阅读说明：本技术 一种检测银离子的方法 (Method for detecting silver ions ) 是由 王卫 李欣 钟华 接贵芬 万均 罗细亮 于 2018-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料用于Ag<Sup>+</Sup>检测的方法,该方法可用于食品、环境、医药卫生等领域。本发明利用具有中空、多孔结构的纳米金与可识别Ag<Sup>+</Sup>的生物分子相结合,构建具有“孔帽”的纳米复合材料。当含银离子的样品溶液加入后,银离子因与纳米载体表面的生物分子作用使得生物分子脱离纳米载体表面,纳米载体内的染料分子得以释放,分离后,上清液在一定波长的激发光照射下产生荧光发射,根据荧光发射信号的强弱实现对银离子的检测。同时,为了提高灵敏度,本发明利用核酸外切酶实现了荧光信号的循环放大。本发明方法简单、高效,灵敏,选择性好,方便快捷,成本低廉,应用范围广泛。(The invention provides a nano-gold composite material for Ag based on exonuclease cyclic amplification technology and base mismatch identification technology + The detection method can be used in the fields of food, environment, medicine, health and the like. The invention utilizes nano gold with hollow and porous structure and identifiable Ag + The biological molecules are combined to construct the nano composite material with the pore cap. After the sample solution containing silver ions is added, the silver ions and the biomolecules on the surface of the nano carrier act to enable the biomolecules to be separated from the surface of the nano carrier, dye molecules in the nano carrier are released, after separation, supernatant liquid generates fluorescence emission under the irradiation of exciting light with a certain wavelength, and the detection of the silver ions is realized according to the strength of fluorescence emission signals. Meanwhile, in order to improve the sensitivity, the invention realizes the circular amplification of the fluorescence signal by using exonuclease. The method of the invention has the advantages of simplicity, high efficiency, sensitivity, good selectivity, convenience, rapidness and low cost,the application range is wide.)

一种检测银离子的方法

技术领域

本发明涉及一种检测Ag⁺的方法，具体涉及一种基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的Ag⁺的检测方法。

背景技术

作为重金属离子的银离子(Ag⁺)与汞离子(Hg²⁺)类似，是一种具有较高毒性的金属离子，也是一种广泛分布的环境污染物。即使在低浓度下，也会对环境和人类造成严重且永久性的毒害。更为严重的是，通过被污染的水源，Ag⁺可以在农产品和水产品中不断累积后进入人类的食物链。如果长时间暴露于Ag⁺存在的环境中，可能会导致人类在身体和神经系统方面的退行性疾病的缓慢发生。因此，建立高效、灵敏、经济的Ag⁺的检测方法在环境监测、食品安全和临床诊断等领域具有非常重要的意义。

目前，用于Ag⁺检测的传统方法主要包括等离子体质谱法(ICP-AES)、原子吸收/发射光谱法和极谱法等方法。但是，这些方法常常需要繁杂的操作、耗时的分析和昂贵、复杂的设备等，使它们在资源有限的环境中无法使用，另外，这些方法在检测灵敏度和选择性方面也有待改进。要克服这些缺点，迫切需要开发出既简单、灵敏、又经济、高效的测定方法来满足生物、医药、环境等领域对Ag⁺的检测需求。

由于金属离子可以与碱基对形成配位键，可以代替常规的Watson-Crick碱基对中的氢键形成金属-碱基对，这种作用对于金属离子快速、高效的检测具有重要意义，因此受到广泛关注。其中，胞嘧啶(C)可与Ag⁺形成C-Ag⁺-C碱基对，这种结合很稳定，可以利用这种特殊结构的生成实现对Ag⁺的检测。而且，由于C-C碱基错配只识别Ag⁺而形成Ag⁺侨联的碱基对，使得Ag⁺的检测具有非常高的特异性和选择性。本发明根据Ag⁺的这一反应特性，将其与富含胞嘧啶的核酸生物分子相结合，巧妙地应用到具有中空、多孔结构的纳米材料领域，同时，为了提高检测灵敏度，在碱基错配识别技术的基础上，又结合了生物酶的剪切作用，为Ag⁺的高灵敏检测提供了新型、特异、高效的检测技术。采用具有中空、多孔结构的纳米金作为纳米载体，利用C-C碱基错配对Ag⁺特有的生物识别作用构建纳米复合材料检测Ag⁺的技术还未见文献报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，针对基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料检测Ag⁺的技术未见报道，因此，本发明的第一目的：提出并构建一种新型的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料，具体是利用中空、多孔的纳米金作为纳米载体，设计并合成可被Ag⁺识别的生物分子，并将其组装到纳米载体表面，一方面作为“孔帽”用于封堵纳米载体的孔口，防止孔内物质的外泄；另一方面作为Ag⁺的识别探针可与Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应，形成C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米胶囊表面，从而使封堵的“孔帽”被打开，纳米胶囊内的染料分子得以释放，分离上清液，在一定波长的激发光照射下产生荧光发射，根据荧光发射信号的强弱实现对Ag⁺的检测。同时，为了进一步增大灵敏度，在碱基错配识别的基础上，本发明又利用外切酶的剪切作用实现了荧光信号的循环放大。

由于核酸外切酶可对具有双链结构的生物分子-Ag⁺结合物进行剪切，剪切后，Ag⁺被释放，这些Ag⁺能够再次与其他识别探针发生识别反应，然后再次被剪切……，结果使Ag⁺得到循环利用，打开更多的“孔帽”，释放出更多的孔内物质。正是由于剪切酶的作用，Ag⁺被循环利用，使检测灵敏度得到显著增强。这种基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的检测体系能够对痕量的Ag⁺样品实现高灵敏、高选择性的检测。即便样品中含有极微量的Ag⁺，也能够获得令人满意的检测结果；本发明的第二目的：提供一种检测痕量Ag⁺的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料的制备方法；本发明的第三目的：提供一种检测痕量Ag⁺的方法。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明提出的检测Ag⁺的纳米金复合材料是以中空、多孔结构的纳米金作为纳米载体，利用其中空、多孔的结构特性，在其内部装载客体分子如荧光染料，优选采用地荧光染料是罗丹明B。为了防止荧光染料的外泄，本发明设计并合成可被Ag⁺识别的生物分子，并将其组装到纳米载体表面形成“孔帽”用于封堵孔口，起到防止孔内物质外泄的作用；其中，所述的可被Ag⁺识别的生物分子是经过特别设计并合成的、具有一定碱基长度的、富含胞嘧啶的核酸生物分子，其碱基序列为5’-TCCTCC CTC CTTAAG GAACCA CCCACC A-3’，该生物分子作为Ag⁺的识别探针被组装到中空、多孔结构的纳米金表面后形成“孔帽”，而“孔帽”的组装则是通过在纳米载体表面预先修饰正电荷修饰剂的方法而实现的，优选采用地正电荷修饰剂是聚二烯丙基二甲基氯化铵。为了打开更多的“孔帽”，释放出更多的荧光染料，本发明所设计并合成的可被Ag⁺识别的生物分子与Ag⁺结合后的产物可被核酸外切酶作用，即本发明利用核酸外切酶对具有双链结构的生物分子-Ag⁺结合物进行剪切，将Ag⁺从错配的碱基对C-Ag⁺-C中释放出来，循环回到溶液中，并与其他Ag⁺识别探针结合，从而释放出更多的罗丹明B，实现荧光信号的循环放大，优选采用地核酸外切酶是外切酶ExoⅢ。

一种制备本发明提出的检测痕量Ag⁺的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计并合成可与Ag⁺通过碱基错配识别的、具有一定碱基长度的、富含胞嘧啶的核酸生物分子，该核酸生物分子能够与Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应，并且，它和银离子的结合产物能够被核酸外切酶剪切；

(2)将磁珠与具有中空、多孔结构的纳米金载体溶液混合，加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，10-12h后磁分离，用MOPS缓冲溶液清洗；

(3)加入染料分子溶液，10-12h后加入可识别Ag⁺的生物分子溶液，10-12h后磁分离，用MOPS缓冲溶液清洗；

其中，所述的可识别Ag⁺的生物分子，其碱基序列为5’-TCC TCC CTC CTTAAG GAACCACCCACCA-3’，它和Ag⁺的结合产物能够被核酸外切酶剪切，释放出Ag⁺。

本发明的有益效果：本发明提出的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料是将可识别Ag⁺的生物分子与具有中空、多孔结构的纳米金材料相结合，通过设计并合成可被Ag⁺识别的生物分子，并将其组装到纳米载体表面形成“孔帽”，利用可识别Ag⁺的生物分子与Ag⁺发生的碱基错配识别反应，形成C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米载体表面，从而使封堵的“孔帽”被打开，纳米载体内的染料分子得以释放，为了进一步增大灵敏度，本发明又利用核酸外切酶对具有双链结构的生物分子-Ag⁺结合物的剪切作用实现了荧光信号的循环放大与检测。

该方法使Ag⁺的检测灵敏度得到显著提高，可实现对Ag⁺高灵敏、高选择性的检测。本发明提出的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料具有结构简单、易合成、性能优异、稳定、经济、高效、灵敏等优点，并且不会受到其它常见干扰物质如Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺等金属离子的影响，具有高的特异性和选择性。实验结果表明，相比于其它常见的技术方法，本发明提出的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料显示出高灵敏度和优异的选择性，在1.0×10^-13～8.0×10^{- 11}mol/L浓度范围内，检测Ag⁺浓度的对数与荧光信号强度呈现良好的线性关系，检测限低至1.0×10^-13mol/L。与文献值相比，本发明对Ag⁺的检测灵敏度提高近100倍。可以预见，本发明提出的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料及其制备方法和检测技术具有巨大的医学应用潜力和广阔的应用前景，将在重大疾病的早期诊断与治疗、食品、生物医药、医学、环境等诸多领域发挥重要的作用。

附图说明

图1.Ag⁺浓度的对数与荧光信号强度的线性关系图。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实验仪器：THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；F-4600荧光分光光度计(日立，日本)；磁性分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心)。

实验试剂：核酸外切酶ExoШ(Thermo Scientific，美国)；聚二烯基丙二甲基氯化铵(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；3-4μm巯基磁珠(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；罗丹明B(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；可被Ag⁺识别的生物分子是经过特别设计并合成的、具有一定碱基长度的富含胞嘧啶的核酸生物分子，其碱基序列为5’-TCC TCCCTC CTTAAG GAACCACCCACCA-3’(上海生工生物工程股份有限公司)，MOPS缓冲溶液为0.01M(pH 7.0,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

实施例1：

一种制备本发明提出的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料的方法，包括如下步骤：

(1)设计并合成可与Ag⁺通过碱基错配识别的、具有一定碱基长度的、富含胞嘧啶的核酸生物分子，该核酸生物分子能够与Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应，并且，它和银离子的结合产物能够被核酸外切酶剪切；

(2)用MOPS缓冲溶液清洗巯基磁珠(20μL)，然后将其与具有中空、多孔结构的纳米金载体溶液(400μL)混合，加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液(200μL，11.664mg/mL)，37℃10h后磁分离，用MOPS缓冲溶液清洗；

(3)加入罗丹明B溶液(2μL，终浓度1.0×10^-4mol/L)，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液稀释至100μL，37℃10h后加入可识别Ag⁺的生物分子溶液(10μL，终浓度1.0×10^-6mol/L)，37℃10h后磁分离，用MOPS缓冲溶液清洗；

其中，所述的可识别Ag⁺的核酸生物分子，其碱基序列为5’-TCC TCC CTC CTTAAGGAACCACCCACC A-3’，它和Ag⁺的结合产物能够被核酸外切酶ExoⅢ剪切，释放出Ag⁺；所述的具有中空、多孔结构的纳米金材料按文献方法获得(W.Wang,C.Chen,X.X.Li,S.Y.WangandX.L.Luo.Chem.Commun.,2015,51,9109–9112.)。

实施例2:

一种采用本发明提出的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料检测Ag⁺的方法如下：

(1)将10μL含有Ag⁺的待测样品溶液加入到本发明提出的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料中，用MOPS缓冲溶液(pH＝7.0)稀释至100μL，加入核酸外切酶ExoⅢ(20U)，37℃恒温振荡2h，位于中空、多孔结构的纳米金载体表面的可识别Ag⁺的生物分子与Ag⁺发生特异性的识别反应，形成C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米载体表面，从而使封堵的“孔帽”被打开，纳米载体内的染料分子罗丹明B得以释放；与此同时，由于核酸外切酶ExoⅢ对生成的具有双链结构的生物分子-Ag⁺结合物进行剪切，将Ag⁺从错配的碱基对C-Ag⁺-C中释放出来，循环回到溶液中，并与其他可识别Ag⁺的生物分子结合，从而释放出更多的罗丹明B，荧光信号得到显著增强；

(2)磁分离，取上清液，用二次水稀释至2.0mL进行荧光检测，检测条件：激发波长和发射波长分别为530、575nm。

图1为Ag⁺浓度的对数与荧光信号强度的线性关系图，结果表明，Ag⁺浓度在1.0×10^-13～8.0×10^-11mol/L时，荧光信号强度与Ag⁺浓度的对数呈现良好的线性关系，其线性方程为：FL＝354.1304+121.7803lgC_Ag ⁺(10^-13)，线性相关系数为0.9935。

本发明将核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术、纳米载体技术相结合，通过设计并合成可被Ag⁺识别的生物分子，并将其组装到纳米载体表面形成“孔帽”，利用C-C碱基错配与Ag⁺的特异性的识别反应，形成C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米载体表面，从而使封堵的“孔帽”被打开，纳米载体内的染料分子得以释放，为了进一步增大灵敏度，本发明又利用核酸外切酶对具有双链结构的生物分子-Ag⁺结合物的剪切作用实现了荧光信号的循环放大与检测。

本发明提出的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料具有结构简单、易合成、性能优异、稳定、经济、灵敏、高效等优点，并且不会受到其它常见干扰物质如Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺等金属离子的影响，具有高的特异性和选择性，可用于微量样品中低含量乃至极低含量Ag⁺的高灵敏、高选择性检测，尤为重要的是，本发明提出的基于核酸外切酶循环放大技术与碱基错配识别技术的纳米金复合材料及其制备方法和检测技术具有巨大的医学应用潜力和广阔的应用前景，将在重大疾病的早期诊断与治疗、食品、生物医药、医学、环境等诸多领域发挥重要的作用。

序列表

<110> 青岛科技大学

<120> 一种检测银离子的方法

<141> 2018-08-13

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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