺优化、物理吸附、代谢工程改造以及生物酶法，其中生物酶法被认为是最理想的方法。
氨基甲酸乙酯水解酶(Urethanase,UH)能够水解EC生成乙醇、二氧化碳和氨，而具有潜在的应用价值。由于酶在工业中应用需要较好的稳定性，而本发明前期对纯化到的氨基甲酸乙酯水解酶的酶学性质表明，其在40℃以上或者在pH为5的条件下时，稳定性较差。因此，对氨基甲酸乙酯水解酶进行稳定性的定点改造，以得到一种稳定性提高的氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其制备方法和应用也就显得十分有意义。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的是提供一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其制备方法和应用，可有效解决现有氨基甲酸乙酯水解酶的稳定性差的问题。针对来源于假丝酵母Candida parapsilosis(中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC AY 2017001)的氨基甲酸乙酯水解酶进行分析，野生型氨基甲酸乙酯水解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，在此基础上，将194位的天冬酰胺突变为缬氨酸，得到稳定性提高的氨基甲酸乙酯水解酶突变体。
为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
本发明提供一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体，相对于具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的氨基甲酸乙酯水解酶亲本，将第194位的天冬酰胺突变为缬氨酸。
本发明还提供上述氨基甲酸乙酯水解酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：设计定点突变引物，以携带氨基甲酸乙酯水解酶编码基因的载体为模板进行全质粒扩增，获得含突变氨基甲酸乙酯水解酶的重组质粒；
步骤(2)：将步骤(1)所得的重组质粒经DpnⅠ酶处理后，转入E.coli BL21(DE3)，诱导表达，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶突变体。
本发明还提供上述氨基甲酸乙酯水解酶突变体在降解食品和/或发酵饮料酒中氨基甲酸乙酯的应用。
一种耐酸的发酵制剂，采用上述氨基甲酸乙酯水解酶突变体作为主要成分。
需要说明的是，本发明提供的耐酸的发酵制剂是指工作环境pH低至5。
一种耐乙醇的发酵制剂，采用上述氨基甲酸乙酯水解酶突变体作为主要成分。
需要说明的是，本发明提供的耐酸的发酵制剂是指工作环境乙醇浓度高达15wt％。
一种耐热的发酵制剂，采用上述氨基甲酸乙酯水解酶突变体作为主要成分。
需要说明的是，本发明提供的耐热的发酵制剂是指最适工作环境温度为45℃。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明提供的氨基甲酸乙酯水解酶突变体稳定性得到提高，突变体N194V最适温度为45℃(野生型为40℃)，且在40℃下的半衰期由野生型的32.09min提高到了210.04min，突变体N194V在35℃以上都比野生型有更好的耐受性。同时突变体N194V对于pH稳定性及乙醇的耐受性也有所提高。氨基甲酸乙酯水解酶突变体能更好的应用于降解食品及酒精饮料中的氨基甲酸乙酯。
附图说明
图1：亲和层析Ni-NTA柱纯化得到纯酶SDS-PAGE电泳图，M：Protein Marker；1：野生型WT；2：突变型N194V。
图2：突变前后最适温度的比较。
图3：突变前后温度对野生酶和突变酶热稳定性的影响。
图4：突变前后最适pH的比较。
图5：突变前后pH对野生酶和突变酶耐酸性的影响。
图6：突变前后乙醇对野生酶和突变酶的乙醇耐受性影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本例进行氨基甲酸乙酯水解酶基因的定点突变及表达。通过对氨基甲酸乙酯水解酶的序列及结构进行分析，选择对第194位的氨基酸进行突变，使用PrimerX在线设计突变引物(表1，其中N194-R、N194-F和N194V-F的序列分别记为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQID No.5)。以重组质粒pET-28a-cpUH为模板，使用全质粒PCR扩增技术进行定点突变。将扩增后的重组质粒使用DpnⅠ酶处理(37℃的条件下作用1h)，转化到E.coli DH5α感受态中，得到阳性转化子，提取质粒送至北京擎科生物科技有限公司(成都)测序验证。将正确突变质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，过夜培养并活化E.coli BL21/pET-28a-cpUH及E.coliBL21/pET-28a-cpUH(N194V)，以2％的接种量把种子液接到新鲜的LB培养基中，于37℃、180r/min的条件下培养至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG，于25℃诱导培养8h。
在4℃、7000r/min下收集培养好的重组菌E.coli BL21/pET-28a-cpUH及E.coliBL21/pET-28a-cpUH(N194V)菌液。用20mmol/L PBS(pH 7.4)洗涤菌体2次后，重悬菌体并置于冰浴中进行超声破碎。将破碎后的菌液于4℃、7000r/min条件下离心30min，收集上清液(即野生酶及突变体N194V的粗酶液)。纯化前先用镍柱平衡缓冲液(含250mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑的20mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液)进行镍柱的平衡，然后使用洗脱缓冲液(含有250mmol/LNaCl，100mmol/L咪唑的20mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液)进行蛋白质的洗脱。然后将纯化后的蛋白样品(野生酶及突变酶N194V)进行SDS-PAGE电泳检测，其中SDS-PAGE使用5％的浓缩胶和10％的分离胶，用考马斯亮蓝R250染色(如图1所示)；其中，氨基甲酸乙酯水解酶突变体的序列记为SEQ ID No.2。
表1氨基甲酸乙酯水解酶突变引物序列(N194V)
实施例2
本例进行酶活测定。具体过程为：准确吸取200μL酶液(对照为PBS溶液)于比色管中，加入800μL 3％的EC溶液，40℃水浴15min后加终止剂(10％三氯乙酸)1mL混匀终止反应。然后加入显色剂Ⅰ(15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠，超纯水定容至250mL)1mL混匀，再加显色剂Ⅱ(13.125g NaOH和7.5mL NaClO溶液，超纯水定容至250mL)1mL混匀，40℃水浴保温20min，最后用超纯水定容至10mL，在625nm下，测定吸光度并计算酶活。酶活定义：每分钟分解底物EC产生1μmol NH4 +所需酶量为1个酶活力单位(U)。
实施例3
本例进行突变酶(N194V，即氨基甲酸乙酯水解酶突变体)的耐热性及半衰期分析。具体过程为：将纯化后的野生酶及突变酶(N194V)分别在25、30、35、40、45、50、55℃的温度下反应，测定最适的反应温度。突变酶的最适温度由40℃(野生酶)提高到了45℃(图2)。将纯化后的两种酶液在上述不同温度下保存30min，测定相应的酶活，以酶在各温度的初始酶活为100％，计算相对酶活。突变酶(N194V)在35℃以上比野生酶的稳定性好，且在35～40℃保温30min后相对于初始酶活未发生较大变化，而野生酶在40℃保温30min后酶活降到了初始酶活的50％左右(图3)。
将纯化后的野生酶及其突变酶(N194V)置于40℃保温，每隔10min取样测定酶活。由公式lnCt＝lnC0+kt，t1/2＝ln2/k计算出酶的半衰期，其中C0为初始酶活，Ct为时间t时所对应的酶活。突变酶(N194V)在40℃下的半衰期为210.04min，是野生酶(32.09min)的6.54倍(表2)。可见突变酶(N194V)相对于野生酶在耐热性上有很大程度的提高。
表2野生酶及突变酶(N1694V)在40℃下的半衰期
实施例4
本例进行突变酶(N194V)的耐酸性分析。具体过程为：将纯化后的野生酶及突变酶(N194V)与底物EC在不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10)的缓冲液中进行反应，反应结束后测定两种酶在不同pH条件下的酶活，以确定最适反应pH。突变酶(N194V)的最适pH由8(野生酶)下降到7，且在弱酸性(pH＝5、6)的条件下，突变酶(N194V)的酶活力相比较于野生酶有所提高(图4)。将纯化后的酶液保存在不同pH(5、6、7、8、9)缓冲液中，在4℃冰箱中放置4h，以各pH的初始酶活为100％，计算对应pH的相对酶活。结果突变酶(N194V)在各pH下的耐受性均高于野生酶，且都在95％以上(图5)。
因此，突变酶N194V相比较于野生酶耐酸性也有所提高。
实施例5
本例进行突变酶的乙醇耐受性分析。具体过程为：将纯化后的野生酶及突变酶(N194V)添加到不同浓度的乙醇溶液中，37℃保温1h后测定其残余酶活力，以未经乙醇处理的酶所测定的酶活力为100％。突变酶N194V对于乙醇的耐受性得到了提高，在乙醇浓度为15wt％时，保留了90％以上的酶活；当乙醇浓度达到20wt％，仍然保留了18.82％的酶活，相对比与野生酶残留酶活4.67％，提高了14.15％(图6)。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。
序列表
<110> 四川轻化工大学
<120> 一种氨基甲酸乙酯水解酶突变体及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 551
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Leu Thr Asp Asn Trp Lys Glu Leu Ala Gly Lys Ala Gln Ser Thr
1 5 10 15
Phe Gln Lys Ser Leu Lys Gln Ala Ile Glu Leu Ala Asp Phe Asp Glu
20 25 30
Gly Leu Ala Lys Arg Tyr Gly Ala Leu Pro Ser Ala Ile Gly Ala Asn
35 40 45
Val Glu Asp Phe Gly Ser Pro Ala Gln Phe Pro Leu Glu Glu Tyr Leu
50 55 60
Lys Ala Leu Pro Lys Lys Val Leu Asp Ile Thr Glu Lys Asp Pro Val
65 70 75 80
Glu Leu Leu Lys Asp Leu Lys Ser Arg Lys Val Thr Cys Val Glu Val
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Leu Lys Ala Tyr Thr Ala Ala Ser Ile Val Ala Ser Lys Leu Thr Asn
100 105 110
Cys Val Gln Glu Phe Leu Pro Ile Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Gln Lys
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Leu Asp Ala Asp Tyr Glu Thr Lys Lys His Leu Pro Leu Tyr Gly Leu
130 135 140
Pro Phe Ser Ile Lys Glu Met Ile Pro Phe Val Gly Arg Ser Val Thr
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Leu Gly Ser Asp Ile Gly Gly Ser Ile Arg Cys Pro Ala Ala Phe Asn
245 250 255
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275 280 285
Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asp Thr Val Asn Leu Val Met Lys Thr Val
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325 330 335
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355 360 365
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ccttttgtta gaaccactaa tccacaatca ttgatgatgc 40
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ccttttgtta gaaccactgt tccacaatca ttgatgatgc 40
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