阅读说明：本技术 一种双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法及其应用 (Preparation method and application of two-photon deoxyribozyme metal organic framework probe ) 是由 孟红敏 石鑫鑫 吴亚楠 葛佳 李朝辉 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本方法涉及一种双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法及其应用。该方法首先将锌离子脱氧核酶的底物链上标记双光子荧光团,酶链上标记猝灭基团,得到双光子脱氧核酶探针TP-Zn-ES,再利用溶剂热法,以四氯化锆和对苯二甲酸为原料合成了载体-金属有机框架(Zr-MOF)。将双光子脱氧核酶探针TP-Zn-ES负载到Zr-MOF载体上,得到了TP-Zn-ES-MOF探针。该方法操作简单、绿色环保,开创了一种制备双光子脱氧核酶金属有机框架探针的新策略。本发明以锌离子为实例所制备的TP-Zn-ES-MOF探针可用于活细胞、凋亡细胞中锌离子的成像,在医学诊断和治疗领域展示出巨大的应用价值。(The method relates to a preparation method and application of a two-photon deoxyribozyme metal organic framework probe. The method comprises the steps of firstly marking a two-photon fluorophore on a substrate chain of the zinc ion deoxyribozyme, marking a quenching group on a polymerase chain to obtain a two-photon deoxyribozyme probe TP-Zn-ES, and then synthesizing a carrier-metal organic framework (Zr-MOF) by using zirconium tetrachloride and terephthalic acid as raw materials through a solvothermal method. And loading the two-photon deoxyribozyme probe TP-Zn-ES on a Zr-MOF carrier to obtain the TP-Zn-ES-MOF probe. The method is simple to operate, green and environment-friendly, and a new strategy for preparing the two-photon deoxyribozyme metal organic framework probe is created. The TP-Zn-ES-MOF probe prepared by taking the zinc ions as the example can be used for imaging the zinc ions in living cells and apoptotic cells, and has great application value in the fields of medical diagnosis and treatment.)

一种双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于纳米材料制造领域，涉及一种利用脱氧核酶的特异性识别能力、双光子荧光成像技术以及金属有机框架载体的制备和应用，具体涉及一种双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法及其应用。

背景技术

脱氧核酶是一类通过体外筛选得到的具有特异性识别功能的催化核酸，具备生物相容性，水溶性，低毒性以及易于合成和功能化等多种优点。其中，RNA裂解DNA酶作为目前最广泛使用的DNA酶，在生物分析和生物医学技术中具有重要意义。(Juewen Liu, ZehuiCao, and Yi Lu, Chem. Rev.2009, 109, 5, 1948-1998) 然而RNA裂解的脱氧核酶在细胞应用中存在缺陷：一方面由于带负电的脱氧核酶与细胞膜的亲和力差，脱氧核酶进入细胞的效率低。另一方面是脱氧核酶在进入细胞的过程中容易被核酸酶降解，这极大地降低了脱氧核酶在细胞内生物分析中的应用。(C. Yang, X. Yin, S. Y. Huan, L. Chen, X.X. Hu, M. Y. Xiong, K. Chen, X. B. Zhang, Anal. Chem. 20189053118-3123)。

荧光传感器作为在体外和体内监测生物分析物的强大工具。基于RNA裂解的DNA酶是一种有用的荧光探针，已用于检测活细胞中的生物分子并对其成像。但是，当前大多数基于RNA裂解的DNA酶都被单光子荧光团修饰，导致生物成像差，光漂白和自发荧光，极大地限制了其在细胞内的应用。相对而言，双光子（TP）荧光成像技术具有多种优势，例如深层组织穿透，低自发荧光背景和对生物样品的小损伤。

金属有机框架（MOF）作为一种新型纳米材料，在药物运输和生物成像等方面的应用备受关注。MOF具有很好的穿过细胞膜和保护核酸酶降解的优良性质。(W. M. W. E.Briley, E. Auyeung, M. D. Cabezas, C. A. Mirkin, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136,7261-7264)基于以上研究现状，构建出成像效果佳、穿透深度大、膜穿透能力强、生物稳定性高的双光子脱氧核酶金属有机框架纳米探针是非常有必要的。

锌作为生物体内重要的过渡金属之一，在各种生理过程中起着非常重要的作用，包括调节酶活性，凋亡，神经传递和基因表达(A. S. Nakashima, R. H. Dyck, BrainRes. Rev. 2009, 59, 347-373)。Zn²⁺的脱氧核酶对锌离子具有很强的特异性识别功能。将Zn²⁺脱氧核酶的特异性识别能力，双光子荧光成像技术所具有的光损伤小、光漂白效应弱、背景荧光干扰小、样本穿透深度大等优点与纳米MOF所具有的膜穿透能力强且能保护脱氧核酶免受核酶降解等优点相结合，构建出Zn²⁺的双光子脱氧核酶金属有机框架纳米探针（TP-Zn-ES-MOF）对细胞内Zn²⁺具有很强的特异性识别功能，实现对细胞内锌离子成像的作用。

发明内容

本发明为解决现有锌离子脱氧核酶成像效果及穿透深度不理想、膜穿透能力弱、生物稳定性差而难以用于复杂生物体系等问题，提出一种双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法及其应用，既可以应用于活细胞和凋亡细胞成像，该应用操作简单，对样本光损伤小，背景干扰小，灵敏度高，进入细胞效率高。

实现本发明的技术方案是：一种双光子脱氧核酶金属有机框架纳米探针（TP-Zn-ES-MOF）的制备方法，步骤如下：

一种双光子脱氧核酶金属有机框架探针（TP-Zn-ES-MOF），所述探针包括正八面体的Zr-MOF及Zr-MOF上负载的TP-Zn-ES双链，其中Zr-MOF的直径为201.6±3.8 nm、负载TP-Zn-ES双链的负载量为5.23×10¹⁵；TP-Zn-ES双链是底物链TP-Zn-S和酶链通过杂交制备的，TP-Zn-ES-MOF探针对锌离子的检测限为3.53 nM。

所述的双光子脱氧核酶金属有机框架探针的制备方法，步骤如下：

（1）通过DNA固相合成法将双光子荧光团TP标记到锌离子脱氧核酶底物链的5端，得到底物链TP-Zn-S；

（2）将步骤（1）中的底物链TP-Zn-S和3端标记有BHQ1的酶链混合至Tris缓冲溶液中，得双链混合物；

（3）将步骤（2）中的双链混合物加热至95℃，然后在冰上退火冷却，得到杂交的TP-Zn-ES双链；

（4）将步骤（3）得到的TP-Zn-ES双链和Zr-MOF悬浊液混合，在室温下孵育、振荡40-60分钟，得混合物；

（5）将步骤（4）得到的混合物离心后得到的沉淀，再用超纯水洗涤3次，将最终得到的沉淀为双光子脱氧核酶金属有机框架探针，即TP-Zn-ES-MOF探针。

所述步骤（1）中底物链TP-Zn-S的序列为5’-TP-ACTCACTAT/rA/GGA AGA GAT GGACGT GCG ACCAGGCCC-3’。

所述步骤（2）中底物链TP-Zn-S和酶链的摩尔比为1：2，酶链BHQ1-Zn-E的序列为5’-GGGCCTGGTCGCACGTCCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAG-BHQ-1-3’，Tris缓冲液为25 mMTris、50 mM MgCl₂、100 mM NaCl、pH 7.4。

所述步骤（4）中TP-Zn-ES双链的浓度为1μM，Zr-MOF悬浊液的浓度为1 mg/ mL，其中Zr-MOF的制备方法为，将16.8 mg的ZrCl₄和12 mg的1,4-苯二甲酸（H₂BDC）（99％）分别溶于4 mL DMF，加入到50 mL圆底***；再向圆底烧瓶中加入2mL DMF至总体积为12mL，在搅拌下将200mL冰醋酸滴加到上述混合物中，在油浴锅中加热至80℃反应12小时，在空气中冷却至室温时，将反应液离心，所得固体用乙醇重复洗涤3次，经真空干燥，得到白色固体粉末即为Zr-MOF。

所述的双光子脱氧核酶金属有机框架探针在活细胞或凋亡细胞成像中的应用。

在活细胞成像中的应用步骤为：

1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A；

2）将TP-Zn-ES-MOF探针加入到步骤1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养3 h，得到培养液B；

3）分离步骤2）得到的培养液B，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞后，加入摩尔比为1:2的锌离子和吡硫钠，孵育30 min；

4）用磷酸盐缓冲液冲洗经步骤3）处理的细胞，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液，用双光子激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。

在凋亡细胞成像中的应用步骤为：

a. 将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24h，得到培养液A；

b. 将250 μM的H₂O₂加入到步骤a得到的培养液A中，在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养3 h，得到培养液B；

c. 将TP-Zn-ES-MOF探针加入到步骤b得到的培养液B中，孵育3 h，得到培养液C；

d. 用磷酸盐缓冲液冲洗培养液C中的细胞，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液；再加入细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V- PI 5 μL，孵育15min后用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。

所述细胞为Hela细胞，共聚焦皿中细胞培养液由DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成。

所述TP-Zn-ES-MOF探针的终浓度为100 μg/mL。

本发明的有益效果是：

1、本发明将脱氧核酶的特异性识别能力，双光子荧光成像技术所具有的光损伤小、光漂白效应弱、背景荧光干扰小、样本穿透深度大等优点与纳米MOF所具有的膜穿透能力强且能保护脱氧核酶免受核酶降解等优点相结合，以锌离子为目标物，构建成像效果佳、穿透深度大、膜穿透能力强、生物稳定性高的双光子脱氧核酶金属有机框架纳米探针。

2、本发明首先将锌离子脱氧核酶的底物链上标记双光子（Two photo）荧光团，酶链上标记猝灭基团，得到双光子脱氧核酶探针TP-Zn-ES，再利用溶剂热法，以四氯化锆和对苯二甲酸为原料合成了载体-金属有机框架（Zr-MOF）；将双光子脱氧核酶探针TP-Zn-ES负载到Zr-MOF载体上，得到了TP-Zn-ES-MOF探针。本方法对脱氧核酶探针具有双光子标记的成像效果好、负载量高、免受核酸外切酶降解等优势，解决现有锌离子脱氧核酶在细胞成像中成像效果差、穿透深度不理想、膜穿透能力弱、生物稳定性差等问题，从而实现对活细胞和凋亡细胞内锌离子原位、高灵敏、高选择性双光子荧光成像，为疾病的早期诊断及相关病理的研究提供理论依据和新方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1 为TP-Zn-ES-MOF探针制备原理图。

图2为实施例1所制备双光子荧光团TP的合成路线。其中，探针5为双光子基团。

图3为实施例1 所制备锌离子双光子脱氧核酶探针TP-Zn-ES对锌离子的响应。

图4为实施例1 所制备Zr-MOF载体的扫描电镜图。

图5为实施例1所制备Zr-MOF载体和TP-Zn-ES-MOF探针的Zeta电位图。

图6为实施例1所制备的核酸外切酶λexo对双链TP-Zn-ES和TP-Zn-ES-MOF探针影响的单光子荧光发射谱图。

图7为实施例1所制备的TP-Zn-ES-MOF探针对锌离子的响应图。

图8为实施例1所制备的核酸外切酶λexo对双链TP-Zn-ES和TP-Zn-ES-MOF探针影响的电泳图。

图9为实施例1所制备的TP-Zn-ES-MOF探针在缓冲溶液中对锌离子响应的单光子荧光发射谱图。

图10为实施例1所制备的TP-Zn-ES-MOF探针在检测活细胞中锌离子的应用。

图11为实施例1制备的TP-Zn-ES-MOF探针在检测凋亡细胞中锌离子的应用及细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V- PI 染色图和叠加图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种双光子脱氧核酶金属有机框架纳米探针（TP-Zn-ES-MOF）的制备方法，其制备原理如图1所示：以Zr⁴⁺和H₂BDC为原料合成正八面体结构的MOF，再负载上锌离子的脱氧核酶双链TP-Zn-ES，其中底物链标记双光子荧光团TP、酶链上标记猝灭基团（BHQ1），得到锌离子的探针TP-Zn-ES-MOF。实验步骤如下：

通过DNA固相合成法将双光子荧光团TP（合成路线见附图2）标记到锌离子脱氧核酶底物链（Zn-S）的5端，得到TP-Zn-S；将TP荧光团标记的底物链（TP-Zn-S）和3端标记有BHQ1的酶链（BHQ1-Zn-E）（摩尔比为1:2）混合至Tris缓冲溶液（25 mM Tris，50 mM MgCl₂、100 mMNaCl，pH 7.4）中，加热至95℃反应10min，然后在冰上退火冷却5min，得到杂交的TP-Zn-ES双链对锌离子的响应见附图3，由于TP和BHQ1之间的荧光共振能量转移作用TP的荧光被猝灭，当加入目标物锌离子时，标记TP的底物链断裂并释放，从而使TP荧光恢复。

将16.8 mg的ZrCl₄和12 mg的1,4-苯二甲酸（H₂BDC）（99％）分别溶于4 mL DMF，加入到50 mL圆底***；再向圆底烧瓶中加入2mL DMF至总体积为12mL，在搅拌下将200mL冰醋酸滴加到上述混合物中，在油浴锅中加热至80℃反应12小时；当在空气中冷却至室温时，将反应液离心，所得固体用乙醇重复洗涤3次；将所得的白色固体在环境温度下真空干燥，得到白色固体粉末，其形貌见附图4：Zr-MOF的形貌为正八面体结构，直径为201.6±3.8nm。使用时将干燥的Zr-MOF分散在超纯水中，用超声仪超声至少2个小时。

将1μM TP-Zn-ES双链和1 mg/ mLZr-MOF悬浊液在室温下混合，在摇床中振荡孵育至少40分钟；将混合物离心后得到沉淀，再用超纯水洗涤3次；将最终的TP-Zn-ES-MOF探针重新分散在Tris缓冲液中，以便进一步使用。Zr-MOF和TP-Zn-ES-MOF探针的Zeta电位见附图5：Zr-MOF的电位为正，负载上TP-Zn-ES后变负，说明得到了探针TP-Zn-ES-MOF。核酸外切酶λexo对TP-Zn-ES双链和TP-Zn-ES-MOF探针影响的见附图6：单独的TP-Zn-ES双链（酶链上未标记猝灭基团）荧光，负载到MOF上后（其中TP-Zn-ES-MOF上未标记猝灭基团）荧光降低，由此计算出负载量。TP-Zn-ES-MOF探针对锌离子的响应见附图7：在相同λexo孵育处理后，TP-Zn-ES-MOF（②）的荧光强度恢复可忽略不计，而游离双链TP-Zn-ES（④）的荧光强度显着增加。证明MOF对双链TP-Zn-ES起到保护作用，可以防止核酸外切酶对DNA的降解。由图8可知：条带1和条带2分别是游离双链TP-Zn-ES和TP-Zn-ES-MOF探针，在相同λexo孵育处理后，TP-Zn-ES-MOF（条带4）的条带几乎无变化，而游离双链TP-Zn-ES（条带3）的条带几乎完全消失。证明MOF对双链TP-Zn-ES起到保护作用，可以防止核酸外切酶对DNA的降解。 由图9可知，加入锌离子浓度从0到20 μM越来越大时，TP-Zn-ES-MOF探针的荧光响应信号越来越高。

实施效果例：

本申请实施例1的双光子脱氧核酶金属有机框架探针（TP-Zn-ES-MOF）在活细胞成像中的应用，步骤如下：

将Hela细胞接种于含有培养液的（培养液由DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）共聚焦皿中，在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h；将100 μg/mL TP-Zn-ES-MOF探针加入到得到共聚焦皿中，在37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养3 h；去掉上述培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞后，再加入锌离子和吡硫钠（摩尔比为1:2），孵育30 min；去掉小皿中培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液；加入摩尔比为1:2的锌离子和吡硫钠，孵育30 min，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液。用波长为760 nm的双光子激光器照射，收取450-650nm范围内的荧光图像，对应为TP-Zn-ES-MOF探针染色区域。结果图片见附图10。

由图10可知，当外加锌离子的浓度从0,10,20,50μM, TP-Zn-ES-MOF探针的信号越来越强，说明该探针可用于检测活细胞中的锌离子。

本申请实施例1的光子脱氧核酶金属有机框架探针（TP-Zn-ES-MOF）在凋亡细胞成像中的应用，步骤如下：

将HeLa细胞接种于含有培养液的（培养液由DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）共聚焦皿中，在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h；加入250 μM H₂O₂，在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养3 h；去掉上述培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞后加入100 μg/mL TP-Zn-ES-MOF，孵育3 h；用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液；再加入细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V- PI 5 μL，孵育15min后用双光子激光共聚焦成像。用双光子激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。用波长为760 nm的双光子激光器照射，收取450-650nm范围内的荧光图像，对应为TP-Zn-ES-MOF探针染色区域。用波长为552的单光子激光器照射，收取570-700nm范围内的荧光图像，对应为细胞凋亡试剂盒PI染色区域。结果图片见附图11。

由图11可知，用H₂O₂处理使细胞凋亡同时刺激细胞产生内源性的锌离子，AnnexinV- PI使细胞核亮证明细胞凋亡，细胞质亮证明TP-Zn-ES-MOF探针可以检测凋亡细胞中的内源性锌离子。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。