经改善的用于检测磷脂酶c的酶活力的方法及产品
阅读说明：本技术 经改善的用于检测磷脂酶c的酶活力的方法及产品 (Improved method and product for detecting enzymatic activity of phospholipase C ) 是由 潘思惠 顾思天 牛其文 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本申请提供了经改善的用于检测磷脂酶C的酶活力的方法以及用于检测磷脂酶C的酶活力的产品。使用本申请的方法或产品可以更精确地定量酶活力,检测成本低,便于高通量地进行筛选或检测,能够满足规模化工业生产的检测需求。(The present application provides improved methods for detecting enzymatic activity of phospholipase C and products for detecting enzymatic activity of phospholipase C. The method or the product can be used for more accurately quantifying the enzyme activity, has low detection cost, is convenient for high-throughput screening or detection, and can meet the detection requirement of large-scale industrial production.)
技术领域
本申请涉及磷脂酶C制剂领域，更具体而言，涉及经改善的用于检测磷脂酶C的酶活力的方法及相关产品以及提供磷脂酶C产品的方法。
背景技术
由油料制取得到的毛油通常含有一定量的胶质，主要以磷脂为主，它们的存在会严重影响成品油的品质。因此，在植物油精炼过程中进行脱胶显得尤为重要，脱胶也一直是精炼工艺发展的一个难题。和传统的化学脱胶方法相比，不断改良的酶法脱胶具有反应条件温和、适用性广、生产中节省酸碱化学品和能耗、污染物排放少、几乎不产生废水等优点，能有效提高精炼率，具有十分广阔的应用前景。
酶法脱胶常用酶包括磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)和磷脂酶C(PLC)，三种磷脂酶的作用位点如下所示。
其中X代表胆碱、乙醇胺、肌醇、丝氨酸、氢等。
PLA可以特异水解甘油磷脂Sn-1位或Sn-2位上的酯键，生成亲水性较好的溶血磷脂和游离脂肪酸。PLC能特异性水解甘油磷脂C3位上的甘油磷酸酯键，生成甘油二酯和有机磷酸酯(例如，磷酸胆碱、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸等)。PLC不能水解甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)和单甘酯(MAG)等中性油，因此使用PLC进行脱胶不会产生其它副产品，而其水解磷脂得到的甘油二酯可溶于油中，与TAG共同成为油脂的成分而无需再被除去，不对产品的检测指标产生不良影响，显著提高了油脂得率，有利于增加经济效益。
磷脂酶C可以按底物类型分为非特异性磷脂酶C、磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C和磷脂酸特异性磷脂酶C等等。磷脂酶C广泛存在于动植物和微生物中，动植物来源PLC一般位于细胞膜上，结构较为复杂，属于内源性磷脂酶C，难以分离。微生物来源的磷脂酶C结构一般较为简单，可从细菌或真菌中分离得到，包括但不限于产气荚膜梭菌、双酶梭菌、蜡样芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、链霉菌、伯克氏菌属、八丈岛链霉菌、白色念珠菌、酿酒酵母等等。
已报道的PLC酶活力检测方法有卵黄平板法、酸碱滴定法、浊度分析法、NPPC法、HPLC法、放射性同位素标记法、荧光标记法、化学发光检测法、分光光度法和无机定磷法等。
(1)卵黄平板法是通过PLC水解卵黄琼脂平板中的卵磷脂后在牛津杯周围形成乳白色晕圈的直径大小来判断酶活高低，只能用于PLC活性的定性检测，且影响乳白色晕圈大小的因素较多。
(2)酸碱滴定法利用PLC水解卵磷脂释放出酸性的磷酸胆碱与NaOH反应的特点，通过测定一定条件和一定时间内酶反应所消耗的氢氧化钠的量来计算酶活力，该方法反应时间短，但滴定误差大，操作繁琐，且不适合用来测定酸性PLC的酶活力。
(3)浊度分析法通过测定卵磷脂乳浊液在经PLC水解前后的浊度变化来反映酶活力的高低，该方法操作方便，但反应时间相对较长，且缺乏专一性。
(4)NPPC法以磷脂酰胆碱的结构类似物——对硝基磷酸胆碱(NPPC)作为PLC反应的底物，其经PLC水解产生的对硝基苯酚在410nm处有最大吸收值，可通过比色法计算酶活力，该方法操作便捷快速，但所用的合成底物NPPC价格昂贵，且NPPC法的测定结果并不能和实际的脱胶能力很好地对应起来。
(5)HPLC法是用HPLC对PLC水解亲水性磷脂的产物进行分离测定，该方法准确度高，但是对设备和实验人员的技术水平要求较高，且检测速度慢，因此在应用中受到局限。
(6)放射性同位素标记法是利用不同的放射性同位素来标记各种磷脂物质，采用闪烁计数仪测定同位素标记的PLC反应水解产物的量，从而计算出样品的酶活力大小。该法灵敏度高，测定结果准确可靠，专一性强，但对仪器设备要求较高，成本较高。
(7)荧光标记法、化学发光检测法采用的策略相似，分别利用荧光基团、发光基团等标记特殊的磷脂底物或类似物，经PLC水解后利用荧光检测或底片感光来检测产物，这两个方法特异性强，灵敏度和准确度高，但是底物合成成本较高，因此受到一定局限性。
(8)分光光度法策略和NPPC法类似，PLC特异性水解二辛酰基卵磷脂的硫代磷酸酯结构类似物后生成硫代甘油二酯，后者可与硫代甘油二酯发生成色反应，利用吸光度的变化即可定义酶活，该方法同样因底物合成困难、成本较高而受限制。
(9)钼蓝定磷法是将PLC水解磷脂底物生成的磷酸复合物用碱性磷酸酶进行水解，释放出无机磷酸根离子，后者在酸性条件下与钼酸盐形成的络合物经抗坏血酸还原后显蓝色，在680-800nm处有最大吸光值，从而计算PLC的酶活力。
钼蓝定磷法灵敏度较高，但涉及两种酶反应和显色反应，因此对反应条件和反应体系的要求较高。虽然已有不同的文献报道了利用磷钼蓝测定PLC酶活力的方法，但都存在一定缺陷。例如，在Markus与Uwe(A.Durban,Markus&Bornscheuer,Uwe.An improved assayfor the determination of phospholipase C activity[J].European Journal ofLipid Science and Technology,2007,109:469-473)和Krug等人(Edward L.Krug,NancyJ.Truesdale,Claudia Kent.A simplified assay for phospholipase C[J].AnalyticalBiochemistry,1979,97(1):43-47)分别报道的磷脂酶C活力测定方法中，将磷脂酶C和碱性磷酸酶同时加入到反应体系中进行反应。因为碱性磷酸酶的最佳作用pH范围通常为8～10，因此该方法会显著抑制酸性磷脂酶C的活力。而且，Krug等人(Edward L.Krug,NancyJ.Truesdale,Claudia Kent.A simplified assay for phospholipase C[J].AnalyticalBiochemistry,1979,97(1):43-47)报道的方法中选择EDTA来终止磷脂酶C的反应，但碱性磷酸酶通常需要锌和二价镁或钙离子激活，因此EDTA作为金属螯合剂也会抑制碱性磷酸酶活力。Markus与Uwe(A.Durban,Markus&Bornscheuer,Uwe.An improved assay for thedetermination of phospholipase C activity[J].European Journal of LipidScience and Technology,2007,109:469-473)的方法中采用的盐酸溶液显然也不适用于两步酶解法。
此外，对于磷钼蓝显色，虽然引入空白的样可以抵消离子等添加物对显色的影响，却不能抵消残余的磷脂底物的影响(空白样品的底物含量和实验样品的剩余底物含量不同)；在Krug等人(Edward L.Krug,Nancy J.Truesdale,Claudia Kent.A simplifiedassay for phospholipase C[J].Analytical Biochemistry,1979,97(1):43-47)和Hergenrother与Martin(Paul J.Hergenrother&Stephen F.Martin,Determination ofthe kinetic parameters for phospholipase C(Bacillus cereus)on differentphospholipid substrates using a chromogenic assay based on the quantitationof inorganic phosphate[J].Analytical Biochemistry,1997,251(1):45-49)的报道中，均采取在显色前添加SDS的方法来防止蛋白质沉淀干扰显色，却无法排除残余的磷脂底物的影响。
因此，仍然亟需能精确定量磷脂酶C的酶活力的检测方法。
发明内容
一方面，本申请提供了用于检测磷脂酶C的酶活力的方法，其包括如下步骤：
1)在反应体系中使磷脂酶C酶促水解磷脂；
2)向所述反应体系中添加Tris-HCl缓冲液，并随后添加与水不混溶的有机溶剂；
3)相分离后，使水相溶液与磷酸酶接触，然后在酸性条件下与钼酸或钼酸盐接触，并进一步与还原剂反应；
4)在600-810nm下测定吸光值，并利用磷钼蓝检测的标准曲线计算所述磷脂酶C的酶活力。
一方面，本申请提供了用于筛选表达磷脂酶C的菌株的方法，其包括如下步骤：
1)在反应体系中使所述磷脂酶C酶促水解磷脂；
2)向所述反应体系中添加Tris-HCl缓冲液，并随后添加与水不混溶的有机溶剂；
3)相分离后，使水相溶液与磷酸酶接触，然后在酸性条件下与钼酸或钼酸盐接触，并进一步与还原剂反应；
4)在600-810nm下测定吸光值。
另一方面，本申请提供了用于检测发酵液中磷脂酶C的酶活力的方法，其包括如下步骤：
1)在反应体系中使所述发酵液与磷脂接触以使所述磷脂酶C酶促水解磷脂；
2)向所述反应体系中添加Tris-HCl缓冲液，并随后添加与水不混溶的有机溶剂；
3)相分离后，使水相溶液与磷酸酶接触，然后在酸性条件下与钼酸或钼酸盐接触，并进一步与还原剂反应；
4)在600-810nm下测定吸光值，并利用磷钼蓝检测的标准曲线计算所述磷脂酶C的酶活力。
还一方面，本申请提供了用于检测磷脂酶C的酶活力的产品，其包括：包含磷脂的第一容器、包含Tris-HCl缓冲液的第二容器、包含与水不混溶的有机溶剂的第三容器、包含磷酸酶反应体系溶液的第四容器，和包含钼蓝显色反应物溶液的第五容器。
再一方面，本申请提供了一种提供磷脂酶C产品的方法，其包括使用上述方面所述的用于检测磷脂酶C的酶活力的方法或用于检测磷脂酶C的酶活力的产品来检测所述磷脂酶C的酶活力。
本申请的用于检测磷脂酶C的酶活力的方法可适用于多种磷脂作为磷脂酶C的底物，并且可以使不同类型的磷脂酶C在其最适宜的温度和pH下测定其酶活力。不受任何理论所束缚，本申请的检测方法使用Tris-HCl缓冲液作为终止试剂，其可以有效地抑制磷脂酶C的反应，并且不影响后续的磷酸酶的酶促水解反应。本申请的检测方法还使用与水不混溶的有机溶剂进行提取，从而排除了残余的磷脂底物对显色的干扰。本申请的检测方法能更加精确和稳定地检测磷脂酶C的酶活力，且操作简便，检测成本低，便于高通量地进行筛选和检测，能满足规模化工业生产的检测需求，具有非常重要的生产实践意义。
附图说明
图1显示了在不同的反应温度下的磷脂酶C的酶活力。
图2显示了在不同的反应pH下的磷脂酶C的酶活力。
图3显示了磷脂底物浓度对磷脂酶C的酶活力的影响。
图4显示了Triton x-100浓度对磷脂酶C的酶活力的影响。
图5显示了磷脂酶C蛋白浓度与吸光值之间的关系。
图6显示了磷脂底物对磷钼蓝显色的影响。
具体实施方式
本申请的发明人发现，使用磷脂酶C(例如含有磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、磷脂酰丝氨酸特异性磷脂酶C和/或磷脂酸特异性磷脂酶C的溶液，所述含有磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、磷脂酰丝氨酸特异性磷脂酶C和/或磷脂酸特异性磷脂酶C溶液包括但不限于：磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、磷脂酰丝氨酸特异性磷脂酶C和/或磷脂酸特异性磷脂酶C的发酵液、发酵上清、酶液等)酶促水解单一磷脂或复合磷脂，然后添加作为终止试剂的Tris-HCl缓冲液以有效地抑制磷脂酶C的反应，随后添加与水不混溶的有机溶剂进行萃取，将相分离后的水相溶液加入到磷酸酶反应体系中进行反应，再将反应液与钼酸或钼酸盐(包括但不限于钼酸铵、钼酸钠、钼酸钾)溶液在酸性条件下接触，并进一步经还原剂还原后在600-810nm下检测吸光值，能够更加精确和稳定地检测磷脂酶C的酶活力。本申请的检测方法可直接用于检测发酵液中磷脂酶C的酶活力，并可用于表达磷脂酶C的菌株的快速筛选或发酵条件的快速选择。
因此，一方面，本申请提供了用于检测磷脂酶C的酶活力的方法，其包括如下步骤：
1)在反应体系中使磷脂酶C酶促水解磷脂；
2)向所述反应体系中添加Tris-HCl缓冲液，并随后添加与水不混溶的有机溶剂；
3)相分离后，使水相溶液与磷酸酶接触，然后在酸性条件下与钼酸或钼酸盐接触，并进一步与还原剂反应；
4)在600-810nm下测定吸光值，并利用磷钼蓝检测的标准曲线计算所述磷脂酶C的酶活力。
另一方面，本申请提供了用于筛选表达磷脂酶C的菌株的方法，其包括如下步骤：
1)在反应体系中使所述磷脂酶C酶促水解磷脂；
2)向所述反应体系中添加Tris-HCl缓冲液，并随后添加与水不混溶的有机溶剂；
3)相分离后，使水相溶液与磷酸酶接触，然后在酸性条件下与钼酸或钼酸盐接触，并进一步与还原剂反应；
4)在600-810nm下测定吸光值。
再一方面，本申请提供了用于检测发酵液中磷脂酶C的酶活力的方法，其包括如下步骤：
1)在反应体系中使所述发酵液与磷脂接触并使所述磷脂酶C酶促水解磷脂；
2)向所述反应体系中添加Tris-HCl缓冲液，并随后添加与水不混溶的有机溶剂；
3)相分离后，使水相溶液与磷酸酶接触，然后在酸性条件下与钼酸或钼酸盐接触，并进一步与还原剂反应；
4)在600-810nm下测定吸光值，并利用磷钼蓝检测的标准曲线计算所述磷脂酶C的酶活力。
在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C包括但不限于磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、磷脂酰丝氨酸特异性磷脂酶C和/或磷脂酸特异性磷脂酶C。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C可以以其本身或其稀释液或其溶液的形式使用。
在本申请的一个实施方案中，所述发酵液可以以其本身或其稀释液的形式与磷脂接触。
在本申请的一个实施方案中，所述磷脂可以是磷脂本身或含有磷脂的液体，如磷脂的稀释液。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂可以是本领域中常用的单一磷脂或复合磷脂。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂可以是磷酸甘油脂，例如但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸等等。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂可以是来源于油料种子和谷物中的磷脂，如复合磷脂，其包括但不限于来源于大豆、花生、芝麻、蓖麻、玉米、棉籽、菜籽、葵花籽中的一种或多种的磷脂。
在本申请的一个实施方案中，除了磷脂酶C和磷脂底物之外，用于磷脂酶C酶促水解磷脂的反应体系(在下文中也称为“磷脂酶C反应体系”)还包含磷脂酶C反应所需的活性金属离子，如Ca2+和/或Zn2+，以及Triton x-100。
在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系的pH为4.0-6.0。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系的pH为4.4-5.8。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系的pH为4.4-4.8。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系的pH为4.8。
在本申请的一个实施方案中，可以根据本申请的公开内容或实际需要，使用本领域技术人员所熟知的缓冲液或pH调节剂将磷脂酶C反应体系的pH调节至4.0-6.0、4.4-5.8、4.4-4.8或4.8，只要该缓冲液和pH调节剂不影响磷脂酶C的反应和后续的磷酸酶的反应，且不干扰显色。例如，可以使用终浓度为25mM的NaAc-HAc缓冲液将磷脂酶C反应体系的pH调节至4.0-6.0、4.4-5.8、4.4-4.8或4.8。
在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的Ca2+浓度为0.2～15mM、2-5mM或5mM。
在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的Zn2+浓度为20～160μM或80μM。
在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的磷脂底物浓度为0.3％～6％(w/v)。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的磷脂底物浓度为0.5％～3％。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的磷脂底物浓度为0.8％～3％。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的磷脂底物浓度为1％。
在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的Triton x-100浓度为10mM～100mM。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的Triton x-100浓度为10mM～80mM。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的Triton x-100浓度为20mM～80mM或40mM～80mM。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的Triton x-100浓度为40mM。
在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的磷脂酶C在加入反应体系前的蛋白浓度为4.0～46.7μg/mL。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的磷脂酶C在加入反应体系前的蛋白浓度为4.8～46.7μg/mL或17.5～46.7μg/mL。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的磷脂酶C在加入反应体系前的蛋白浓度为4.8～30.0μg/mL。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系中的磷脂酶C在加入反应体系前的蛋白浓度为4.8μg/mL或30.0μg/mL。
在本申请的一个实施方案中，磷脂酶C酶促水解磷脂的反应温度为25℃-55℃。在本申请的一个实施方案中，磷脂酶C酶促水解磷脂的反应温度为30℃-50℃。在本申请的一个实施方案中，磷脂酶C酶促水解磷脂的反应温度为35℃-50℃。在本申请的一个实施方案中，磷脂酶C酶促水解磷脂的反应温度为35℃-45℃。在本申请的一个实施方案中，磷脂酶C酶促水解磷脂的反应温度为40℃。
在本申请的一个实施方案中，向磷脂酶C反应体系中添加0.15～1.0M且pH 8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液作为终止试剂。在本申请的一个实施方案中，向磷脂酶C反应体系中添加0.25～1.0M且pH 8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液作为终止试剂。在本申请的一个实施方案中，向磷脂酶C反应体系中添加0.25M且pH 9.0的Tris-HCl缓冲液作为终止试剂。
在本申请的一个实施方案中，在添加Tris-HCl缓冲液作为终止试剂之后，添加与水不混溶的有机溶剂进行萃取。在本申请的一个实施方案中，该与水不混溶的有机溶剂包括但不限于氯仿。
在本申请的一个实施方案中，在向磷脂酶C反应体系添加与水不混溶的有机溶剂如氯仿之后，可以任选地向该体系中添加异戊醇。
在本申请的一个实施方案中，所述水相溶液与磷酸酶接触的反应体系(下文称为磷酸酶反应体系)包含磷酸酶、Mg2+和缓冲液。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系包含磷酸酶、Ca2+和缓冲液。
在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的磷酸酶浓度为0.01U/μL～0.06U/μL。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的磷酸酶浓度为0.01U/μL～0.015U/μL。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的磷酸酶浓度为0.01U/μL或0.06U/μL。
在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的Mg2+浓度为2-20mM。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的Mg2+浓度为10mM。
在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的Ca2+浓度为2-20mM。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的Ca2+浓度为10mM。
在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系的缓冲液为40-100mM Tris-HCl(pH 8.0-9.0)。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系的缓冲液为40-50mMTris-HCl(pH 8.0-9.0)。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系的缓冲液为50mM Tris-HCl(pH 9.0)。
在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系包含0.01-0.015U/μL磷酸酶、2-20mM Mg2+和40-100mM Tris-HCl(pH 8.0-9.0)。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系包含0.01-0.015U/μL磷酸酶、2-20mM Ca2+和40-100mM Tris-HCl(pH 8.0-9.0)。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系包含50mM Tris-HCl(pH 9.0)、10mM MgCl2和0.01U/μL碱性磷酸酶。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系包含50mMTris-HCl(pH 9.0)、10mM MgCl2和0.015U/μL碱性磷酸酶。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系包含50mM Tris-HCl(pH 9.0)、10mM Mg2+和0.06U/μL碱性磷酸酶。
在本申请的一个实施方案中，相分离后的水相溶液与磷酸酶在30℃-45℃下接触至少30min。在本申请的一个实施方案中，所述水相溶液与磷酸酶在35℃-42℃下接触。在本申请的一个实施方案中，所述水相溶液与磷酸酶在37℃-40℃下接触。在本申请的一个实施方案中，所述水相溶液与磷酸酶在如下温度下接触：30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃。在本申请的一个实施方案中，所述水相溶液与磷酸酶在37℃下接触。
在本申请的一个实施方案中，相分离后的水相溶液与磷酸酶接触0.5h-2h。在本申请的一个实施方案中，所述水相溶液与磷酸酶接触0.5h或1h。
在本申请的一个实施方案中，所使用的钼酸盐包括但不限于钼酸铵、钼酸钠、钼酸钾中的一种或多种。在本申请的一个实施方案中，所使用的钼酸盐为钼酸铵。
在本申请的一个实施方案中，使用的钼酸盐的浓度为2-3％(w/v)或2.4-2.6％(w/v)。在本申请的一个实施方案中，使用的钼酸盐的浓度为2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3.0％(w/v)。在本申请的一个实施方案中，使用的钼酸盐的浓度为2.5％(w/v)。在本申请的一个实施方案中，使用浓度为2.5％(w/v)的钼酸铵。
在本申请的一个实施方案中，使用的还原剂例如为抗坏血酸、氯化亚锡或苯酚。本领域的技术人员可以根据本申请的公开内容或实际需要，使用适当浓度的还原剂，例如适当浓度的抗坏血酸、氯化亚锡或苯酚。在本申请的一个实施方案中，所述还原剂为8％-10％(w/v)抗坏血酸，1％-2％(w/v)氯化亚锡或0.5％-1％(w/v)苯酚。在本申请的一个实施方案中，所述还原剂为10％(w/v)的抗坏血酸。
在本申请的一个实施方案中，在600-810nm下检测吸光值。在本申请的一个实施方案中，在650-750nm下检测吸光值。在本申请的一个实施方案中，在600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm、740nm、750nm、760nm、770nm、780nm、790nm、800nm或810nm下检测吸光值。在本申请的一个实施方案中，在700nm下检测吸光值。
还一方面，本申请提供了用于检测磷脂酶C的酶活力的产品，其包括：包含磷脂的第一容器、包含Tris-HCl缓冲液的第二容器、包含与水不混溶的有机溶剂的第三容器、包含磷酸酶反应体系溶液的第四容器和包含钼蓝显色反应物溶液的第五容器。
在本申请的一个实施方案中，所述用于检测磷脂酶C的酶活力的产品还包括包含磷脂酶C反应体系溶液的第六容器。
在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系溶液包含磷脂酶C反应所需的活性金属离子，如Ca2+和/或Zn2+，以及Triton x-100。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系溶液的pH为4.0-6.0、4.4-5.8、4.4-4.8或4.8。在本申请的一个实施方案中，使用终浓度为25mM的NaAc-HAc缓冲液将所述磷脂酶C反应体系溶液的pH调节至4.0-6.0、4.4-5.8、4.4-4.8或4.8。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系溶液中的Ca2+浓度为0.2～15mM、2-5mM或5mM。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系溶液中的Zn2+浓度为20～160μM或80μM。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系溶液中的Triton x-100浓度为10mM～100mM、10mM～80mM、20mM～80mM或40mM。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂酶C反应体系溶液包含5mM的Ca2+、80μM的Zn2+和40mM的Triton x-100且pH值为4.8。
在本申请的一个实施方案中，所述第一容器中的磷脂可以是磷脂本身或含有磷脂的液体。在本申请的一个实施方案中，所述第一容器中的磷脂可以是本领域中常用的单一磷脂或复合磷脂。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂可以是磷酸甘油脂，例如但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸及磷脂酰肌醇等等。在本申请的一个实施方案中，所述磷脂可以是来源于油料种子和谷物中的磷脂，如复合磷脂，其包括但不限于来源于大豆、花生、芝麻、蓖麻、玉米、棉籽、菜籽、葵花籽中的一种或多种的磷脂。
在本申请的一个实施方案中，所述第一容器中的磷脂浓度为0.3％～6％(w/v)、0.5％～3％、0.8％～3％或1％。
在本申请的一个实施方案中，所述第二容器中的Tris-HCl缓冲液为0.15～1.0M且pH 8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液、或0.25～1.0M且pH 8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液、或0.25M且pH 9.0的Tris-HCl缓冲液。
在本申请的一个实施方案中，所述第三容器中的与水不混溶的有机溶剂包括但不限于氯仿。
在本申请的一个实施方案中，所述第四容器中的磷酸酶反应体系溶液包含磷酸酶、Tris-HCl缓冲液和Mg2+或Ca2+。在本申请的一个实施方案中，所述第四容器中的磷酸酶反应体系溶液中的磷酸酶浓度为0.01U/μL～0.06U/μL、0.01U/μL～0.015U/μL、0.01U/μL或0.06U/μL。在本申请的一个实施方案中，所述第四容器中的磷酸酶反应体系溶液中的Mg2+浓度为2-20mM或10mM。在本申请的一个实施方案中，所述第四容器中的磷酸酶反应体系溶液中的Ca2+浓度为2-20mM或10mM。在本申请的一个实施方案中，所述第四容器中的磷酸酶反应体系溶液中的Tris-HCl缓冲液为40-100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)、或40-50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)、或50mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)。
在本申请的一个实施方案中，所述第四容器中的磷酸酶反应体系溶液包含0.01-0.015U/μL磷酸酶、2-20mM Mg2+和40-100mM Tris-HCl(pH8.0-9.0)，或者包含0.01-0.015U/μL磷酸酶、2-20mM Ca2+和40-100mM Tris-HCl(pH 8.0-9.0)，或者包含50mM Tris-HCl(pH9.0)、10mM MgCl2和0.01U/μL碱性磷酸酶，或者包含50mM Tris-HCl(pH 9.0)、10mM Mg2+和0.06U/μL碱性磷酸酶，或者包含50mM Tris-HCl(pH 9.0)、10mM Mg2+和0.015U/μL碱性磷酸酶。
在本申请的一个实施方案中，所述第五容器中的钼蓝显色反应物溶液包含钼酸或钼酸盐。在本申请的一个实施方案中，所述钼酸盐为钼酸铵、钼酸钠和钼酸钾中的一种或多种。在本申请的一个实施方案中，所述钼蓝显色反应物溶液包含2-3％(w/v)、2.4-2.6％(w/v)或2.5％(w/v)的钼酸盐。在本申请的一个实施方案中，所述钼蓝显色反应物溶液包含2.5％(w/v)的钼酸铵。
在本申请的一个实施方案中，所述用于检测磷脂酶C的酶活力的产品为试剂盒形式。
在本申请的一个实施方案中，所述用于检测磷脂酶C的酶活力的产品中包括：
包含磷脂的第一容器，其中所述磷脂例如为单一磷脂或复合磷脂且浓度例如为1％(w/v)。
包含Tris-HCl缓冲液的第二容器，其中所述Tris-HCl缓冲液例如为0.25M且pH9.0的Tris-HCl缓冲液；
包含与水不混溶的有机溶剂的第三容器，其中所述与水不混溶的有机溶剂例如为氯仿；
包含磷酸酶反应体系溶液的第四容器，其中所述磷酸酶反应体系溶液例如包含50mM Tris-HCl(pH 9.0)、10mM Mg2+和0.06U/μL碱性磷酸酶；
包含钼蓝显色反应物溶液的第五容器，其中所述钼蓝显色反应物溶液例如包含2.5％(w/v)的钼酸铵；以及
包含磷脂酶C反应体系溶液的第六容器，其中所述磷脂酶C反应体系溶液例如包含5mM的Ca2+、80μM的Zn2+和40mM的Triton x-100且pH值为4.8。
在本申请的一个实施方案中，第四容器中的磷酸酶反应体系溶液包含的磷酸酶可以与稳定所述磷酸酶的溶液一起作为磷酸酶储存体系溶液单独储存在第七容器中。在本申请的一个实施方案中，稳定所述磷酸酶的溶液包含200-500mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)和10-50mM MgCl2。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶储存体系溶液包含50-75U/mL或50-300U/mL的碱性磷酸酶。在本申请的一个实施方案中，所述磷酸酶储存体系溶液包含200-500mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)、10-50mM MgCl2和50-75U/mL或50-300U/mL的碱性磷酸酶。
再一方面，本申请提供了一种提供磷脂酶C产品的方法，其包括使用上述方面所述的用于检测磷脂酶C的酶活力的方法或用于检测磷脂酶C的酶活力的产品来检测所述磷脂酶C的酶活力。在本申请的一个实施方案中，所述提供磷脂酶C产品的方法还包括选自稀释、振荡、静置、离心、分装、比色中的一个或多个步骤。
在使用本申请的用于检测磷脂酶C的酶活力的产品时，还需要加入钼蓝显色反应所需的还原剂。为更好地使用还原剂，通常需要新鲜配制。因此，大多数情况下由使用者自制，也可以在所述产品中包括还原剂。在使用本申请的产品的一个实施方案中，所述还原剂为8％-10％(w/v)抗坏血酸、1％-2％氯化亚锡或0.5％-1％苯酚。在使用本申请的产品的一个实施方案中，所述还原剂为10％(w/v)抗坏血酸。
通过示例性说明而不是通过限制提供以下实施例。
实施例
在本申请的下述实施例中，磷脂酶是来源于蜡样芽胞杆菌的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C，由实验室构建的毕赤酵母重组菌发酵表达以及购自帝斯曼公司；碱性磷酸酶购自Takara或NEB公司。
制备例.磷钼蓝检测的标准曲线的制定和磷脂酶C的酶活力的测定
1.1磷钼蓝检测的标准曲线的制定
从1mg/mL PO4 3-的KH2PO4溶液中分别取出0、1、2、4、5、6、7、8μL，加入去离子水补足至940μL，再加入20μL的10％(w/v)抗坏血酸溶液，混匀后加入40μL的2.5％(w/v)钼酸铵溶液，最终的PO4 3-浓度为0、1、2、4、5、6、7、8μg/mL。每个浓度点平行做3个重复样品。50℃水浴20min后，在700nm下测定吸光值A700，对得到的数据进行线性拟合，即得到磷钼蓝检测的标准曲线。
1.2磷脂酶C的酶活力的测定
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为0.5％～3％(w/v)、Triton x-100浓度为40～80mM、Ca2+浓度为0.2～15mM、以及Zn2+浓度20～160μM，并用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至磷脂酶C的最佳反应pH，如pH 4.8，其中磷脂酶C的添加体积为20μL(在加入反应体系前，磷脂酶C的蛋白浓度为17.5～46.7μg/mL)，并将水浴锅温度调至合适的温度，如40℃。反应5min后加入100μL的0.25～1.0M且pH 8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液，再加500μL氯仿震匀30s，加10μL异戊醇静置几分钟后进行离心，取上清液进行下一步反应。空白对照采用水代替灭活的酶。
取80μL上清液，加入20μL的含有Mg2+和过量的碱性磷酸酶的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.0～9.0)，于37℃下反应1h以上，加入840μL的去离子水，再加入20μL的10％(w/v)的抗坏血酸，以及40μL的2.5％(w/v)钼酸铵溶液，50℃水浴显色20min后测定在700nm下测定吸光值A700。结合所制得的磷钼蓝检测的标准曲线，计算磷脂酶C的酶活力值。
磷脂酶C的酶活力的计算
酶活力计算公式为：
(1)标准曲线：y＝a*x(y：700nm的吸光值A700；x：PO4 3-的浓度(μg/mL)；a：回归系数)
(2)每一个样品显色后得到一个吸光值A700：
磷脂酶C的酶活力＝(A/a)×1/95/0.08×0.5/5/0.02×磷脂酶C的稀释倍数(μmol/min/mL)
备注：
(A/a)：每一个样品测到的PO4 3-的浓度(μg/mL)；
1：显色时总体积为1mL；
95：PO4 3-的摩尔质量是95μg/μmoL；
0.08：从磷脂酶C反应中取出的0.08mL去做下一步反应，后面测得所有PO4 3-来自这个体积；
0.5：第一步磷脂酶C反应后的水相总体积为0.5mL；
5：磷脂酶C反应的时间，min；
0.02：加入到第一步反应中的酶液体积为0.02mL。
实施例1
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为1％，Triton x-100浓度为40mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.8，磷脂酶C添加体积为20μL(在添加到反应体系之前，酶液用10mM、pH 5.6的NaAc-HAc缓冲液稀释至蛋白浓度为30μg/mL)，在35～50℃的水浴锅中反应5min后加入100μL终止试剂(0.25M、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液)，再加500μL氯仿震匀30s，加10μL异戊醇静置几分钟后离心取上清进行下一步反应。空白采用水代替灭活的酶。
取80μL上清液，加入20μL的含有50mM Mg2+和0.3U/μL碱性磷酸酶的Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)，于37℃下反应1h，加入840μL的去离子水，再加入20μL的10％(w/v)的抗坏血酸，及40μL的2.5％(w/v)钼酸铵溶液，50℃水浴显色20min后测定A700。结合磷钼蓝检测的标准曲线，计算酶活力值。不同反应温度下磷脂酶C的酶活力大小如图1所示。可见在35～45℃下磷脂酶C具有较高的酶活力。
实施例2
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为1％，Triton x-100浓度为40mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.4～5.8，磷脂酶C添加体积为20μL(在添加到反应体系之前，蛋白浓度为30μg/mL)，在40℃的水浴锅中反应5min后加入100μL终止试剂(0.25M、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液)，再加500μL氯仿震匀30s，加10μL异戊醇静置几分钟后离心取上清进行下一步反应。空白采用水代替灭活的酶。
后续处理同实施例1中所述的后续处理。不同反应pH下磷脂酶C的酶活力大小如图2所示。可见在pH 4.4～4.8条件下磷脂酶C有较高的酶活力。
实施例3
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为0.5％～3％，Triton x-100浓度为40mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.8，磷脂酶C添加体积为20μL(在添加到反应体系之前，蛋白浓度为30μg/mL)，在40℃的水浴锅中反应5min后加入100μL终止试剂(0.25M、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液)，再加500μL氯仿震匀30s，加10μL异戊醇静置几分钟后离心取上清进行下一步反应。空白采用水代替灭活的酶。
后续处理同实施例1中所述的后续处理。不同底物浓度下磷脂酶C相对酶活力大小如图3所示。可见底物浓度在0.8％～3％时磷脂酶C的酶活力较高。
实施例4
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为1％，Triton x-100浓度为10～80mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.8，磷脂酶C添加体积为20μL(在添加到反应体系之前，蛋白浓度为30μg/mL)，在40℃的水浴锅中反应5min后加入100μL终止试剂(0.25M、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液)，再加500μL氯仿震匀30s，加10μL异戊醇静置几分钟后离心取上清进行下一步反应。空白采用水代替灭活的酶。
后续处理同实施例1中所述的后续处理。不同Triton x-100浓度下磷脂酶C相对酶活力大小如图4所示。可见Triton x-100浓度为20～80mM时磷脂酶C的酶活力较高。
实施例5
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为1％，Triton x-100浓度为40mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.8，磷脂酶C添加体积为20μL(在添加到反应体系之前，蛋白浓度为17.5～46.7μg/mL)，在40℃的水浴锅中反应5min后加入100μL终止试剂(0.25M、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液)，再加500μL氯仿震匀30s，加10μL异戊醇静置几分钟后离心取上清进行下一步反应。空白采用水代替灭活的酶。
后续处理同实施例1中所述的后续处理。不同磷脂酶C蛋白浓度下测得样品在700nm处的吸光值如图5所示。可见该方法下磷脂酶C的蛋白浓度和样品吸光值之间有很好的线性关系。
实施例6
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为1％，Triton x-100浓度为40mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.8，磷脂酶C添加体积为20μL(在添加到反应体系之前，酶液蛋白浓度为30μg/mL)，在40℃的水浴锅中反应5min后加入100μL终止试剂(0.05～5M、pH 8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液)，静置0或15min，再加500μL氯仿震匀30s，加10μL异戊醇静置几分钟后离心取上清进行下一步反应。空白采用水代替灭活的酶。
后续处理同实施例1中所述的后续处理。不同浓度和pH的终止试剂对应的样品酶活力测定结果如表1所示。其中每种终止试剂对应的静置时间为0的样品酶活力为100％，静置15min的样品相对酶活力增加量小于5％认为磷脂酶C反应被有效终止。
表1不同浓度和pH的Tris-HCl溶液终止磷脂酶C反应的效果
由表1中可见，在一定浓度和pH值范围内的Tris-HCl缓冲液可有效地终止磷脂酶C的反应。
实施例7
400μL的体系中，磷脂底物浓度为1％，Triton x-100浓度为40mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.8，添加20μL去离子水，在40℃的水浴锅中静置5min后加入100μL终止试剂(0.25、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液)震匀，取80μL与碱性磷酸酶反应并显色(方法同实施例1中所述的后续处理)。结果显示，样品在700nm处的吸光值达0.4143，且呈蓝绿色，而不含磷脂底物的对照组则基本不显色，如图6所示。由此可见，在显色前排除残余的磷脂底物的干扰具有重要影响。
实施例8
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为1％，Triton x-100浓度为40mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.8，磷脂酶C添加体积为20μL(在添加到反应体系之前，酶液稀释5000倍至浓度为4.8μg/mL)，在40℃的水浴锅中反应5min后加入400μL氯仿震匀30s，再加10μL异戊醇，静置0、15、60min后离心取上清进行下一步反应。空白采用水代替灭活的酶。后续处理同实施例1中所述的后续处理。不同样品酶活测定结果如表2所示，其中静置时间为0的样品酶活力为100％，静置15min的样品相对酶活力增加量小于5％认为磷脂酶C反应被有效终止。
表2通过氯仿萃取终止磷脂酶C反应的效果
由表2可见，仅通过添加氯仿以萃取残余的磷脂底物的方式不能有效地终止磷脂酶C的反应。
实施例9
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为1％，Triton x-100浓度为40mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.8，磷脂酶C添加体积为20μL(在添加到反应体系之前，酶液稀释5000倍至浓度为4.8μg/mL)，在40℃的水浴锅中反应5min后加入400μL无水乙醇，静置0、15、60min后添加800μL氯仿震匀30s，再加10μL异戊醇，稍作静置后离心取上清进行下一步反应。空白采用水代替灭活的酶。后续处理同实施例1中所述的后续处理。不同样品酶活测定结果如表3所示。其中静置时间为0的样品酶活力为100％，静置15min的样品相对酶活力增加量小于5％认为磷脂酶C反应被有效终止。
表3乙醇终止磷脂酶C反应的效果
由表3可见，通过添加乙醇也不能有效地终止磷脂酶C的反应，而且如果增加乙醇的终浓度，则可能会影响后续的碱性磷酸酶的反应。
实施例10
在400μL的磷脂酶C反应体系中，磷脂底物浓度为1％，Triton x-100浓度为40mM，Ca2+浓度为5mM，Zn2+浓度80μM，用终浓度为25mM的NaAc-HAc调节pH至4.8，磷脂酶C添加体积为20μL(在添加到反应体系之前，酶液稀释800倍至浓度为30μg/mL)，在40℃的水浴锅中反应5min后加入100μL终止试剂(表4中所示的不同浓度和pH范围的Gly-NaOH缓冲液)，静置0或15min，再加500μL氯仿震匀30s，加10μL异戊醇静置几分钟后离心取上清进行下一步反应。空白采用水代替灭活的酶。
后续处理同实施例1中所述的后续处理。不同浓度和pH的终止试剂对应的样品酶活力测定结果如表4所示。其中每种终止试剂对应的静置时间为0的样品酶活力为100％，静置15min的样品相对酶活力增加量小于5％认为磷脂酶C反应被有效终止。
表4不同浓度和pH的Gly-NaOH溶液终止磷脂酶C反应的效果
由表4可见，即使采用与实施例6中所述的相同pH和浓度(pH 9，0.25M)，Gly-NaOH也不能有效终止磷脂酶C的反应。如果增加Gly-NaOH的浓度和pH值，则可能影响后续的碱性磷酸酶的酶活力。
实施例11
实验组：参照对比文件CN201310430394.X的两相反应体系，在200μL的磷脂酶C两相反应体系中，含有终浓度为0.5％(w/v)的磷脂，25mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM CaCl2。磷脂酶C分别稀释至43.6μg/mL和21.8μg/mL后各添加20μL至反应体系中，在37℃，150rpm条件下反应15min后，进行离心，条件为12000rpm下2min。空白采用水代替灭活的酶。离心后在上层清液中添加25μL Tris-HCl(250mM,pH 9.0)。
对照组：在200μL的磷脂酶C两相反应体系中，含有终浓度为0.5％(w/v)的磷脂，25mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM CaCl2。磷脂酶C分别稀释至43.6μg/mL和21.8μg/mL后各添加20μL至反应体系中，在37℃，150rpm条件下反应15min后，在上层清液中添加25μL Tris-HCl(250mM,pH 9.0)，然后在12000rpm下离心2min。空白采用水代替灭活的酶。
吸取离心后的上清80μL于100μL的碱性磷酸酶反应体系中，该体系还有50mM的Tris-HCl(pH 9.0)，10mM MgCl2，20U/mL的碱性磷酸酶。37℃下水浴反应30min。后续显色处理同实施例1中所述的后续处理。对照组和实验组的样品酶活力测定结果如表5所示。其中每个磷脂酶C蛋白浓度下对照组的样品的相对酶活力为100％，实验组对应的样品酶活力比对照组大于10％，则认为实验组中在离心分离过程中磷脂酶C依然在反应，不能更精确地测定酶活力。
表5两相反应体系在相分离过程中反应未终止的验证实验
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并非用以限定本申请的实质技术内容范围，本申请的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本申请的上述内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。