一种脂肪酶试剂盒及其制备方法
阅读说明：本技术 一种脂肪酶试剂盒及其制备方法 (Lipase kit and preparation method thereof ) 是由 黄益峰 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种脂肪酶试剂盒及其制备方法,包括试剂R1、试剂R2和试剂R3,所述试剂R1包括下述原料：80～120mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；3.0～5.0mmol/l牛磺脱氧胆酸；0.05-0.08mmol/l苯丁酸；450～550KU/l共脂肪酶；10-15mmol/l氯化钙；2.0-3.0mmol/l脱氧胆酸；所述试剂R2包括下述原料：80～120mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；0.5～1.0mmol/l表面活性剂；0.2～0.8mmol/蛋白变性剂；2.0-3.0mmol/l乙醚；所述试剂R3包括下述原料：80～120mmol/l酒石酸缓冲液(pH为7.0)；0.15～0.35mmol/l6-甲基试卤灵酯；3.0～5.0mmol/l牛磺脱氧胆酸。提供一种持续性灵敏度高,检测精度高,反应一段时间后,能够持续维持脂肪酶的活性,提高了后阶段的反应准确度。(The invention relates to a lipase kit and a preparation method thereof, wherein the lipase kit comprises a reagent R1, a reagent R2 and a reagent R3, and the reagent R1 comprises the following raw materials: 80-120 mmol/l tartaric acid buffer solution (pH 7.0); 3.0-5.0 mmol/l taurodeoxycholic acid; 0.05-0.08mmol/l phenylbutyric acid; 450-550 KU/l colipase; 10-15mmol/l calcium chloride; 2.0-3.0mmol/l deoxycholic acid; the reagent R2 comprises the following raw materials: 80-120 mmol/l tartaric acid buffer solution (pH 7.0); 0.5 to 1.0mmol/l surfactant; 0.2-0.8 mmol/protein denaturant; 2.0-3.0mmol/l diethyl ether; the reagent R3 comprises the following raw materials: 80-120 mmol/l tartaric acid buffer solution (pH 7.0); 0.15-0.35 mmol/l 6-methyl resorufin ester; 3.0-5.0 mmol/l taurodeoxycholic acid. The method has high continuous sensitivity and high detection precision, can continuously maintain the activity of the lipase after reacting for a period of time, and improves the reaction accuracy of the later stage.)
技术领域：
本发明涉及一种医疗检测试剂的技术领域，具体地说，涉及一种脂肪酶试剂盒及其制备方法。
背景技术：
脂肪酶(lipase，Lip)又称三酰甘油水解酶，是能水解长链脂肪酸三酰甘油的一类酶的总称。人体脂肪酶的主要合成部位在胰腺腺泡，此类脂肪酶又称胰脂肪酶，是血清脂肪酶的主要来源。另外，一些消化器官如胃、十二指肠、食道以及白细胞、脂肪组织、肺、血管内皮也可分泌少量脂肪酶，并进入血液。血清脂肪酶活性测定可用于胰腺疾病诊断，特别是在急性胰腺炎。急性胰腺炎患者与非急性胰腺炎患者及正常人血清脂肪酶水平差异较大，脂肪酶与淀粉酶相比，在急性胰腺炎的诊断上具有更好的敏感性和特异性。
现有脂肪酶的检测常使用脂肪酶试剂盒，例如申请号为CN201811635803.9的发明专利公开了一种脂肪酶检测试剂盒及生产工艺，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，试剂R1包括如下成分：试剂R2包括如下成分：该脂肪酶检测试剂盒即开即用。脂肪酶的原理是：1,2-邻-二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸(6’-甲基试卤灵)酯在脂肪酶的作用下水解生成1,2-邻-二月桂基-消旋-甘油和戊二酸(6’-甲基试卤灵)酯。其中戊二酸(6’-甲基试卤灵)酯在脂肪酶的进一步作用下水解生成戊二酸和甲基试卤灵，甲基试卤灵在溶液中呈现出红色。在波长570nm处检测红色的甲基试卤灵生成速率，该生成速率和样本中的脂肪酶活性成正比，通过计算得出样品中的脂肪酶活性。
但是在上述技术方案中，因为检测脂肪酶活性是持续一段时间的，因此在酶解底物一段时间后，由于反应物的生产，会造成酶解反应速度减慢，所以颜色加深程度趋缓，设置在后阶段观察不到反应颜色变化，吸光度改变不明显，因此后面测量数据参考意义小。
发明内容
：本发明要解决的技术问题是，提供一种持续性灵敏度高，检测精度高，反应一段时间后，能够持续维持脂肪酶的活性，提高了后阶段的反应准确度。
为解决上述技术问题，本发明采用这样一种脂肪酶试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，其特征在于，所述试剂R1包括下述原料：
80～120mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
3.0～5.0mmol/l牛磺脱氧胆酸；
0.05-0.08mmol/l苯丁酸；
450～550KU/l共脂肪酶；
10-15mmol/l氯化钙；
2.0-3.0mmol/l脱氧胆酸；
所述试剂R2包括下述原料：
80～120mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
0.5～1.0mmol/l表面活性剂；
0.2～0.8mmol/蛋白变性剂；
2.0-3.0mmol/l***；
所述试剂R3包括下述原料：
80～120mmol/l酒石酸缓冲液(pH为7.0)；
0.15～0.35mmol/l6-甲基试卤灵酯；
3.0～5.0mmol/l牛磺脱氧胆酸。
采用上述技术方案：苯丁酸能够保持脂肪酶细胞的活性，反应一段时间后，能够持续维持脂肪酶的活性，提高了后阶段的反应准确度；此外苯丁酸又能够去除减少蛋白，因为蛋白会对底物造成影响，除去后能够增强试剂的稳定性，并且有利于提高测试结果的准确度；戊二酸能够大量溶解在***中，设置***组分，一方面使得产生大量的戊二酸被吸收，减少反应的生成物从而促进反应快速继续进行，单位时间内吸光度差别明显提升，另一方面产生的戊二酸与脂肪酶之间是竞争性抑制剂，通过减少戊二酸与脂肪酶的接触，避免与底物竞争脂肪酶上的结合位点，从而实现脂肪酶与底物结合反应；由此也能够实现脂肪酶的活性与底物之间持续位点结合，持续酶解反应，提高了后阶段的反应准确度。
作为优选，所述试剂R1包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
3.4mmol/l牛磺脱氧胆酸；
0.06mmol/l苯丁酸；
500KU/l共脂肪酶；
12mmol/l氯化钙；
2.6mmol/l脱氧胆酸；
所述试剂R2包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
0.8mmol/l表面活性剂；
0.6mmol/蛋白变性剂；
2.5mmol/l***；
所述试剂R3包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲液(pH为7.0)；
0.27mmol/l6-甲基试卤灵酯；
3.4mmol/l牛磺脱氧胆酸。
作为优选，所述蛋白变性剂为盐酸胍。
作为优选，所述表面活性剂为PEG 2000、PEG 6000或者PEG 8000。
作为优选，所述试剂R1、试剂R2和试剂R3的体积比为1:1:1。
为解决上述技术问题，本发明公开一种脂肪酶试剂盒的制备方法：它包括以下步骤：步骤S1，对试剂R1各组分进行称量，加入溶器中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；步骤S2，对试剂R2各组分进行称量，加入容器中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；步骤S3，对试剂R3各组分进行称量，加入容器中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；步骤S3，半成品检验；步骤S4，清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1、R2和R3；步骤S5，包装，成品检验，入库存储。
作为优选，所述步骤S2中，先将表面活性剂、蛋白变性剂和***混合搅拌，再在体系内加入酒石酸缓冲液。
作为优选，先将表面活性剂、蛋白变性剂和***混合搅拌过程中，进行加热10min，加热的温度为40-50摄氏度，加热完毕后静置至室温。
作为优选，在体系内加入酒石酸缓冲液时分多次加入。
本发明与现有技术中相比，具有如下优点：氯化钙是酶反应加速剂，可以激活酶的活性，并且提供反应所需的离子环境，同时能够增加试剂中盐离子效应。PEG 2000、PEG6000或者PEG 8000属于表面活性剂，具有较强的乳化作用，提高各种原料的增融性和稳定性，试剂的开瓶稳定性和长期存储稳定性较好。牛黄脱氧胆酸钠在反应中起稳定剂和加速剂的作用，加速脂酶反应，保证反应的高效进行。共脂肪酶是反应中所需要的反应的催化酶。盐酸胍是蛋白变性剂，去除杂蛋白对底物的影响，增强试剂的稳定性，并且有利于提升测试结果的准确度。1,2-邻-二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸(6’-甲基试卤灵)酯是6’-甲基试卤灵反应底物，主要是用来生成甲基试卤灵，是比色法中的色原。
具体实施方式
：
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一、试剂组分包括如下：所述试剂R1包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
3.4mmol/l牛磺脱氧胆酸；
0.06mmol/l苯丁酸；
500KU/l共脂肪酶；
12mmol/l氯化钙；
2.6mmol/l脱氧胆酸；
所述试剂R2包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
0.8mmol/l PEG 2000；
0.6mmol/盐酸胍；
2.5mmol/l***；
所述试剂R3包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲液(pH为7.0)；
0.27mmol/l6-甲基试卤灵酯；
3.4mmol/l牛磺脱氧胆酸。
制备方法如下：步骤S1，对试剂R1各组分进行称量，加入溶器中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；步骤S2，对试剂R2各组分进行称量，加入容器中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；步骤S3，对试剂R3各组分进行称量，加入容器中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；步骤S3，半成品检验；步骤S4，清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1、R2和R3；步骤S5，包装，成品检验，入库存储。所述步骤S2中，先将盐酸胍、PEG 2000和***混合搅拌，再在体系内加入酒石酸缓冲液。先将盐酸胍、PEG 2000和***混合搅拌过程中，进行加热10min，加热的温度为40-50摄氏度，加热完毕后静置至室温。在体系内加入酒石酸缓冲液时分三次加入。
实施例二、试剂组分包括如下：所述试剂R1包括下述原料：
120mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
3.0mmol/l牛磺脱氧胆酸；
0.08mmol/l苯丁酸；
450KU/l共脂肪酶；
10mmol/l氯化钙；
3.0mmol/l脱氧胆酸；
所述试剂R2包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
0.8mmol/l PEG 6000；
0.2mmol/盐酸胍；
3.0mmol/l***；
所述试剂R3包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲液(pH为7.0)；
0.27mmol/l6-甲基试卤灵酯；
3.4mmol/l牛磺脱氧胆酸。制备方法与实施例一相同。
实施例三、试剂组分包括如下：所述试剂R1包括下述原料：
80mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
5.0mmol/l牛磺脱氧胆酸；
0.05mmol/l苯丁酸；
450KU/l共脂肪酶；
15mmol/l氯化钙；
2.0mmol/l脱氧胆酸；
所述试剂R2包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲溶液(pH为7.0)；
0.5mmol/l PEG 6000；
0.8mmol/盐酸胍；
2.0mmol/l***；
所述试剂R3包括下述原料：
100mmol/l酒石酸缓冲液(pH为7.0)；
0.35mmol/l6-甲基试卤灵酯；
5.0mmol/l牛磺脱氧胆酸。制备方法与实施例一相同。
对比例一、与实施例三的不同之处在于，所述试剂R1包括0.05mmol/l苯甲酸；其余均相同。制备方法与实施例三相同。
对比例二、与实施例二的不同之处在于，所述试剂R1包括0.05mmol/l异丁酸；其余均相同。制备方法与实施例二相同。
实施例四、与实施例二的不同之处在于，所述试剂R2包括0.8mmol/脲；其余均相同。制备方法与实施例一相同。
实施例五、与实施例一的不同之处在于，所述试剂R2包括0.5mmol/l十二烷基苯磺酸钠；其余均相同。制备方法与实施例一相同。
对比例三、与实施例一的不同之处在于，所述试剂R2包括2.0mmol/l甲醚；其余均相同。制备方法与实施例一相同。
实施例六、与实施例一的不同之处在于，所述步骤S2中，将盐酸胍、PEG 2000和***以及加入酒石酸缓冲液混合搅拌。其余均相同。试剂组分和含量与实施例一相同。
对比例四、与实施例一的不同之处在于，所述步骤S2中，先将盐酸胍、PEG 2000和***混合搅拌过程中，进行加热10min，加热的温度为80摄氏度，加热完毕后静置至室温。在体系内加入酒石酸缓冲液时分三次加入；其余均相同。试剂组分和含量与实施例一相同。
本发明的脂肪酶检测试剂盒检测其稳定性的测定方法如下：
选取日立7060全自动生化分析仪，主波长设置为570nm，副波长设置为700nm，采用速率法。加入样本、校准液或质控品3μl，之后再加入试剂R1和R2试剂各100μl混匀，于37℃孵育3min～5min后加入100μl的试剂R3混匀，于37℃孵育100s，在测定波长下连续检测1min、2min、4min、6min、8min时各管吸光度变化，设定吸光度基础值为A，计算各管A+ΔA，其中ΔA为各管吸光度随时间的变化值。
